将新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的耐热α-半乳糖苷酶基因经PCR扩增,以pET-28a为表达载体,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中进行表达,用0.8 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,采用超声波细胞破碎菌体得到α-半乳糖苷酶。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法获得α-半乳糖苷酶的分子质量约为35 ku。并对α-半乳糖苷酶的酶学性质进行研究,结果表明:该α-半乳糖苷酶的最适反应温度为85 ℃;最适反应pH值为5.0;在金属离子对酶活影响的研究中发现Al3+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Co2+对酶活起到促进作用,Cu2+、Fe2+、Ag2+、Mn2+、Ni2+的终浓度达到100 mmol/L时对酶活有较强的抑制作用;具有较好的热稳定性,在95 ℃处理38 h后仍具有50%的活性。
溶氧浓度对重组大肠杆菌的生长和外源蛋白的高效表达影响较大,为进一步增加菌体量和重组蛋白表达量,该研究采用DO-stat流加培养进行控制,分别研究了溶氧浓度20%、30%、35%和40%条件下大肠杆菌的生长情况以及海藻糖合成酶的表达情况。结果表明,当发酵罐中溶氧浓度控制在30%时,发酵40 h,菌体干质量可达53.9 g/L,是分批发酵时的6倍,海藻糖转化率达到80.9%,是分批发酵时的2.25倍。