白酒是世界著名的六大蒸馏酒之一[1]，白酒基础香型为清香型、酱香型、浓香型3种，在此基础上，又增加芝麻香型、兼香型、米香型、凤香型、老白干香型、馥郁香型、药香型、豉香型、特香型9种香型，共计12种香型[2-3]，白酒中各种微量成分占1%～2%，这些微量成分是白酒呈香呈味的关键，决定了白酒的品质[4-5]。白酒中微量成分主要分为6类，包括酯类、醇类、有机酸、芳香族化合物、醛类和酮类、呋喃和吡嗪类[6-8]。目前已发现的白酒风味物质达到了2 000多种[9-11]，每种香型白酒的风味物质各有差异，而骨架风味物质[12]作为对白酒典型性与品质起决定作用的风味成分，对其研究的需求更加迫切，12种香型白酒共涉及12项执行标准、35种风味化合物和10种主要风味成分[13-14]。
白酒通用分析检测方法为GB/T 10345—2022《白酒分析方法》，涉及12种风味物质，采用了5种检测方法。研究表明，白酒中风味物质的检测方法主要涉及气相色谱（gaschromatography，GC）法、离子色谱（ion chromatography，IC）法、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）联用法等，不同香型白酒中骨架风味物质检测分析的研究报道较少。对3种典型香型白酒中所含有的35种风味物质进行研究发现，其含量为0～2 600 mg/L[19-25]，以四川为代表的浓香型白酒为例，GB/T 10781.1—2021《白酒质量要求第1部分：浓香型白酒》对浓香型白酒质量要求中规定高度优级白酒己酸乙酯含量≥1.20 g/L，针对直接进样法，如此高的浓度已经超出了质谱的检测范围，因此同时检测白酒中骨架风味物质不适宜用气相色谱-质谱联用技术，但气质可以用作辅助定性定量的工具。
该研究采用气相色谱（GC）法建立了一种同时测定12种香型白酒中35种骨架风味物质的方法，分别考察色谱条件（色谱柱、载气流速、进样口温度及检测器温度）对化合物分离度的影响，并进行方法学考察。在此基础上，采用正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）对不同产地、香型白酒中差异性风味物质进行分析，以期为不同品牌、轮次、香型、年份酒体间风味差异分析提供技术参考和支撑，为提升整个白酒行业风味研究领域发展奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
采集市售白酒样品103批次，按产地划分四川96批次、云南6批次、黑龙江1批次；按香型划分浓香型66批次、清香型23批次、其他香型14批次。
21种乙酯类、醇类、芳香族类混标（100 μg/mL）、6种羧酸类混标（100 μg/mL）、乙醛、异戊醛、丁二酮、3-羟基丁酮、苯甲醛、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-乙酰基呋喃对照品（纯度均≥95%）、乙酸正戊酯（纯度99.9%）：阿尔塔科技有限公司；叔戊醇（纯度98.7%）：美国CATO公司；2-乙基丁酸（纯度99.7%）：北京曼哈格生物科技有限公司；无水乙醇（色谱纯）：天津四友精细化学品有限公司。
1.2 仪器与设备
XSE105电子天平：梅特勒托利多科技（中国）有限公司；Agilent HP-INNOWAX色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）、Agilent8890气相色谱（GC）仪：安捷伦科技（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
体积分数50%乙醇溶液：量取50 mL无水乙醇，加入50 mL水，充分混匀。
8种单标储备溶液配制：分别准确称取乙醛、异戊醛、丁二酮、3-羟基丁酮、苯甲醛、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-乙酰基呋喃对照品100 mg于10 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容，分别配制成质量浓度为10 mg/mL的单标溶液。
35种风味成分混合标准溶液：分别准确吸取21种乙酯类&醇类&芳香族类混标480 μL、6种羧酸类混标480 μL、8种单标储备溶液各5 μL置于进样小瓶中，涡旋混匀。
内标溶液的配制：准确称取叔戊醇、2-乙基丁酸、乙酸正戊酯50 mg于10 mL容量瓶中，以50%体积分数乙醇溶液定容，摇匀，得到质量浓度为5 mg/mL的混合内标溶液，备用。各内标定量测定组分见表1。
表1 内标定量测定组分
Table 1 Determination of components by internal standard quantification
内标 测定组分叔戊醇乙酸正戊酯2-乙基丁酸正丙醇、异戊醇、异丁醇、正己醇、正丁醇、异戊醛、丁二酮、乙醛乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸二乙酯、庚二酸二乙酯、辛二酸二乙酯、壬二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-乙酰基呋喃、乙醛乙酸、己酸、丙酸、丁酸、戊酸、庚酸、苯乙酮、β-苯乙醇、苯甲醛
1.3.2 白酒样品中骨架风味物质的测定
采用气相色谱法测定白酒样品中挥发性风味成分。白酒预处理：准确吸取白酒样品1 mL，加0.01 mL混合内标溶液（5 mg/mL），混匀，供气相色谱仪测定。
GC条件：HP-INNOWAX色谱柱（60m×0.25mm×0.25μm）；载气为高纯氮气（N2）（纯度＞99.999%）；采用火焰离子检测器（flame ionization detector，FID）；程序升温为初始温度40 ℃，保持1 min，以2.0 ℃/min升至70 ℃，然后以4 ℃/min升至180℃，再以10 ℃/min升至210 ℃，保持10min，260 ℃保持5 min；进样口温度250 ℃；分流比20∶1，流速1.5 mL/min，检测器温度250 ℃。
定性定量方法：根据保留时间定性；采用内标法定量，通过测定待测组分与内标物峰面积之比，内标单点法定量计算出待测组分含量，其计算公式如下：
式中：Xi为样品中各成分含量，g/L；Ii为由标准曲线得到待测液中各成分浓度与对应内标物浓度的比值；ρi为各成分对应内标的质量浓度，μg/mL；1 000为单位换算系数。
1.3.3 检测条件优化
分别考察了不同长度两种型号色谱柱（CP-Wax 57CB（50 m×0.25 mm×0.20 μm）、HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm×0.25 μm））、流速（0.7 mL/min、1.3 mL/min、1.5 mL/min）、进样口温度及检测器温度（230 ℃、250 ℃、270 ℃）对35种骨架风味物质分离度的影响，分离度计算公式如下：
式中：R为分离度；t（R2）为相邻两个峰中后峰的保留时间，min；t（R1）为相邻两个峰中前峰的保留时间，min；W1和W2为此相邻两峰的峰底宽。
1.3.4 方法学考察
（1）标准曲线回归方程、线性关系、检出限及定量限
配制35种骨架风味成分的混标工作液，混标工作液质量浓度50 mg/L，使用采集方法进样，以目标物质量浓度与内标质量浓度比值（x）为横坐标，以目标物峰面积与内标峰面积比值（y）为纵坐标绘制标准曲线。以3倍信噪比（S/N）计算检出限，10倍信噪比（S/N）计算定量限。
（2）平均加标回收率
在规定范围内，过高的本底含量对检测结果影响较大，因此采用阴性基质加标的方式对方法准确度进行考察，选取3个不同质量浓度1.5 mg/L、7.5 mg/L、15 mg/L（1倍定量限、5倍定量限、10倍定量限）作为加标水平，分别平行测定6份样品，对方法的准确度进行考察。
（3）精密度、重复性、稳定性试验
精密度：配制质量浓度为15 mg/L的35种化合物混标溶液，测定各骨架风味成分含量，连续进样6次，以精密度试验结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示。
重复性：取同一供试品测定各骨架风味成分含量，平行测定6次，结果以重复性试验结果的相对标准偏差（RSD）表示。
稳定性：配制质量浓度为15 mg/L的35种化合物混标溶液，每隔12 h对其骨架风味成分含量，考察其在72 h内其结果随时间变化的大小，测定结果随时间变化越小，稳定性越高，用稳定性试验结果的相对标准偏差（RSD）表示。
2 结果与分析
2.1 检测条件优化
通过对比不同型号色谱柱CP-Wax57CB（50m×0.25mm×0.20 μm）和HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm×0.25 μm）检测结果发现，CP-Wax 57CB色谱柱分离色谱图中庚酸、己酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸有明显的拖尾现象导致峰展宽，丁酸和苯乙酮、2-乙基丁酸和苯乙酸乙酯、乙酸正戊酯和正丁醇、乙酸和2,3,5,6-四甲基吡嗪、丁二酮与乙醇多对化合物峰仍无法得到有效分离且包含内标化合物，其他化合物分离良好；HP-INNOWAX型号色谱柱分离色谱图中庚酸、己酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸拖尾展宽现象得到了很好的解决，其他物质峰形良好，35种目标化合物和3种内标化合物相邻色谱峰分离度均＞1.5，满足色谱法对化合物分离度的要求。因此，选取最佳色谱柱为HP-INNOWAX。
通过考察3个梯度载气流速（0.7 mL/min、1.3 mL/min、1.5 mL/min）发现，随着流速的增加，出峰时间整体前移，且两组较难分离的成分丁酸乙酯和正丙醇、苯甲酸乙酯和丁二酸二乙酯发现分离度逐渐增大，随着流速的增加，丁酸乙酯和正丙醇分离度分别为1.1、1.4、1.7，苯甲酸乙酯和丁二酸二乙酯分离度分别为1.1、1.3、1.6，流速0.7 mL/min和1.3 mL/min时分离度＜1.5，而流速达到1.5 mL/min，分离度均达到要求（＞1.5）且不影响其他化合物的分离度，因此，选取最佳载气流速为1.5 mL/min。
通过考察进样口温度、检测器温度（230 ℃、250 ℃、270 ℃）结果表明，随着进样口温度和检测器温度增加，化合物峰形重叠一致、分离度＞1.5，响应接近。为保证液体进样气化完全且达到需要的灵敏度，选取最佳进样口温度为250 ℃，最佳检测器温度为250 ℃。
2.2 标准曲线回归方程、线性关系、检出限及定量限
35种骨架风味物质的标准曲线回归方程、相关系数、检出限及定量限见表2。由表2可知，35种骨架风味成分线性范围为0～50 mg/L，相关系数R为0.998～1.000，表明线性关系良好，检出限为0.31～1.89mg/L，定量限为1.02～6.30mg/L。能满足35种骨架风味成分的检测分析要求。
表2 35种骨架风味物质的标准曲线回归方程、相关系数、检出限及定量限
Table 2 Standard curve regression equation, correlation coefficient, detection limits and quantification limits of 35 kinds of skeleton compounds
分类 序号 化合物 线性范围/（mg·L-1） 检出限/（mg·L-1） 定量限/（mg·L-1） 标准曲线回归方程 相关系数R酯类1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0醇类11 12 13 14 15 16乙酸乙酯丁酸乙酯戊酸乙酯己酸乙酯庚酸乙酯乳酸乙酯辛酸乙酯丁二酸二乙酯庚二酸二乙酯辛二酸二乙酯壬二酸二乙酯正丙醇异丁醇正丁醇异戊醇正己醇0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0.58 0.50 0.55 0.47 0.42 0.77 0.41 0.59 0.40 0.39 0.46 0.53 0.42 0.40 0.38 0.34 1.94 1.67 1.82 1.58 1.41 2.55 1.36 1.97 1.34 1.30 1.53 1.78 1.41 1.34 1.27 1.14 y=1.108 1x y=0.906 2x y=0.957 6x y=1.035 4x y=1.083 9x y=0.521 3x y=1.113 8x y=0.732 2x y=0.936 4x y=0.970 3x y=0.990 5x y=0.847 4x y=0.972 1x y=0.922 4x y=0.984 1x y=1.034 2x 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.998 0.999 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
续表
分类 序号 化合物 线性范围/（mg·L-1） 检出限/（mg·L-1） 定量限/（mg·L-1） 标准曲线回归方程 相关系数R酸类芳香族醛类和酮类呋喃和吡嗪类17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35乙酸丙酸丁酸戊酸己酸庚酸苯甲醛苯乙酮苯甲酸乙酯苯乙酸乙酯乙酸苯乙酯β-苯乙醇乙醛异戊醛丁二酮3-羟基丁酮2,3,5-三甲基吡嗪2,3,5,6-四甲基吡嗪2-乙酰基呋喃0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0～50 0.93 0.58 0.46 0.43 0.39 0.34 0.36 0.31 0.38 0.36 0.35 0.31 1.89 1.67 1.30 0.56 0.36 0.52 0.41 3.11 1.92 1.52 1.42 1.30 1.13 1.19 1.02 1.26 1.20 1.18 1.03 6.30 5.58 4.35 1.87 1.21 1.72 1.37 y=0.389 9x y=0.603 5x y=0.771 4x y=0.875 2x y=0.980 7x y=1.043 5x y=1.089 2x y=1.271 9x y=1.133 1x y=1.181 7x y=1.184 7x y=1.276 8x y=0.383 0x y=0.649 0x y=0.542 7x y=0.752 2x y=1.184 5x y=0.841 8x y=0.954 8x 1.000 1.000 1.000 1.000 0.999 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.999 0.998 1.000 1.000 0.998 1.000 1.000
2.3 方法的加标回收率试验
35种骨架风味成分的加标回收率试验结果见表3。由表3可知，35种骨架风味成分的平均加标回收率为80.2%～109.2%，说明本方法能满足35种骨架风味成分的检测准确度的要求。
表3 35种骨架风味物质的加标回收率试验检测结果
Table 3 Test results of recovery rates of 35 kinds of skeleton flavor substances
种类 序号 化合物 平均回收率/%加标量1.5 mg/L回收率%加标量7.5 mg/L加标量15 mg/L酯类1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0醇类11 12 13 14乙酸乙酯丁酸乙酯戊酸乙酯己酸乙酯庚酸乙酯乳酸乙酯辛酸乙酯丁二酸二乙酯庚二酸二乙酯辛二酸二乙酯壬二酸二乙酯正丙醇异丁醇正丁醇107.42 95.12 99.91 103.18 107.75 110.23 107.30 108.25 107.06 104.73 103.54 90.08 98.34 100.71 102.98 98.58 101.87 101.89 102.23 109.10 104.55 104.67 104.86 106.45 104.77 95.33 101.45 100.00 108.40 101.78 104.09 105.21 105.38 108.29 106.35 106.28 108.10 108.23 108.52 94.59 101.83 100.98 106.3 98.5 102.0 103.4 105.1 109.2 106.1 106.4 106.7 106.5 105.6 93.3 100.5 100.6
续表
种类 序号 化合物 平均回收率/%加标量1.5 mg/L回收率%加标量7.5 mg/L加标量15 mg/L酸类芳香族醛类和酮类呋喃和吡嗪类15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35异戊醇正己醇乙酸丙酸丁酸戊酸己酸庚酸苯甲醛苯乙酮苯甲酸乙酯苯乙酸乙酯乙酸苯乙酯β-苯乙醇乙醛异戊醛丁二酮3-羟基丁酮2,3,5-三甲基吡嗪2,3,5,6-四甲基吡嗪2-乙酰基呋喃100.25 98.61 82.19 98.47 100.24 99.38 97.60 101.71 105.99 110.49 109.41 106.63 107.60 104.13 87.70 101.62 85.92 99.42 105.26 102.14 106.28 100.17 100.56 75.05 89.39 98.16 99.06 100.86 102.85 109.98 106.12 106.36 104.76 104.90 108.62 82.95 91.87 80.66 98.77 103.04 105.88 102.26 102.37 101.58 83.30 97.87 101.52 103.22 101.02 102.55 107.48 109.95 106.50 104.99 107.10 107.70 82.03 93.39 80.64 100.68 103.59 107.17 102.67 100.9 100.3 80.2 95.2 100.0 100.6 99.8 102.4 107.8 108.9 107.4 105.5 106.5 106.8 84.2 95.6 82.4 99.6 104.0 105.1 103.7
2.4 精密度、重复性和稳定性试验
35种骨架风味物质的精密度、重复性和稳定性试验结果见表4。由表4可知，精密度试验结果的平均值为12.7～16.6 mg/L，精密度试验结果的RSD为0.3%～2.6%；重复性试验结果的平均值为12.0～16.1 mg/L，重复性试验结果的RSD为0.4%～4.8%；稳定性试验结果的平均值为12.9～19.0 mg/L，稳定性试验结果的RSD为0.3%～5.1%。结果表明该方法精密度、重复性和稳定性良好。
表4 35种骨架风味物质的精密度、重复性、稳定性试验检测结果
Table 4 Precision, repeatability and stability test results of 35 kinds of skeleton flavor substances
种类 序号 化合物酯类1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0醇类酸类芳香族醛类和酮类呋喃和吡嗪类11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35乙酸乙酯丁酸乙酯戊酸乙酯己酸乙酯庚酸乙酯乳酸乙酯辛酸乙酯丁二酸二乙酯庚二酸二乙酯辛二酸二乙酯壬二酸二乙酯正丙醇异丁醇正丁醇异戊醇正己醇乙酸丙酸丁酸戊酸己酸庚酸苯甲醛苯乙酮苯甲酸乙酯苯乙酸乙酯乙酸苯乙酯β-苯乙醇乙醛异戊醛丁二酮3-羟基丁酮2,3,5-三甲基吡嗪2,3,5,6-四甲基吡嗪2-乙酰基呋喃精密度试验平均值/（mg·L-1）RSD/% RSD/%重复性试验平均值/（mg·L-1）15.4 14.3 14.8 14.7 15.0 16.2 15.0 15.1 15.2 15.0 15.1 15.5 14.6 14.6 14.7 14.6 12.7 14.6 14.7 14.9 15.0 15.4 16.6 16.2 15.2 15.0 15.1 16.0 14.7 13.6 14.9 14.8 15.3 15.9 15.1 0.7 1.3 0.8 1.2 0.6 0.9 0.3 0.5 0.3 0.4 0.3 1.0 1.2 0.3 0.3 0.3 2.6 1.3 0.6 0.6 0.6 1.0 1.1 1.6 0.4 0.4 0.4 0.7 1.8 1.0 1.1 0.6 0.3 0.6 0.5 15.6 14.7 15.0 15.2 15.2 15.6 15.3 15.3 15.6 15.6 15.6 15.4 14.7 14.5 14.7 14.6 12.0 14.1 14.6 14.9 14.5 14.8 16.1 15.8 15.3 15.1 15.4 15.5 14.9 13.8 15.0 14.8 15.5 15.9 15.3 1.5 1.3 0.5 0.9 0.8 0.7 1.1 0.7 1.2 1.1 0.9 0.9 1.7 0.7 1.3 1.0 4.8 4.0 2.2 2.2 1.4 2.1 1.2 0.9 0.9 0.9 0.4 0.9 1.7 2.6 3.0 0.8 0.9 0.9 1.1稳定性试验平均值/（mg·L-1） RSD/%17.9 14.7 14.4 14.4 15.0 17.3 15.2 18.1 18.5 18.7 18.5 15.2 14.5 14.5 14.5 14.5 14.2 12.9 13.3 13.4 14.3 13.4 16.1 16.5 17.1 17.6 17.8 17.2 14.4 13.3 14.1 17.1 18.3 19.0 17.9 0.9 0.6 0.5 1.2 0.5 1.6 0.6 2.1 3.0 1.8 2.1 0.5 0.3 0.3 0.5 0.3 4.2 4.8 4.3 1.5 5.1 3.6 1.5 1.4 0.9 1.7 1.5 1.1 0.8 0.8 0.6 0.6 1.6 2.0 1.7
2.5 白酒样品中骨架风味物质的测定
采用正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）对103批次白酒样品中35种骨架风味物质检测结果进行差异化分析，结果见表5。
表5 不同香型和产地白酒中主要差异性风味物质
Table 5 Main differential flavor substances in Baijiu with different aroma types and origins
香型化合物VIP值产地化合物 VIP值己酸乙酯正丙醇乳酸乙酯己酸乙酸乙酯丁酸乙酯异戊醇乙酸异丁醇乙醛正丁醇丁酸3.32 2.05 1.97 1.92 1.45 1.42 1.38 1.20 1.00 0.86 0.76 0.66己酸乙酯己酸乳酸乙酯乙酸乙酯正丙醇乙酸正丁醇乙醛异戊醇正己醇异丁醇丁酸乙酯2.80 2.38 2.30 1.64 1.52 1.48 1.42 1.40 1.20 0.89 0.71 0.51
由表5可知，根据变量重要性投影（variableimportance in the projection，VIP）值发现，差异挥发性风味物质以己酸乙酯、正丙醇、己酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯等为代表。不同香型、产地白酒样品OPLS-DA结果见图1。
图1 不同香型（a）及不同产地（b）白酒样品的正交偏最小二乘法-判别分析结果
Fig.1 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis results of Baijiu samples from different flavor types (a) and different origin (b)
A为浓香型，B为清香型，C、D、E为其他香型。
由图1a可知，浓香型白酒在一、四象限，而清香型白酒主要在二、三象限，其他香型样本量较少不纳入此次统计，浓香型白酒与清香型白酒的35种骨架风味物质具有显著性差异可将浓香型白酒及清香型白酒进行区分；由图1b可知，因为产区主要为四川省内白酒，其他产区样品批次量较少，象限分散未能将不同产区的酒样进行区分。
3 结论
12种香型白酒中35种骨架风味物质最佳检测条件为HP-INNOWAX色谱柱（60 m×0.25mm×0.25 μm），载气流速1.5 mL/min、进样口温度250 ℃、检测器温度250 ℃。该方法检出限为0.31～1.89 mg/L，定量限为1.02～6.30 mg/L，相关性系数R为0.998～1.000，可以满足对骨架成分的准确定量分析；平均加标回收率为80.2%～109.2%，准确度良好；精密度试验结果RSD为0.3%～2.6%、重复性试验结果RSD为0.4%～4.8%，反映了测定方法中偶然误差较小，在相同条件下获得的一系列结果之间的一致性程度较高；稳定性试验结果RSD为0.3%～5.1%，稳定性良好。OPLS-DA分析表明，不同产地、香型白酒主要差异性风味物质为己酸乙酯、正丙醇等。该方法操作简便、快捷，可快速、同时对12种香型白酒中35种骨架风味化合物进行定量。本方法的建立对白酒品质的提升提供了强有力的技术支撑，助推白酒企业向品质化、优良有序化发展，引领与规范白酒产业创新。
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