世界上每年出产的葡萄有80%会用来酿酒,由此产生大量的酿酒副产物,如葡萄籽、皮、藤茎等,其含有大量有生物活性成分的多酚类化合物,如反式白藜芦醇、(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素等,这类物质具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌和抗诱原作用,而且对许多疾病如糖尿病、衰老、神经损伤有保护作用[1-2]。这些酚类化合物是植物在生物和非生物胁迫因素下通过莽草酸和醋酸-丙二酸生物合成途径产生的次生代谢产物[3]。因此,它们的化学结构是由一个或多个芳香环以不同构象组成的,包括从简单的分子如酚酸到复杂的聚合物结构如单宁,所以这些多酚类化合物的组成成分非常复杂[4-6]。然而不同品种的葡萄酿酒副产物以及同品种副产物的不同部位(籽、皮、茎)中的多酚种类及含量有很大区别,导致它们对人类健康的保健作用大小不一[7]。张灵敏等[8]对3种酿酒葡萄多酚含量及抗氧化活性进行分析,结果发现美乐多酚种类最多且含量均较高,赤霞珠总花色苷含量最高,康贝尔酚酸和黄酮类化合物含量较高,美乐多酚抗氧化性最强,赤霞珠最弱。毛建利等[9]研究了赤霞珠葡萄皮渣酚类物质的抗氧化性,结果说明酚类提取液体外抗氧化能力较强;李浡等[10]对酿酒葡萄加工废弃物中多酚含量和抗氧化性进行研究,结果表明葡萄梗中总酚的含量相对高于葡萄皮与葡萄籽,并具有良好的抗氧化性。这些研究对了解葡萄酿酒副产物中多酚含量和抗氧化能力有一定意义,但对于不同品种葡萄酿酒副产物中多酚的种类及其与抗氧化能力的关系研究甚少。
本研究以4种葡萄(玫瑰香、贵人香、赤霞珠、梅鹿辄)酿酒后副产物籽、皮、茎为原料,提取其中酚类物质,测定其总酚、总黄酮、单宁、白藜芦醇以及单体酚含量,并依据酚类物质对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)和2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]自由基的清除能力评价其体外抗氧化能力,旨在为葡萄酿酒副产物再利用提供科学依据。
葡萄酿酒副产物(籽、皮、茎):中法合营王朝葡萄酿酒有限公司;玫瑰香葡萄:天津汉沽产区;贵人香葡萄:天津蓟县产区;赤霞珠、梅鹿辄葡萄:宁夏贺兰山东麓产区;DPPH、ABTS、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid,Trolox)(均为分析)、芦丁(纯度>98%):福州飞净生物科技有限公司;福林酚(分析纯)、甲醇、甲酸(均为色谱纯):上海国药集团试剂有限公司;没食子酸、儿茶素、表儿茶素、白藜芦醇、咖啡酸、阿魏酸、对香豆酸(纯度均>98%):美国Sigma公司;纤维素酶(2 000 IU/g):北京鸿润宝顺科技有限公司。
UV1000紫外-可见光光度仪:长沙艾克赛普仪器仪表公司;1200型高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪:美国Agilent公司;WondaSilTM C18色谱柱(5 μm,250 mm×4.6 mm);SDZF-6210真空干燥箱:上海苏达实验仪器有限公司;XMTD-204恒温水浴锅:天津市欧诺仪器仪表有限公司;RE-52AA旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂。
1.3.1 酚类物质分析检测
(1)总酚测定
酚类化合物提取[11]:将4种葡萄酿酒后的葡萄籽、皮、茎在真空干燥箱中干燥至恒质量,粉碎后过60目筛。称取1 g粉末加入10 mL纤维素酶液处理(1%纤维素酶,酶解温度55 ℃、酶解时间1.5 h),过滤后加入体积分数60%乙醇,料液比1∶15(g∶mL),60 ℃提取2 h(超声功率160 W,时间20 min),过滤,离心取上清液,用0.45 μm膜过滤,得到4种酿酒葡萄的籽、皮、茎酚类化合物样品提取液。
总酚测定:采用福林酚法[12-13]。向比色管中分别加入0.10 g/L的没食子酸溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL,再加入2.0 mL福林酚试剂(质量浓度为1 mol/L),混合均匀后避光放置8 min,然后分别加入7.5%的碳酸钠溶液6.0 mL,定容至25 mL,室温下避光2 h后,在765 nm波长条件下测定吸光度值。以没食子酸质量浓度(x)为横坐标,吸光度值(y)为纵坐标绘制标准曲线,得到回归方程为:y=0.145 2x+0.000 9,相关系数R2=0.999 6,按照标准曲线回归方程计算样品提取液中总酚含量。
(2)总黄酮测定
总黄酮测定采用硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法[14]。向比色管中分别加入0.15 g/L的芦丁标准溶液0、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL,加蒸馏水补至6 mL,分别加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液反应6 min,再各加10%的硝酸铝溶液1 mL反应6 min。最后加入10 mL 4%氢氧化钠溶液,定容至25 mL,在510 nm波长条件下测定吸光度值。以芦丁质量浓度(x)为横坐标,吸光度值(y)为纵坐标绘制标准曲线,得到线性回归方程为:y=0.016 6x+0.002 4,相关系数R2=0.999 8,按照标准曲线回归方程计算样品提取液中总黄酮含量。
(3)单宁测定
单宁测定采用香草醛盐酸法[15]。精确移取0.1 g/L的儿茶素标准溶液0、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL,分别用体积分数为70%甲醇溶液定容至10 mL,各移取0.5 mL放入6只用铝铂纸包裹的试管中,加入4%的香草醛甲醇溶液3 mL和浓盐酸1.5 mL,20 ℃反应20 min,在510 nm波长条件下测定吸光度值。以儿茶素质量浓度(x)为横坐标,吸光度值(y)为纵坐标绘制标准曲线,得到线性回归方程为:y=0.036x+0.005 2,相关系数R2=0.996 0,按照标准曲线回归方程计算样品提取液中单宁含量。
(4)白藜芦醇测定
白藜芦醇测定采用HPLC法[16]。HPLC色谱条件:流动相为水-乙腈(75∶25,V/V),流速1 mL/min,运行时间25 min,进样量10 μL,柱温35 ℃,紫外检测器波长306 nm。分别测定质量浓度分别为0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、6.0 mg/L白藜芦醇标样的峰面积,以白藜芦醇质量浓度(x)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线,得到线性回归方程为:y=76.474x-9.434 9,相关系数R2=0.998 8,按照标准曲线回归方程计算样品提取液中的白藜芦醇含量。
(5)单体酚测定
采用HPLC分别测定没食子酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸六种单体酚的含量[11,17]。HPLC色谱条件:流动相为A(0.2%甲酸-水)、B(甲醇),流速1 mL/min,运行时间25 min,进样量20 μL,柱温30 ℃,紫外检测器波长280 nm,洗脱程序:0~10 min为10%~22%B,10~15 min为22%~25%B,15~40 min为25%~35%B,40~45 min为35%B。以没食子酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸质量浓度(x)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标绘制单体酚标准曲线,得到标准曲线回归方程见表1,按照标准曲线回归方程计算样品提取液中的以上六种单体酚含量。
表1 六种单体酚的标准曲线回归方程及相关系数
Table 1 Standard curve regression equation and correlation coefficient of 6 kinds of mono-phenols
单体酚 标准曲线回归方程 相关系数R2没食子酸儿茶素表儿茶素咖啡酸对香豆酸阿魏酸y=49.439x-321 y=16.98x-161.53 y=4.627 6x-46.851 y=60.233x-247.47 y=80.013x-179.47 y=41.236x-205.85 0.993 3 0.991 8 0.993 3 0.998 7 0.998 9 0.997 8
1.3.2 抗氧化能力测定
DPPH自由基清除能力测定参考TIAN J H等[18]的方法并稍作修改。样液用体积分数80%乙醇稀释10倍后移取0.1 mL稀释液加到3.9 mL DPPH甲醇溶液中,在避光条件下300r/min振荡反应30 min,在波长517 nm处测定吸光度值,对照以相同体积的乙醇代替样品,用Trolox作为标准物质,结果以μmol Trolox/g表示。
ABTS自由基清除能力测定参考FANG Z X等[19]的方法并稍作修改。2 mL 2.6 mmol/L 过硫酸钾与2 mL 7.4 mmol/L ABTS+混合均匀后,室温避光放置16 h,然后用无水乙醇稀释,使其在波长734 nm 处的吸光度值达到0.70±0.02。样液用体积分数80%乙醇稀释10倍后移取20 μL,加200 μL ABTS+,300 r/min 振荡反应10 min,然后在734 nm 处测定吸光度值,用Trolox作为标准物质,结果以μmol Trolox/g表示。
1.3.3 数据处理
采用Microsoft Excel 2010和SPSS 26.0进行数据处理,所有检测均进行3次重复实验,结果用“平均值±标准差”表示。
葡萄酿酒副产物提取物中总酚含量分析结果见图1。由图1可知,葡萄籽中的总酚含量最高,为20.25~49.50 mg/g;葡萄茎中次之,为12.75~14.87 mg/g;葡萄皮中最低,为2.84~8.46 mg/g。不同品种葡萄籽中总酚含量由高至低顺序为:玫瑰香>贵人香>梅鹿辄>赤霞珠,玫瑰香葡萄籽中总酚含量是赤霞珠的2.5倍左右,不同品种葡萄皮中总酚含量由高至低顺序为:玫瑰香>贵人香>赤霞珠>梅鹿辄,玫瑰香葡萄皮中总酚含量是梅鹿辄的3倍左右。贵人香、梅鹿辄和赤霞珠葡萄茎中总酚含量之间无显著差异(P>0.05),其均显著高于玫瑰香(P<0.05);不同品种间的总酚含量差异可能是很多原因造成的,其中最重要的因素是各品种的基因决定了多酚的生物合成。另外,栽培管理条件、气候和土壤等因素对葡萄籽中总酚含量影响很大[20]。
图1 葡萄酿酒副产物提取物中总酚含量比较
Fig.1 Comparison of total phenols contents in extracts from grape wine making by-products
不同小写字母表示不同品种同一部位总酚含量差异显著(P<0.05)。
下同。
黄酮类化合物是广泛存在于植物中的抗氧化活性成分之一,是具有苯并吡喃环结构的一类天然化合物的总称。葡萄酿酒副产物提取物中总黄酮含量分析结果见图2。
图2 酿酒葡萄副产物提取物中总黄酮含量比较
Fig.2 Comparison of total flavonoids contents in extracts from grape wine making by-products
由图2可知,葡萄籽中总黄酮含量最高,为11.01~30.03 mg/g;葡萄茎中次之,为3.07~6.16 mg/g;葡萄皮中最低,为0.95~5.47 mg/g。玫瑰香葡萄籽中的总黄酮含量为30.03 mg/g,显著高于其他品种(P<0.05),是赤霞珠葡萄籽中总黄酮含量的3倍左右。玫瑰香葡萄皮中总黄酮含量最高,为5.47 mg/g,是梅鹿辄总黄酮含量的5.5倍左右;玫瑰香葡萄茎中总黄酮含量最高,为6.16 mg/g,是赤霞珠总黄酮含量的2倍左右。两种白葡萄籽和皮总黄酮含量显著高于两种红葡萄籽和皮的总黄酮含量(P<0.05),主要是因为白葡萄酒酿造工艺中葡萄经过气囊压榨后皮和籽被分离,而红葡萄酒酿造工艺中皮和籽参与了浸渍与发酵,导致更多的多酚物质溶解于酒中[21]。
单宁主要是以黄烷-3-醇为基本单元,通过C4~C8或C4~C6共价键连接而成的多聚体。葡萄酿酒副产物提取物中单宁含量分析结果见图3。
图3 葡萄酿酒副产物提取物中单宁含量比较
Fig.3 Comparison of tannins contents in extracts from grape wine making by-products
由图3可知,葡萄籽中的单宁含量最高,为0.46~1.13mg/g;葡萄皮中次之,为0.14~0.58 mg/g;葡萄茎中最低,为0.14~0.43 mg/g。不同品种单宁含量由高至低顺序为:玫瑰香>贵人香>梅鹿辄>赤霞珠,贵人香葡萄皮中的单宁含量最高,为0.58 mg/g,两种白葡萄皮中单宁含量是两种红葡萄皮单宁含量的3倍左右,而两种白葡萄籽中单宁含量是两种红葡萄籽中单宁含量的两倍左右,说明葡萄浸渍和发酵过程中,皮中的单宁较籽中的更容易被溶解于酒中;葡萄茎中赤霞珠的单宁含量最高,为0.425 mg/g,且两种红葡萄茎的单宁含量显著高于白葡萄茎(P<0.05),这可能既与红白葡萄品种有关,也与宁夏地区的沙砾土和天津地区土壤的差别有一定关系。
白藜芦醇是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物,是植物体在胁迫条件下或遇到病原侵害时分泌的一种抗毒素,一般合成场所在葡萄皮和葡萄叶中,影响白藜芦醇合成的不确定因素很多,因此不同品种间或部位间有很大的差异性[22]。葡萄酿酒副产物提取物中白藜芦醇含量分析结果见图4。
图4 葡萄酿酒副产物提取物中白藜芦醇含量比较
Fig.4 Comparison of resveratrol contents in extracts from grape wine making by-products
由图4可知,葡萄茎中的白藜芦醇含量为1.185~1.974mg/g;葡萄籽中白藜芦醇含量次之,为0.036~0.195 mg/g;葡萄皮中最低,为0.022~0.074 mg/g。不同品种葡萄茎中白藜芦醇含量顺序为:玫瑰香>贵人香>梅鹿辄>赤霞珠。两种红葡萄皮和籽中的白藜芦醇含量显著低于两种白葡萄皮和籽中白藜芦醇含量(P<0.05),可能与红白葡萄酒发酵过程中是否浸渍有关,而两种红葡萄茎中白藜芦醇含量显著低于两种白葡萄茎中白藜芦醇含量(P<0.05),这可能与葡萄品种或产区的差异有关。
目前可知葡萄酿酒副产物中多酚类化合物主要有没食子酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸、对香豆酸等多种单体酚,不同葡萄品种和部位之间多酚种类及含量差异较大[23]。葡萄酿酒副产物提取物中单体酚含量分析结果见表2。
表2 葡萄酿酒副产物中6种单体酚含量比较
Table 2 Comparison of 6 kinds of mono-phenols contents in grape wine making by-products μg/g
品种 没食子酸 儿茶素 表儿茶素 咖啡酸 对香豆酸 阿魏酸玫瑰香贵人香籽皮茎籽皮茎44.43±1.35Aa 7.93±0.28Ac 12.51±0.46Db 36.82±1.03Ba 6.82±0.23Bc 18.42±0.64Ab 73.23±2.74Aa 41.08±1.49Bb 31.11±1.17Cc 44.52±1.35Ba 46.76±1.68Aa 32.72±1.03Cb 97.41±3.19Aa 32.46±1.41Bb 26.49±1.08Dc 57.29±2.41Ba 39.32±1.27Ab 31.48±1.36Cc 45.12±1.27Aa 7.28±0.32Ab 4.19±0.18Bc 41.78±2.03Ba 6.23±0.25Bb 5.05±0.19Ac 3.46±0.19Bb 4.28±0.22Aa ND 4.27±0.25Aa 2.62±0.08Cb ND 7.63±0.24Ab 5.42±0.25Ac 13.35±0.47Aa 6.78±0.28Bb 4.21±0.14Cc 11.7 8±0.36Ba
续表
注:不同大写字母表示不同品种相同部位葡萄副产物间差异性显著(P<0.05),不同小写字母表示相同品种不同部位葡萄副产物间差异性显著(P<0.05)。
“ND”表示未检出。
品种 没食子酸 儿茶素 表儿茶素 咖啡酸 对香豆酸 阿魏酸赤霞珠梅鹿辄籽皮茎籽皮茎17.43±0.41Da 3.04±0.09Dc 14.39±0.36Cb 29.89±1.35Ca 3.76±0.12Cc 16.18±0.51Bb 40.23±1.27Cb 18.67±0.63Cc 43.46±1.19Aa 43.74±1.57Ba 19.43±0.68Cc 40.27±1.52Bb 36.42±1.52Db 15.43±0.58Dc 42.92±2.11Ba 49.78±1.93Ca 18.61±0.73Cb 48.74±2.46Aa 17.31±0.62Da 4.76±0.23Cb 3.21±0.20Cc 22.78±0.82Ca 4.67±0.25Cb ND 2.81±0.11Cb 3.78±0.15Ba 2.69±0.10Ab 2.92±0.09Cb 3.65±0.21Ba 2.14±0.08Bc 5.76±0.26Ca 2.69±0.07Db ND 5.83±0.25Ca 4.91±0.21Bb 3.78±0.17Cc
由表2结合图1可知,4种不同品种副产物的籽、皮、茎中没食子酸含量均与其对应的总酚含量呈现出正相关性,进一步证明了2.1中的结果。由表2结合图3可知,儿茶素和表儿茶素含量均与单宁含量呈现出正相关性,主要因为儿茶素和表儿茶素等这类黄烷-3-醇化合物是缩合单宁的前体,经缩合后转化为缩合单宁,故它们之间的含量相关性较大;葡萄籽中咖啡酸含量(17.31~45.12 μg/g)显著高于葡萄皮(4.67~7.28 μg/g)和葡萄茎(0~5.05 μg/g)中含量(P<0.05),且玫瑰香和贵人香两种白葡萄籽中含量(45.12 μg/g,41.78 μg/g)显著高于梅鹿辄和赤霞珠等红葡萄籽中咖啡酸含量(22.78 μg/g,17.31 μg/g)(P<0.05),葡萄茎中咖啡酸含量最少,梅鹿辄葡萄茎中未检测出;四种副产物籽、皮、茎中的对香豆酸含量均较低(0~4.28 μg/g),玫瑰香和贵人香等白葡萄茎中均未检测出;玫瑰香和贵人香两种白葡萄茎中阿魏酸含量分别为13.35 μg/g、11.78 μg/g,明显高于籽和皮中的含量(4.21~7.63 μg/g),且高于梅鹿辄和赤霞珠两种红葡萄茎中的含量(0~3.78 μg/g);总之,4种副产物籽、皮、茎中玫瑰香葡萄籽中的没食子酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸含量均最高,玫瑰香葡萄茎中的阿魏酸含量最高,4种副产物籽、皮、茎中的对香豆酸含量均较低,这与葡萄的品种、种植的土壤、气候、种植技术等多方面因素有关。
葡萄酿酒副产物对DPPH和ABTS自由基清除能力见图5。由图5可知,葡萄酿酒副产物提取物中不同品种和部位之间的DPPH和ABTS自由基清除能力均差异显著(P<0.05),主要是因为不同品种和部位之间的多酚种类、含量和结构各不相同所致;其中玫瑰香葡萄籽对DPPH和ABTS自由基清除能力均最强,分别为164 μmol Trolox/g,294 μmol Trolox/g;不同品种之间的DPPH和ABTS自由基清除能力顺序均为:玫瑰香>贵人香>梅鹿辄>赤霞珠,不同部位之间的DPPH和ABTS自由基清除能力顺序均为:葡萄籽>葡萄茎>葡萄皮,因此不同品种副产物及其不同部位之间的抗氧化能力顺序依次为:玫瑰香>贵人香>梅鹿辄>赤霞珠,葡萄籽>葡萄茎>葡萄皮。这也说明了葡萄酒经过发酵后副产物中剩余一定的活性物质,尤其葡萄籽中残留的活性成分较多,故酿酒葡萄副产物是获取功能活性成分的重要资源[24]。
图5 葡萄酿酒副产物提取物对DPPH、ABTS自由基清除能力比较
Fig.5 Comparison of DPPH and ABTS radicals scavenging abilities of extractsfrom grape wine making by-products
葡萄酿酒副产物中的酚类含量与抗氧化能力的相关性见表3。
表3 葡萄酿酒副产物提取物的抗氧化性与其总酚、总黄酮、单宁、白黎芦醇含量的相关性
Table 3 Correlation of antioxidant activities and total phenols, total flavonoids, tannins, and resveratrol contents in extracts from grape wine making by-products
种类总酚总黄酮单宁白藜芦醇与DPPH自由基清除率的相关性回归方程与ABTS自由基清除率的相关性回归方程 相关系数R y=2.935x-0.042 7 y=5.234 8x+10.218 y=110.17x-1.028 5 y=-0.017 9x+60.588相关系数R 0.920 3 0.997 0 0.723 0 0.090 0 y=5.536 7x-6.508 2 y=9.823 x+13.258 y=207.61x-8.264 7 y=-0.037 2x+109.52 0.918 6 0.984 8 0.720 2 0.109 1
由表3可知,不同品种和部位的酚类提取物对DPPH和ABTS自由基清除能力与各自的总酚含量、总黄酮含量、单宁含量均呈正相关性,且与总黄酮含量的相关性最高,相关系数R分别为0.997 0和0.984 8,说明酿酒葡萄副产物中总黄酮含量越高,其抗氧化能力越强;而与白藜芦醇含量的相关系数R分别为0.090 0和0.109 1,几乎无相关性,这与其他研究者的部分报道相近[25],可能是由于副产物中白黎芦醇含量整体较低所致,也可能是由于白黎芦醇对脂质过氧化自由基的清除能力较强[11]。
白藜芦醇是植物遭到逆境刺激后体内产生的一种抗毒素,是葡萄中重要的次生代谢产物,其含量受到白藜芦醇合成酶(resveratrol synthase,RS)及其活性的影响[26]。本研究结果表明,葡萄茎中白藜芦醇含量明显高于籽和皮中的含量,可能的原因是葡萄茎中的RS或其活性高于籽和皮中;4种不同品种副产物中玫瑰香的酚类含量最高,可能是玫瑰香品种中多酚代谢通路中的关键酶活性高于其他品种,也可能由于玫瑰香葡萄生长在黏土土壤中,土壤中的某些有机质和微量元素被葡萄吸收后加速诱导了多酚代谢通路中的关键酶,增加了关键酶的合成。酿酒过程中葡萄副产物中的酚类虽然有部分损失或转移到葡萄酒中,但一部分酚类化合物还残留在籽、茎、皮中,并且具有一定的抗氧化活性能,可为后续葡萄酿酒副产物再开发利用提供科学依据。
以玫瑰香、贵人香、梅鹿辄、赤霞珠4种葡萄酿酒副产物中的籽、皮、茎为原料提取多酚,比较酚类化合物的种类、含量及其对DPPH和ABTS自由基的清除能力。结果表明,4种不同品种的葡萄酿酒副产物中,玫瑰香葡萄籽的总酚、总黄酮、单宁含量均最高,分别为49.5 mg/g、30.3 mg/g、1.13mg/g,玫瑰香葡萄茎的白藜芦醇含量最高,为1794μg/g,不同品种葡萄的总酚、总黄酮、单宁、白藜芦醇含量及对DPPH和ABTS自由基的清除能力顺序均为:玫瑰香>贵人香>梅鹿辄>赤霞珠,葡萄不同部位的总酚、总黄酮、单宁含量及对DPPH和ABTS自由基的清除能力顺序均为:葡萄籽>葡萄茎>葡萄皮,不同部位的白藜芦醇含量顺序为:葡萄茎>葡萄籽>葡萄皮,葡萄酿酒副产物中多酚的抗氧化能力与总黄酮含量的相关性最高,与白藜芦醇含量几乎无相关性。
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