黑涩石楠（Aronia melanocarpa）全称黑果腺肋花楸，又名不老莓、野樱莓，为蔷薇科花楸属灌木[1-2]。黑涩石楠的果实是一种味酸甜略涩的可食用浆果，其果实中富含多糖、有机酸和多酚类生物活性成分，其中多酚类物质具有较强的抗氧化、防衰老等功效，能有效调节人体免疫系统[3-9]。目前，黑涩石楠在食品加工行业中的应用主要集中于制作果汁和酿造果酒等[10]，关于黑色石楠中活性成分的研究多以多糖类[11]、花青素[12]为主，对多酚类物质的研究较少，具有很大挖掘空间。
黑涩石楠多酚常见的提取方法有溶剂浸提法[12-13]、超临界CO2流体萃取技术[14]、超声辅助提取法[15]、微波辅助提取法等[16]，其中，超声波提取法作为提取多酚的重要方法，通过空化效应和机械效应，打破物质的细胞壁，增加扩散系数，从而提高提取效率[17]。多酚类物质的主要测定方法有高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography，HPLC）法[18]、气相色谱（gas chromatography，GC）法[18]及超高效液相色谱-串联质谱（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法[18]，SHAKEEL I等[19]采用HPLC法从含羞草多酚中检测出没食子酸、绿原酸、表儿茶素、金丝桃苷、非瑟素、木犀草素、芦丁、苯三酚、芹菜素、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、柚皮素、阿魏酸和白杨素13种多酚成分；位路路等[20-22]建立了检测藤黄科植物树皮游离型总多酚的GC法；张维冰等[23-24]采用UPLC-MS/MS法鉴定出菊花中10种咖啡酰基奎宁酸类化合物和22种黄酮类化合物。
本试验以黑涩石楠为原料，基于超声波辅助法提取黑涩石楠中的总多酚，并以总多酚含量为响应值，采用单因素试验及响应面试验对提取工艺进行优化。通过测定黑涩石楠中多酚类物质对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2'-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（2,2'-hydrazine bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS+）自由基和超氧阴离子自由基（O2-·）的清除能力，评价黑涩石楠多酚的抗氧化能力，并采用HPLC法测定黑涩石楠多酚类提取物中原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、槲皮素的含量，以期为辽宁黑涩石楠的研究开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
黑涩石楠冻果：由大连黑果培育基地提供，冷冻保存。
1.1.2 试剂
没食子酸（纯度＞98%）：苏州麦克林科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津福晨化学试剂有限公司；无水碳酸钠、维生素C（vitamin C，VC）、硫酸亚铁、过硫化钾（均为分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；福林-酚试剂、DPPH、ABTS（均为分析纯）：福州飞净生物科技有限公司；水杨酸、盐酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；30%H2O2溶液（分析纯）：沈阳新兴试剂厂；槲皮素、新绿原酸、绿原酸、咖啡酸标准品（纯度均＞98%）：上海源叶生物科技有限公司；原儿茶酸（标准品）：成都德思特生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
1525型高效液相色谱仪（配2996型二极管阵列检测器）：美国Waters公司；RE-52C旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；AL-204电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HH-2型恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；F-120FR120型超声波清洗器：江深圳福洋科技集团有限公司；TU-1950型双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；0.45 μm型有机系微孔滤膜：山东浩中化工有限公司；DLSB-5L/25型低温冷却液循环泵：巩义市予华仪器有限责任公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
将黑涩石楠冻果放置常温解冻，使用料理机打浆，备用。
1.3.2 总多酚的提取
按照文献[25]的提取方法稍作修改，准确称取1.00 g黑涩石楠果浆倒入烧杯中，按照料液比1∶40（g∶mL），加入体积分数55%乙醇溶液，将烧杯密封。在提取温度45 ℃、超声频率120 kHz、超声功率700 W条件下提取90 min，冷却至室温后抽滤，使用旋转蒸发仪，在45 ℃下蒸发除去乙醇，将提取液用蒸馏水定容至100 mL，避光密封保存待测。
1.3.3 黑涩石楠总多酚提取工艺优化单因素试验
在1.3.2方法的基础上，采用单因素轮换法依次考察料液比（1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50）、乙醇体积分数（45%、50%、55%、60%、65%）、提取时间（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min）、提取温度（35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）和超声频率（0、40 kHz、80 kHz、120 kHz）对黑涩石楠总多酚提取的影响。
1.3.4 黑涩石楠总多酚提取工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，选取影响较大的乙醇体积分数（A）、提取时间（B）和提取温度（C）为考察因素，以黑涩石楠总多酚提取量（Y）为响应值，采用Design-Expert 10.0设计3因素3水平的响应面试验，试验因素与水平见表1。
表1 黑涩石楠总多酚提取工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction process optimization of total polyphenols from Aronia melanocarpa
因素A 乙醇体积分数/%B 提取时间/min C 提取温度/℃-1水平0 1 50 90 40 55 120 45 60 150 50
1.3.5 总多酚提取量的测定
参考稽威等[26]的测定方法并稍作修改，准确称取没食子酸10 mg于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，配制成0.1 mg/mL没食子酸标准溶液。分别移取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL没食子酸标准溶液置于10 mL容量瓶中，加入10%的福林-酚试剂5 mL，5 min后，加入4.00 mL 7.5%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至10 mL，摇匀。室温下避光显色反应60 min后，在波长200～800 nm范围内进行紫外可见光光谱扫描，在波长765 nm处测定没食子酸标准溶液吸光度值。以多酚质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：y=10.187x+0.001 1，R2=0.999 4，表明没食子酸质量浓度在0.02～0.10 mg/mL范围内线性良好。
准确移取5.00mL总多酚提取液，用蒸馏水定容至10mL。准确移取稀释液1.00 mL置于10 mL容量瓶中，加入10%的福林-酚试剂5 mL，5 min后，加入4.00 mL 7.5%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至10 mL，摇匀。室温下避光显色反应60 min后，在波长765nm处测定吸光度值，根据标准曲线回归方程计算总多酚质量浓度，进而计算总多酚提取量，其计算公式如下：
式中：C为提取液中总多酚质量浓度，mg/mL；V1为提取液定容的体积，mL；N为稀释的倍数；m为样品的质量，g。
1.3.6 抗氧化能力的测定
DPPH·清除能力的测定：参照文献[27]的方法。ABTS+·清除能力的测定：参照文献[28]的方法。O2-·清除能力的测定：参照文献[29]的方法。
1.3.7 黑涩石楠总多酚的组分分析
参考文献[30]采用HPLC法对黑涩石楠总多酚中的原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、槲皮素含量进行检测分析。
1.3.8 数据处理
所有试验数据平行测定3次，结果用“平均值±标准差”表示，采用Origin8.5软件进行数据处理和图形绘制。
2 结果与分析
2.1 黑涩石楠总多酚提取工艺优化单因素试验结果
2.1.1 料液比对黑涩石楠总多酚提取的影响
料液比对黑涩石楠总多酚提取的影响见图1。由图1可知，随着料液比的增大，总多酚提取量呈先升高后降低的趋势，当料液比为1∶40（g∶mL）时，总多酚提取量达到最高，为9.92 mg/g，表明此时多酚类物质已基本全部溶出，当溶质和溶液的比例扩大到一定程度后，萃取剂对多酚的提取已经达到饱和，再提高萃取剂可能会导致已被提取的多酚脱附重回到待提取物中，也会增加杂质的溶出，造成得率的下降[31]。因此，选择1∶40（g∶mL）为最佳料液比。
图1 料液比对总多酚提取的影响
Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on total polyphenols extraction
2.1.2 乙醇体积分数对黑涩石楠总多酚提取的影响
乙醇体积分数对黑涩石楠总多酚提取的影响见图2。由图2可知，随着乙醇体积分数的增大，总多酚提取量呈先升高后降低的趋势，当乙醇体积分数为55%时，总多酚提取量达到最高，为9.74 mg/g，表明此时多酚类物质已基本全部溶出，这是由于多酚在植物中常与蛋白质等物质通过氢键的形式结合，低体积分数的乙醇不足以破坏氢键结构，或破坏程度不够，而高体积分数的乙醇会降低溶剂极性[32]。因此，选择55%为最佳乙醇体积分数。
图2 乙醇体积分数对总多酚提取的影响
Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on total polyphenols extraction
2.1.3 提取时间对黑涩石楠总多酚提取的影响
提取时间对黑涩石楠总多酚提取的影响见图3。由图3可知，随着提取时间的增加，总多酚提取量呈现先升高后降低的趋势，当提取时间为120 min时，总多酚提取量达到最高，为9.80 mg/g。提取时间过长会使得其中一部分多酚被氧化、分解，导致多酚提取量逐渐减少[33]。因此，选择最佳提取时间为120 min。
图3 超声提取时间对总多酚提取的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time on total polyphenols extraction
2.1.4 提取温度对黑涩石楠总多酚提取的影响
提取温度对黑涩石楠总多酚提取的影响见图4。由图4可知，随着提取温度的升高，总多酚提取量呈先升高后降低的趋势，当提取温度为45 ℃时，总多酚提取量达到最高，为9.94 mg/g。这是由于随着提取温度的升高，使细胞壁渗透性增强，同时也使得多酚的扩散速率及溶解度増加，进而提高多酚的提取效率[34]。但当提取温度过高，会引起多酚类物质降解，化学结构遭到破坏，使得多酚提取量下降。因此，选择最佳提取温度为45 ℃。
图4 超声提取温度对总多酚提取的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic extraction temperature on total polyphenols extraction
2.1.5 超声频率对黑涩石楠多酚提取的影响
超声能产生空化效应，使原料在溶剂中瞬时产生的空化泡破碎，使组织中细胞破裂，利于溶剂浸透到植物细胞内部，使多酚类物质溶于溶剂中[35]。因此，考察超声频率对黑涩石楠总多酚提取的影响，结果见图5。由图5可知，随着超声频率的增大，总多酚提取量呈先升高后降低的趋势，说明超声场内所产生的空化效应弱，使总多酚提取量低[36]。当超声频率为40 kHz时，总多酚提取量最高，为12.38 mg/g，因此，选择最佳超声频率为40 kHz。
图5 超声提取频率对总多酚提取的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic extraction frequency on total polyphenols extraction
2.2 黑涩石楠总多酚提取工艺优化响应面试验
2.2.1 回归模型分析
在单因素试验基础上，固定料液比1∶45（g∶mL）、超声频率为40 kHz，选取对总多酚提取量影响较大的乙醇体积分数（A）、提取时间（B）和提取温度（C）对考察因素，以黑涩石楠总多酚提取量（Y）为响应值，采用Design-Expert 10.0统计软件设计3因素3水平的响应面试验，试验设计及结果见表2，方差分析见表3。
表2 黑涩石楠总多酚提取工艺优化响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface experiments for extraction process optimization of total polyphenols from Aronia melanocarpa
试验号 A B C Y 总多酚提取量/（mg·g-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0-1 0 0 0 0 1 -1 0 0 1 -0 0 0 -1-1 1 0 0 -1 0 -11 12 13 14 15 16 17 1 1 1 0 -1 1 0 0 0 0 -1 1 1 0 0 0 -1 0 1 -1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 -1 11.19±0.11 12.55±0.17 12.53±0.13 9.58±0.09 7.76±0.14 9.68±0.15 9.37±0.12 10.58±0.13 9.09±0.18 12.37±0.21 10.74±0.12 9.64±0.08 12.80±0.14 9.48±0.10 10.15±0.15 12.70±0.11 9.01±0.13
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性回归模型**ABCA B****AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总误差38.39 0.216 2 1.93 2.66 0.195 4 0.324 3 1.55 4.24 8.14 16.10 0.488 0 0.376 0 0.112 0 38.88 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6 4.27 0.216 2 1.93 2.66 0.195 4 0.324 3 1.55 4.24 8.14 16.10 0.069 7 0.125 3 0.028 0 61.19 3.10 27.65 38.17 2.80 4.65 22.29 60.80 116.83 230.97＜0.000 1 0.121 7 0.001 2 0.000 5 0.138 0 0.067 9 0.002 2 0.000 1＜0.000 1＜0.000 1********4.48 0.090 9
采用Design-Expert 10.0统计软件对表2结果进行多元二次回归拟合，得到的二次多项式回归方程为：
Y=12.59-0.164 4A+0.490 9B+0.576 8C-0.221 0AB-0.2848AC-
0.6232BC-1.00A2-1.39B2-1.96C2
由表3可知，回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），表明模型可靠；决定系数R2=0.987 4、调整决定系数R2Adj=0.971 3，说明此回归模型的拟合度与预测性良好，可作为黑色石楠总多酚提取工艺参数的预测模型。由表3亦可知，一次项B、C，交互项BC及二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。各因素对黑涩石楠总多酚提取量影响的顺序为：提取温度＞提取时间＞乙醇体积分数。
采用Design-Expert 10.0绘制提取温度与提取时间间交互作用对黑涩石楠总多酚提取量影响的响应面及等高线，结果见图6。由图6可知，响应面呈凸面，存在最高值；等高线呈椭圆形，说明提取温度与提取时间间交互作用对黑涩石楠总多酚提取量有较大影响，这与方差分析的结果一致。
图6 超声提取时间及超声提取温度间交互作用对黑涩石楠总多酚提取影响的响应面及等高线图
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between ultrasonic extraction time and temperature on total polyphenols extraction from Aronia melanocarpa
2.2.2 最佳条件的确定及验证试验
通过Design-Expert 10.0软件对回归方程进行求解，得到黑涩石楠总多酚的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数54.41%、提取时间124.69 min、提取温度45.65 ℃，总多酚提取量的理论值为12.67 mg/g。考虑到实际操作的可行性，将最佳提取工艺条件修正为乙醇体积分数54%、提取时间125 min、提取温度46 ℃。在此条件进行3次验证试验，得到黑涩石楠总多酚提取量为（12.69±0.079）mg/g，与预测的理论值相近，表明该模型拟合良好，可以用于预测黑涩石楠总多酚的提取工艺。
2.3 黑涩石楠总多酚抗氧化活性研究
2.3.1 黑涩石楠总多酚清除DPPH自由基能力的测定
黑涩石楠总多酚对DPPH自由基的清除能力见图7。由图7可知，在0.2～1.0 mg/mL质量浓度范围内，随着黑涩石楠总多酚和VC质量浓度的增加，对DPPH自由基的清除率均逐渐增大，呈现正相关趋势。黑涩石楠总多酚对DPPH自由基的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值为0.30 mg/mL，VC对DPPH自由基的IC50值为0.34 mg/mL。结果表明，黑涩石楠总多酚对DPPH自由基的清除能力强于VC的清除能力，这与文献[36]报道一致。
图7 黑涩石楠总多酚对DPPH自由基的清除作用
Fig.7 Scavenging effects of total polyphenols from Aronia melanocarpa on DPPH·
2.3.2 黑涩石楠总多酚清除ABTS自由基能力的测定
黑涩石楠总多酚对ABTS自由基的清除能力见图8。由图8可知，在0.2～1.0 mg/mL质量浓度范围内，随着黑涩石楠总多酚和VC质量浓度的增加，对ABTS自由基的清除率均逐渐增大，基本呈现正相关趋势。黑涩石楠总多酚对ABTS自由基的IC50值为0.42 mg/mL，VC对ABTS自由基的IC50值为0.49 mg/mL。结果表明，黑涩石楠总多酚对ABTS自由基的清除能力强于VC的清除能力。
图8 黑涩石楠总多酚对ABTS自由基的清除作用
Fig.8 Scavenging effects of total polyphenols from Aronia melanocarpa on ABTS·
2.3.3 黑涩石楠总多酚清除O2-自由基清除能力的测定
黑涩石楠总多酚对O2-自由基的清除能力见图9。由图9可知，在0.2～1.0 mg/mL质量浓度范围内，随着黑涩石楠总多酚和VC质量浓度的增加，对O2-自由基的清除率均逐渐增大，基本呈现正相关趋势。黑涩石楠总多酚对O2-自由基的IC50值为0.35 mg/mL；VC对O2-自由基的IC50值为0.40 mg/mL。结果表明，黑涩石楠总多酚对O2-自由基的清除能力高于VC。
图9 黑涩石楠总多酚对O2-自由基的清除作用
Fig.9 Scavenging effects of total polyphenols from Aronia melanocarpa on O2-·
2.4 黑涩石楠单体酚分析结果
有研究报道，黑色石楠总多酚中含量较高的酚酸类物质包括原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、槲皮素[37-38]，因此，采用HPLC法分析黑涩石楠中这5种组分的含量，结果见图10。由图10可知，黑涩石楠总多酚中原儿茶酸含量为0.24mg/g、新绿原酸含量为1.08mg/g、绿原酸含量为2.22mg/g、咖啡酸含量为0.31 mg/g、槲皮素含量为0.31 mg/g，结果为黑涩石楠的开发和利用提供了依据。
图10 黑涩石楠单体酚（a）及混合标准品（b）HPLC色谱图
Fig.10 HPLC chromatogram of free phenols(a)from Aronia melanocarpa and mixed standards(b)
1：原儿茶酸，2：新绿原酸，3：绿原酸，4：咖啡酸，5：槲皮素。
3 结论
本研究以黑涩石楠冻果为原料，在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken响应面法优化得到超声波辅助提取黑涩石楠中的总多酚的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数54%、提取时间125 min、提取温度46 ℃、料液比1∶40（g∶mL）、超声功率700 W，超声频率40 kHz，在此条件下得到黑涩石楠冻果中总多酚的提取量为（12.69±0.079）mg/g。体外抗氧化试验结果表明，黑涩石楠中总多酚对DPPH·、ABTS+·、O2-·清除能力均强于VC，其IC50值分别为0.30 mg/mL、0.42 mg/mL和0.35 mg/mL。HPLC分析结果表明，黑涩石楠中原儿茶酸0.24 mg/g、新绿原酸1.08 mg/g、绿原酸2.22 mg/g、咖啡酸0.31 mg/g、槲皮素0.31 mg/g。本研究为后续黑涩石楠多酚的绿色、安全制备提供了一定的基础，也为其作为天然抗氧化剂活性物质的研究提供了一定的理论依据。
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