红小扁豆（学名Red lentils），又名连度豆，豆科属一年生或越年生草本，是一种药食两用的植物[1]；主要产自加拿大、印度、土耳其和澳大利亚。红小扁豆含有丰富的膳食纤维、矿物质及多种维生素，具有调节肠道菌群、增强免疫力等功效，且其营养成分易被人体吸收利用[2-3]，可有效补充人体所需营养成分。截至2017年，小扁豆在中国的收获面积为7.4万hm2，收获面积世界排名11，种植区域主要在中西部生态条件相对较差的高原、高寒、干旱半干旱地区，单位面积产量为2 314.1 kg/hm2。但中国对其的研究较少，仅限于资源研究、品种引进、提纯复壮、筛选鉴定、栽培技术等[4]。
植物酸奶又称非乳制品酸奶，是通过发酵大豆、坚果、燕麦等植物材料，添加乳酸菌或益生菌制成，比传统的牛奶酸奶更经济、低碳、环保，特别适合乳糖不耐症患者、牛奶蛋白过敏患者、“三高”人群、素食者、轻食者等特定人群食用。2020年，中国卫生监督协会发布了T/WSJD 12—2020《植物蛋白饮料植物酸奶》，将植物酸奶定义为由植物和（或）含有某种蛋白质的产品为原料制成的植物蛋白产品。通过灭菌和发酵，降低pH值后，在发酵前或发酵后不添加或添加来自非动物的成分，转化为植物性蛋白质饮料[5]。目前，国内外对植物基酸奶的研究主要以大豆、椰子、巴旦木等豆类和坚果类植物为原料，但种类单一，存在如大豆植物性酸奶难以解决豆腥味和消费者的过敏反应，燕麦草本酸奶中燕麦颗粒的粘度和不溶性会影响酸奶的口感和质地等问题[6-10]。
本试验以红小扁豆为原料研制一款具有较高营养价值且风味独特的凝固型酸奶，通过单因素和Box-Behnken响应面试验优化凝固型红小扁豆酸奶的发酵工艺，该研究不仅能够加快红小扁豆的深度加工利用，促进红小扁豆在国内的研究发展，而且能丰富市场现有植物基发酵酸奶的产品类型，为红小扁豆的开发利用做出更多尝试，同时为红小扁豆的产业加工提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红小扁豆：临沂亿香农产品加工有限公司；低聚果糖：山东百龙创园生物科技有限公司；酸奶稳定剂：嘉源食品配料有限公司；酸奶发酵剂（嗜热链球菌∶保加利亚杆菌=1∶1）：安琪酵母股份有限公司；香精：河南万邦实业有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
L18-P510高速破壁调理机：九阳股份有限公司；GJJ-1-25型高速均质乳化机：上海诺尼轻工机械有限公司；LK-68SNJ型全自动多功能酸奶发酵机：广东乐创电器有限公司；C21-SN2105T型电磁炉：广东美的生活家用电器制造有限公司；DHP-9032型电热恒温培养箱：上海一恒开学仪器有限公司；NDJ-5S黏度计：浙江力辰仪器科技有限公司；CM-FY-100L反高压蒸汽灭菌锅：济南欧莱博电子商务有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 凝固型红小扁豆酸奶发酵工艺流程及操作要点
红小扁豆筛选→清洗、浸泡→热磨浆→过滤去渣→煮制→配料（低聚果糖＋稳定剂）→预热→均质→杀菌→冷却→接种发酵→罐装→冷藏后熟→成品
操作要点：
红小扁豆筛选：挑选饱满、无霉变的红小扁豆。
清洗及浸泡：将筛选出的红小扁豆用流动清水冲洗3遍，在40 ℃的水中浸泡10 h。
热磨浆、过滤：将浸泡后的红小扁豆加入豆子质量6倍的水，在磨浆机中于90 ℃磨浆10 min，得到粗浆液，以4层无菌纱布过滤去渣。
煮制：过滤后的浆液中火煮25～30 min。
添加配料：稳定剂、低聚果糖与过滤后的浆液按质量比1∶22∶177混合均匀，搅拌直至充分溶解得混合料液。
预热、均质、杀菌：将混合后的料液放入70～80 ℃的水中加热15 min，在温度为75～80 ℃、压强为25～30 MPa条件下，将定容后的混合料液均质；将均质后的混合料液控制温度为62～65 ℃进行灭菌处理30 min。
冷却、接种发酵：将经预热、均质灭菌后的混合料液降温到38 ℃，按照混合料液和发酵剂质量比100∶0.3的比例，在混合料液中加入发酵剂（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌=1∶1），将温度控制在38 ℃发酵到酸度65～90°T时，制得半成品发酵酸豆奶。
灌装：将接种发酵得到的半成品发酵酸豆奶迅速冷却至10～20 ℃，然后破乳灌装。
冷藏后熟：将灌装好的发酵酸豆奶在3～4 ℃条件下冷藏发酵12 h，即得发酵酸奶成品。
1.3.2 凝固型红小扁豆酸奶发酵工艺优化单因素试验
以100 g红小扁豆混合料液为基准，固定酸奶稳定剂添加量为0.5%，其他条件不变，以凝固型红小扁豆酸奶的酸度和感官评分为评价指标，分别考察低聚果糖添加量（9%、11%、13%、15%、17%）、酸奶发酵剂添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、发酵温度（34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃）、发酵时间（6 h、7 h、8 h、9 h、10 h）对凝固型红小扁豆酸奶品质的影响[11-12]。
1.3.3 凝固型红小扁豆酸奶发酵工艺优化响应面试验
在单因素试验结果的基础上，按照Box-Behnken的中心结构设置原则，以低聚果糖添加量（A）、酸奶发酵剂添加量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为考察因子，以凝固型红小扁豆酸度（Y1）和感官评分（Y2）为考察指标，设计4因素3水平响应面试验对发酵工艺进行优化[13-14]，并运用Design Expert 8.0.6软件进行响应面分析，响应面试验设计因素与水平见表1。
表1 凝固型红小扁豆酸奶发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of set red lentil yoghurt
水平 A 低聚果糖添加量/%D 发酵时间/h-1 B 酸奶发酵剂加量/%C 发酵温度/℃0 1 11 13 15 0.2 0.3 0.4 36 38 40 7 8 9
1.3.4 测定方法
感官评价：由10名有一定品评经验的专业人员组成评定小组，参考国标GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》[15]的规定分别从色泽、气味、滋味、组织状态4项指标对凝固型红小扁豆酸奶进行打分，满分为100分，结果取10人平均分。具体感官评分标准见表2[16]。
表2 凝固型红小扁豆酸奶感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of set red lentil yoghurt
感官品评指标 标准 评分/分色泽气味滋味色泽均匀一致，呈淡粉色，有光泽色泽较均匀，光泽度一般色泽不均匀，无光泽有红小扁豆香味，香气浓郁有红小扁豆香味，香气稍淡有异常气味有酸奶特有的滋味，酸甜适中有酸奶特有的滋味，较酸或较甜有酸奶味，酸味弱或甜味弱，有苦涩味20～25 15～19＜15 20～25 15～19＜15 20～25 15～19＜15组织状态凝固均匀，组织细腻，黏稠度适中，无气泡，无乳清析出，无悬浮物，无杂质凝固较均匀，有颗粒状，黏稠度一般，无气泡或存在少量气泡，没有显著分层，无杂质凝固不均匀，黏稠度差，有乳清析出，有气泡，有杂质20～25 15～19＜15
酸度：按照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[17]中的酚酞指示剂法测定；蛋白质含量：按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[18]中的凯氏定氮法测定；脂肪含量：按照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[19]中的索氏提取法测定；黏度：采用NDJ-1旋转式黏度计，测量条件为温度20 ℃、转速为2 r/min、停留时间为30 s、用I号转子测定[20]。微生物指标[21-22]：按照GB4789.3—2016平板划线法《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》测定大肠菌群；按照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》测定酵母和霉菌。
2 结果与分析
2.1 凝固型红小扁豆酸奶发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 低聚果糖添加量对凝固型红小扁豆酸奶品质的影响低聚果糖在酸奶发酵过程中为菌体提供碳源，同时改善风味，其添加量过高或过低都会影响菌体的增殖和感官评分[13]。由图1可知，随着低聚果糖添加量的增加，凝固型红小扁豆酸奶的酸度和感官评分均呈先上升后下降的趋势。当低聚果糖添加量＜13%时，碳源不足，凝固型红小扁豆酸奶酸度不足，风味不足，红小扁豆的发酵味突出，感官评分较低；当低聚果糖添加量为13%时，凝固型红小扁豆酸奶酸度、感官评分最高，分别为54°T、84.5分；继续添加低聚果糖，则凝固型红小扁豆酸奶甜度过高，酸甜失调，酸度与感官评价反而降低，这与王振伟[23]的研究结果一致。因此，确定最适低聚果糖添加量为13%。
图1 低聚果糖添加量对凝固型红小扁豆酸奶品质的影响
Fig.1 Effect of oligofructose addition on the quality of set red lentil yoghurt
2.1.2 发酵剂添加量对红小扁豆酸奶品质的影响
发酵剂添加量会影响酸奶的成熟时间及生产成本，添加量过少会导致凝乳状态不佳，过多会导致产酸过多，乳清大量析出，成本增加。由图2可知，随着发酵剂的增加，凝固型红小扁豆酸奶的酸度和感官评分均呈先上升后下降的趋势。当发酵剂添加量＜0.3%时，发酵时产酸功能不足，酸乳无法凝固形成，且结构也较差，感官评分较低；当菌种添加量为0.3%时，凝固型红小扁豆酸奶酸度、感官评分最高，分别为54°T、83.5分，此时酸奶凝乳均匀，有光泽，无乳清析出；当发酵剂添加量＞0.3%时，则因为菌种在发酵的时候产酸功能过多[23]，因此还会产生少许乳清析出，酸奶的口感、质地略为生涩。因此，确定最适发酵剂添加量为0.3%。
图2 发酵剂添加量对凝固型红小扁豆酸奶品质的影响
Fig.2 Effect of starter addition on the quality of set red lentil yoghurt
2.1.3 发酵温度对红小扁豆酸奶品质的影响
酸奶发酵过程中，发酵温度会影响产品的发酵程度、发酵时间和成品风味质量。由图3可知，随着发酵温度的逐渐升高，凝固型红小扁豆酸奶的酸度和感官评分均呈先上升后下降的趋势。发酵温度过低时，细菌活性偏低，酸奶发酵过程不足，原料中营养因子和芳香物质的形成和转化不足，导致酸奶质量不佳[24]；发酵温度为38 ℃时，凝固型红小扁豆酸奶酸度、感官评分最高，分别为54°T、84分。随着发酵温度持续升高，酸奶酸化过快，不利于乳香产生，口感变差，甚至导致酸奶分层。因此，确定最适发酵温度为38 ℃。
图3 发酵温度对凝固型红小扁豆酸奶品质的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of set red lentil yoghurt
2.1.4 不同发酵时间对红小扁豆酸奶的影响
发酵过程中微生物会持续产酸、产香，对酸奶的最终酸度和口感有较显著的影响。由图4可知，随着发酵时间的延长，凝固型红小扁豆酸奶的酸度和感官评分均呈先上升后下降的趋势。发酵时间＜8h时，发酵不彻底，缺乏酸味且风味物质没有充分释放出来，口感不够厚重；发酵时间为8 h时，凝固型红小扁豆酸奶酸度、感官评分最高，分别为54°T、83分；继续延长发酵时间，酸奶酸味加重，甚至产生一些不良风味物质，使得酸奶品质发生劣变[25]。因此，确定最适发酵时间为8 h。
图4 发酵时间对凝固型红小扁豆酸奶品质的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of set red lentil yoghurt
2.2 凝固型红小扁豆酸奶发酵工艺优化响应面试验
2.2.1 响应面试验设计和结果
利用Design Expert 8.0.6软件对表3结果进行多元回归的拟合，所得到的二次多元回归方程为：
表3 凝固型红小扁豆酸奶发酵工艺优化Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation process optimization of set red lentil yoghurt
试验号 A B C D Y1酸度/°T Y2感官评分/分1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 13.00 11.00 13.00 11.00 13.00 13.00 15.00 11.00 13.00 13.00 13.00 15.00 13.00 13.00 13.00 13.00 11.00 13.00 11.00 13.00 15.00 15.00 13.00 13.00 11.00 15.00 13.00 13.00 15.00 0.40 0.20 0.30 0.30 0.40 0.30 0.30 0.40 0.30 0.40 0.20 0.30 0.20 0.30 0.20 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.20 0.30 0.40 0.30 0.40 0.30 0.20 0.30 38.00 38.00 38.00 38.00 36.00 36.00 40.00 38.00 38.00 38.00 38.00 36.00 36.00 38.00 38.00 36.00 40.00 40.00 36.00 38.00 38.00 38.00 38.00 40.00 38.00 38.00 40.00 40.00 38.00 7.00 8.00 8.00 9.00 8.00 7.00 8.00 8.00 8.00 9.00 7.00 8.00 8.00 8.00 9.00 9.00 8.00 9.00 8.00 8.00 9.00 8.00 8.00 8.00 7.00 8.00 7.00 8.00 7.00 42 43 54 42 35 37 43 42 53 44 45 36 35 54 44 35 41 45 35 54 43 42 55 44 44 45 46 45 44 76.1 72.8 83.6 71.5 65.7 67.4 73.2 71.6 83.4 73.8 74.4 66.4 65.2 83.9 74.3 65.8 69.4 75.2 64.5 84.2 73.4 71.5 84.5 74.3 73.7 74.8 75.4 75.1 73.8
为了检验方程的有效性，对表3结果进行回归模型方差分析，结果见表4、表5。由表4、表5可知，对于感官评分和酸奶酸度两个响应值，模型的P值均＜0.05，表明模型显著；模型的失拟误差P值均＞0.05，说明模型失拟项不显著。由P值可知，一次项C、二次项A2、B2、C2、D2感官评分影响极显著（P＜0.01）；一次项A、C、二次项A2、B2、C 2、D2对酸度影响极显著（P＜0.01）。一次项D及交互项AB对感官评分影响显著（P＜0.05），交互项AB对酸度影响显著（P＜0.05）。由F值可知，各因素对感官评分的影响顺序为发酵温度（C）＞低聚果糖添加量（A）＞发酵时间（D）＞发酵剂添加量（B），对酸度的影响顺序为发酵温度（C）＞低聚果糖添加量（A）＞发酵剂添加量（B）＞发酵时间（D）。
表4 以感官评分为评价指标的回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model using sensory score as evaluation index
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。下同。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型14 ABCDA B********AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2 85.16 9.77 0.95 240.17 4.90 6.44 1.15 1.03 0.54 1.54 0.62 351.01 197.90 653.18 148.85＜0.000 1 0.007 4 0.345 3＜0.000 1 0.043 9 0.023 7 0.302 1 0.327 3 0.475 6 0.235 1 0.443 0＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1********残差失拟项纯误差总方差937.25 7.68 0.75 188.81 3.85 5.06 0.90 0.81 0.42 1.21 0.49 275.95 155.58 513.51 117.02 11.01 10.22 0.79 948.25 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 10 4 28 66.95 7.68 0.75 188.81 3.85 5.06 0.90 0.81 0.42 1.21 0.49 275.95 155.58 513.51 117.02 0.79 1.02 0.20 5.19 0.063 3不显著
表5 以酸度为评价指标的回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model using acidity as evaluation index
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型14 ABCDA B*******AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2 963.20 8.33 0.75 208.33 0.083 6.25 2.25 1.00 0.25 12.25 4.00 233.51 170.37 525.41 124.16 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 68.80 8.33 0.75 208.33 0.083 6.25 2.25 1.00 0.25 12.25 4.00 233.51 170.37 525.41 124.16 78.63 9.52 0.86 238.10 0.095 7.14 2.57 1.14 0.29 14.00 4.57 266.87 194.71 600.46 141.89＜0.000 1 0.008 1 0.370 2＜0.000 1 0.762 2 0.018 2 0.131 1 0.303 1 0.601 4 0.002 2 0.050 6＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1**********
续表
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性残差失拟项纯误差总方差12.25 10.25 2.00 975.45 14 10 4 28 0.87 1.02 0.50 2.05 0.255 0 不显著
该模型响应值感官评分与酸奶酸度决定系数R2为0.99和0.99，调整决定系数R2Adj为0.98和0.97，说明该模型拟合度较高；模型变异系数（coefficient of variation，CV）为1.20%和2.13%，均小于10%，表明置信度较好，模型能很好地体现实际试验结果。
2.2.2 各因素间交互作用的影响
响应面坡度越大，表明各因子对响应值影响越大，而等高线为斜交椭圆形，则表明两因子有交互作用[26]。由图5可知，交互项AB曲面倾斜度大、坡度最大、等高线为椭圆形、密度大，表明它们之间存在着显著的交互作用影响（P＜0.05）；其他因素之间的交互作用效果均不显著（P＞0.05），这与方差分析结果一致。
图5 各因素间交互作用对凝固型红小扁豆酸奶感官评分影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory score of set red lentil yoghurt
由图6可知，交互项BD和AB曲面倾斜度越大，坡度越陡，等高线形状为椭圆形，密度越大，表明它们之间存在着明显的交互作用影响（P＜0.05）；CD、AC、AD和BC之间的交互作用没有显著影响（P＞0.05），这和方差分析的结果相符。
图6 各因素间交互作用对凝固型红小扁豆酸奶酸度影响的响应面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on acidity of set red lentil yoghurt
利用Design-Expert 8.0.6软件对凝固型植物基红小扁豆酸奶的发酵工艺参数进行模拟预测，以酸度为考察指标时，在低聚果糖添加量为13.1%、发酵剂添加量为0.35%、发酵温度为38.5 ℃、发酵时间为8.5 h条件下，植物基红小扁豆酸奶酸度预测值为56°T；以感官评分为考察指标时，在低聚果糖添加量为13.5%、发酵剂添加量为0.32%、发酵温度为37.5 ℃、发酵时间为8 h条件下，植物基红小扁豆酸奶感官评分预测值为85分。为了验证模型的精准性和实际操作的可行性，对发酵工艺参数调整为低聚果糖低添加量13%、发酵剂添加量0.3%、发酵温度38 ℃、发酵时间8 h。并在此条件下进行了3次平行试验验证。最终，得到的凝固型植物基红小扁豆酸奶呈淡粉色、组织均匀、无分层、无乳清析出，口感酸甜适中、顺滑细腻；风味协调、有红小扁豆特有的香气，酸奶的感官评分实际值为84.5分，酸度实际值为54°T，优化后的工艺参数与预测值高度吻合，说明响应面优化的结果是可靠的，可用于实际生产。
2.3 凝固型红小扁豆酸奶理化及微生物指标分析
由表6可知，凝固型红小扁豆酸奶的蛋白质、脂肪含量分别为7.164 g/100 g、3.085 g/100 g，酸度为54°T，黏度为4 695.7 mPa·s，酵母菌、霉菌活菌数为12 CFU/g，大肠杆菌及致病菌未检出，品质指标符合中国国情产品质量监管委员会团体标准T/WSJD12—2020《植物蛋白饮料植物酸奶》。
表6 凝固型红小扁豆酸奶理化及微生物指标分析
Table 6 Analysis of physicochemical and microbial indexes of set red lentil yogurt
项目 测定值 标准要求蛋白质/（g·100 g-1）脂肪/（g·100 g-1）酸度/°T黏度/（mPa·s）酵母菌和霉菌/（CFU·g-1）大肠菌群/（CFU·g-1）7.164 3.085 54 4 695.7 12未检出≥1.0≥30.0≤20.0＜90
3 结论
本研究以红小扁豆为原料，以感官评分与酸度共同作为评价指标，通过单因素试验和响应面分析，得到凝固型植物基红小扁豆酸奶的最佳发酵条件：低聚果糖添加量13%、发酵剂添加量0.3%、发酵温度38 ℃、发酵时间8 h。在此条件下，凝固型红小扁豆酸奶的感官评分为84.5分，蛋白质含量为7.164 g/100 g，脂肪含量为3.085 g/100 g，酸度为54°T，黏度为4695.7mPa·s，酵母菌和霉菌活菌数为12CFU/g。该产品具有浓郁的红小扁豆风味和良好的组织状态。验证试验所得酸奶与预测值相差不大，说明此模型有较高的可信度。为今后我国红小扁豆深加工领域提供理论指导和技术支撑。经检测该产品所含微生物指标符合国家规定标准，达到了食品安全要求。因此，利用新鲜红小扁豆为原料制备植物基酸奶具有广阔的应用前景。
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