红曲菌又称红曲霉（Monascus spp.），作为唯一可生产食用色素的药食两用微生物，已有上千年的应用历史。红曲霉能代谢产生丰富的代谢产物，目前，红曲色素和降血脂的活性物质莫纳可林K（Monacolin K）应用较为广泛[1-4]。红曲发酵产品是将红曲霉接种到大米等粮食原料发酵而成的食品[5]。红曲食品作为我国传统特色产品畅销国内外市场，其代谢产物广泛应用于酿造、食品加工和医疗保健等领域[6-9]。如JOU P C等[10]研究发现，红曲米中红曲色素等物质，可刺激成熟脂肪细胞的基础脂解，避免脂质积累。另外，LEE C L等[11]将分离出发酵红曲米中的安卡黄素、红曲红色素饲喂大鼠可以显著抑制肾脏和附睾脂肪细胞的增大，减轻脂肪组织的积累，减缓体质量的增加。
红枣（Ziziphus jujuba Mill.）为鼠李科枣属植物的果实，主要功能性营养成分有环腺苷酸、多糖、多酚、氨基酸等[12-13]，具有调节免疫力、预防心血管疾病、补虚益气、养血安神等功效[14-17]。新疆凭借独特地理物质，成为红枣的主要产地，其中南疆红枣产量占新疆总产量的70%[18]。因此，利用新疆红枣开发相关产品可丰富产品种类。啤酒是一种含有丰富的矿物质、维生素、氨基酸、酚类等物质的低酒精度饮品[19-21]。利用红枣为原料酿造啤酒，可进一步增加啤酒的营养物质、香气成分等[22]。孙科[23]以红枣和大麦芽为原料制备红枣啤酒，对红枣啤酒酿造过程中的糖化条件和工艺条件进行优化，使生物稳定性提高、口味更协调[24]。张晓荣等[25]研究表明，啤酒在高浓缩麦芽汁酿造过程中添加红枣汁，可以提高发酵速度和酒精度，使啤酒口感更加细腻香醇，然而利用红枣和红曲米发酵啤酒的研究鲜见报道。
本研究以红枣、红曲米和大麦芽为原料，研制红枣红曲复合啤酒，采用单因素和正交试验对红枣红曲复合啤酒酿造工艺进行优化，并对其品质指标进行分析，以期为南疆红枣农产品的发展提供切实可行的方向，也为复合型啤酒的原料选择和酿造工艺优化提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红枣：市售；红曲米：福建省古田县红鑫酒粬有限公司；大麦芽：新疆燕京农产品开发有限公司；啤酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；啤酒花：新疆方睿啤酒原料制品有限责任公司；氢氧化钠、葡萄糖、硫酸铜、酒石酸钾钠、次甲基蓝、亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸、乙醇、异丙醇、甲醇、无水乙醇（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
LHR-250生化培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；PHP-9162电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；NK-55T高精度数显糖度计：天津瞭望光电科技有限公司；GZX-9240 MBE电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；FA-V电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；M.HZ25Easy119食品搅拌机：广东美的生活电器造有限公司；GC-2014C气相色谱仪：岛津企业管理（中国）有限公司；TGL-20B高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；J6紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；DXF-4D高速多功能摇摆式粉碎机：广州大翔电子机械设备有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 红枣红曲复合啤酒酿造工艺流程及操作要点
操作要点：
红枣浆制备：挑选优质灰枣清洗、浸泡、去核，以红枣与水的比例为1∶3（g∶mL）放入食品搅拌机，打至浆状。
糖化：大麦芽与红曲米混合（质量比95∶5）原料利用多功能粉碎机粉碎约5 min，再以大麦芽、红曲米与水的料水比为1∶5进行糖化，同时以混合原料糖化液体积的20%添加红枣浆，50 ℃时投料，恒温20 min，升温至62 ℃保温40 min，升温至68 ℃保温30 min，升温至72 ℃保温10 min，最后升温至78 ℃，糖化结束。对照组啤酒以大麦芽为唯一原料，后续发酵步骤与实验组相同。
过滤：糖化液冷却，用三层纱布过滤。
煮沸：添加糖化液总质量0.08%的啤酒花，分别在煮沸10 min后添加25%，煮沸20 min添加50%，继续煮沸30 min，再添加剩余的25%，最后煮沸10 min。
冷却：将煮沸的糖化液迅速冷却至30 ℃以下。
发酵：按照每100 g啤酒活性干酵母溶于1 L温水（35～38 ℃）搅拌溶解后，室温静置15～30 min。添加0.8 g/L酵母于糖化液中于15 ℃发酵7 d，待总糖含量降低到基本不变化，结束发酵。
离心、冷藏：发酵结束后5 000 r/min离心20 min，放入4 ℃冷藏库进行冷藏，即得红枣红曲复合啤酒成品。
1.3.2 测定方法
酒精度和甲醇的测定：采用GB 5009.225—2023《食品安全国家标准酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》气相色谱法；总酸含量的测定：采用GB/T 12456—2021《食品中总酸的测定》酸碱滴定法；总糖含量的测定：采用高精度数显糖度计；色度、泡持性的测定：分别采用GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》紫外可见分光光度计法、秒表法；1,1二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率的测定：采用紫外可见分光光度计法[26]。
1.3.3 红枣红曲复合啤酒的感官评价
选择10位经过培训的感官评定专业人员（5男、5女）对红枣红曲复合啤酒的外观、香气、口味和泡沫进行评定打分，满分为100分。红枣红曲复合啤酒感官评价标准见表1。
表1 红枣红曲复合啤酒感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of jujube Hongqu compound beer
项目 评价标准 感官评分/分外观（20分）泡沫（20分）香气（30分）口味（30分）红色或深红色，有光泽、迎光透亮、无悬浮物光泽差，失光，色泽较差，透明度低，有悬浮物和沉淀泡沫细腻，持久挂杯，起泡性好泡沫粗大或无泡沫，不持久，泡沫性差有明显的酒花、麦芽香气以及红枣的香气，无其他异味无酒花和红枣香气或香气淡，有异味口味醇正浓厚，酒香味协调，杀口力强口感偏甜，酒香味协调，杀口力不强口味粗糙，有酸味，有臭味10～15 1～9 15～20 10～14 20～30 1～19 26～30 15～25 1～14
1.3.4 红枣红曲复合啤酒酿造工艺条件优化
单因素试验：在固定工艺参数基础上，分别考察红曲米添加量（0、1%、2%、3%、4%）、酵母添加量（0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L）、红枣浆添加量（0、5%、10%、15%、20%）和发酵时间（5 d、7 d、9 d、11 d、13 d）对红枣红曲复合啤酒的总糖、总酸、酒精度和感官评分的影响。
正交试验：在单因素试验结果的基础上，对红曲米添加量（A）、酵母添加量（B）、红枣浆添加量（C）和发酵时间（D）4个因素进行L9（34）正交试验，优化红枣红曲复合啤酒的酿造工艺。酿造工艺条件优化正交试验因素与水平见表2。
表2 红枣红曲复合啤酒酿造工艺条件优化正交试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for brewing process conditions optimization of jujube Hongqu compound beer
水平 A 红曲米添加量/%B 酵母添加量/（g·L-1）C 红枣浆添加量/%D 发酵时间/d 1 2 3 2 3 4 0.6 0.8 1.0 10 15 20 5 7 9
1.3.5 数据处理与分析
以采用Excel 2018、Origin 2021进行数据整理和图表绘制，数据在P＜0.05水平上的显著性采用SPSS 17.0软件中的Duncan进行分析。
2 结果与分析
2.1 酿造工艺条件优化
2.1.1 红曲米添加量的确定
红曲米添加量对红枣红曲复合啤酒品质的影响见图1。
图1 红曲米添加量对红枣红曲复合啤酒品质的影响
Fig.1 Effect of Hongqu rice addition on the quality of jujube Hongqu compound beer
由图1可知，当红曲米添加量为0～3%时，红枣红曲复合啤酒的酒精度、总酸、感官评分逐渐增加，而总糖逐渐降低；当红曲米添加量为3%时，酒精度、总酸、感官评分达到最大值，而总糖为最低值，分别为8.5%vol、9.5%、86分，此时，总糖含量为10.0°Bx；当红曲米添加量＞3%时，酒精度、总酸、感官评分逐渐下降，总糖含量升高，其可能是由于酵母菌不足以继续分解多余的糖，较高的发酵液浓度导致细胞失水会对酵母及红曲菌有抑制作用，使啤酒酒精度降低，总酸降低。因此，最佳红曲米添加量为3%。
2.1.2 红枣浆添加量的确定
红枣浆添加量对红枣红曲复合啤酒品质的影响见图2。由图2可知，当红枣浆添加量为0～20%时，红枣红曲复合啤酒的总酸呈上升趋势。红枣浆添加量为0～15%时，红枣红曲复合啤酒的酒精度、感官评分逐渐上升，而总糖含量降低，其原因可能是发酵液中的糖分能够被酵母充分利用转化成酒精，酒精度升高，糖分被消耗，总糖含量下降；而当红枣浆添加量为15%时，酒精度、感官评分达到最大值，分别为11.2%vol、87分，此时，总酸、总糖含量分别为9.4%、9.7°Bx，因其酵母消耗糖分达到饱和状态，充分酵解导致发酵液中总糖含量最低，酒精度最高，此时啤酒酒体香味协调，外观色泽亮红，迎光透亮；当红枣浆添加量为15～20%时，酒精度、感官评分下降，而总糖含量升高，由于发酵液中的糖分酵解已达到过饱和状态。因此，最佳红枣浆添加量为15%。
图2 红枣浆添加量对红枣红曲复合啤酒品质的影响
Fig.2 Effect of jujube pulp addition on the quality of jujube Hongqu compound beer
2.1.3 酵母添加量的确定
酵母添加量对红枣红曲复合啤酒品质的影响见图3。
图3 酵母添加量对红枣红曲复合啤酒品质的影响
Fig.3 Effect of yeast inoculum on the quality of jujube Hongqu compound beer
由图3可知，当酵母菌添加量为0.4～1.2 g/L时，总糖含量逐渐下降。当酵母菌添加量为0.4～0.8 g/L时，酒精度上升而总酸逐渐下降；酵母菌添加量为0.8 g/L时，酒精度最高。当酵母菌添加量为0.4～1.0 g/L时，红枣红曲复合啤酒的感官评分逐渐增加；当酵母菌添加量为0.4～1.0 g/L时，红枣红曲复合啤酒的感官评分逐渐增加；当酵母菌添加量为1.0 g/L时，红枣红曲复合啤酒的感官评分达到最大值，为87分，总糖、酒精度、总酸分别为9.3°Bx、9.4%vol、7.2%；酵母菌添加量＞1.0 g/L时，感官评分下降。因此，最佳酵母菌添加量为0.8 g/L。
2.1.4 发酵时间的确定
发酵时间对红枣红曲复合啤酒品质的影响见图4。
图4 发酵时间对红枣红曲复合啤酒品质的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of jujube Hongqu compound beer
由图4可知，当发酵时间为5～13 d时，红枣红曲复合啤酒的总酸含量有所增加，而总糖含量有所降低。当发酵时间为5～7 d时，酒精度与感官评分逐渐增加；当发酵时间为7 d时，酒精度与感官评分均达到最大值，分别为9.5%vol、88分，此时，总糖、总酸含量分别为9°Bx、4.86%；当发酵时间＞7 d，酒精度与感官评分呈下降趋势。因此，最佳发酵时间为7 d。
2.2 酿造工艺条件优化正交试验结果
在单因素试验结果的基础上，对红曲米添加量（A）、酵母添加量（B）、红枣浆添加量（C）和发酵时间（D）4个因素进行L9（34）正交试验，红枣红曲复合啤酒酿造工艺条件优化正交试验结果与分析见表3，方差分析见表4。
表3 红枣红曲复合啤酒酿造工艺条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for brewing process conditions optimization of jujube Hongqu compound beer
试验号 A B C D 感官评分/分1 2 3 4 56 7 8 9k1 111222333 123123123 1 23231312 1 233 12231 72 93 76 75 83 73 77 79 70 k2 k3R 80.3 77.0 75.3 5 74.7 85.0 73.0 12 74.7 79.3 78.7 4.6 75.0 81.0 76.7 6最优组合影响顺序A1B2C2D2 B＞D＞A＞C
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
方差来源 离差平方和 自由度 方差 F 值 P 值 显著性ABCD 118.296 761.185 65.852 199.407 2222 59.148 380.593 32.926 99.704 59.148 380.593 32.926 99.704＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001********
由表3可知，对红枣红曲复合啤酒影响的顺序为B＞D＞A＞C，即酵母添加量（B）＞发酵时间（D）＞红曲米添加量（A）＞红枣浆添加量（C），正交试验结果可得知最优酿造工艺组合是A1B2C2D2，即红枣浆添加量15%，发酵时间7 d，红曲米添加量2%，酵母添加量0.8 g/L。在最优发酵组合工艺条件下进行3次平行验证试验，其感官评分为93分，红枣红曲复合啤酒色泽呈亮红色，澄清透亮，杀口性强，具有红枣独特的香味。由表4可知，红枣浆添加量、酵母添加量、发酵时间、红曲米添加量对红枣红曲复合啤酒感官评分均影响极显著（P＜0.01）。
2.3 红枣红曲复合啤酒的品质分析
红枣红曲复合啤酒的品质指标见表5。由表5可知，红枣红曲复合啤酒的总糖含量为9.91°Bx，总酸含量为5.12%，酒精度为9.11%vol，色度为28.50 EBC，DPPH自由基清除率为60.93%，泡持性为137 s，均符合GB/T 4927—2008《啤酒》要求，且均优于对照组。
表5 红枣红曲复合啤酒理化指标
Table 5 Physicochemical indexes of jujube Hongqu compound beer
指标 对照组 红枣红曲复合啤酒总糖/°Bx总酸/%酒精度/%vol色度/EBC DPPH自由基清除率/%泡持性/s 9.90 5.55 7.39 13.20 51.20 125.00 9.91 5.12 9.11 28.50 60.93 137.00
3 结论
本研究通过单因素及正交试验确定了红枣红曲复合啤酒的最佳发酵工艺为：红曲米添加量2%，红枣浆添加量15%，酵母菌添加量0.8 g/L，发酵时间7 d。在此优化条件下酿制的红枣红曲复合啤酒的总糖含量为9.91 °Bx，总酸含量为5.12%，酒精度为9.11%vol，色度为28.50 EBC，DPPH自由基清除率为60.93%，泡持性为137 s，符合GB/T 4927—2008《啤酒》要求。本研究结果可为红枣红曲复合啤酒的研制提供参考，为新型健康营养复合啤酒的研制提供思路。
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