酵母在葡萄酒的发酵过程中至关重要，非酿酒酵母是一种从葡萄园和酒厂分离得到的微生物。研究发现，葡萄园中最多的非酿酒酵母是柠檬克勒克酵母（Kloeckera apiculata）和有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum），占分离菌株的50%～75%[1]。在葡萄酒酿造过程中添加非酿酒酵母能增加总酸、甘油、挥发性酯类的含量，降低挥发酸含量，形成稳定的吡喃花色素苷等，进而提升葡萄酒的品质[1]。气候条件、土壤环境、地理位置等因素均会影响非酿酒酵母的产生情况[2]。
酿酒酵母是主导酒精发酵最重要的菌株，能够将糖转化成酒精和二氧化碳，使发酵速率加快[3]。非酿酒酵母与酿酒酵母相比产生的胞外酶量更高，但大多数非酿酒酵母缺乏单独完成酒精发酵的能力[4]。采用酿酒酵母和非酿酒酵母混合发酵方式能产生更多有益良好的代谢产物，是一种较优的酿造方法[5]。王婧等[6]研究发现，使用粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）可以增加红葡萄酒的色泽，能更好的降低葡萄酒中的苹果酸。梁丽红等[7]研究发现，粟酒裂殖酵母与耐热克鲁维酵母（Lachancea thermotolerans）高比例同时接种在改善品质和提升香气方面具有较好应用潜力。董琦楠等[8]研究发现，耐热克鲁维酵母相较于其他非酿酒酵母高产甘油、乳酸、乙酯类香气成分，低产乙醇及挥发酸类物质。赵美等[9]研究发现，粟酒裂殖酵母在发酵过程中可代谢产生吡喃型花色苷，显著提升葡萄酒颜色的鲜艳和浓郁程度，改善葡萄酒的品质。
因为气候原因，新疆产区葡萄原料存在含糖量高、含酸量低的问题，使酒的口感存在糖酸不平衡的现象。葡萄果皮中有大量的花色苷通过浸渍和酿造作用进入葡萄酒，构成红葡萄酒颜色的主要成分，并影响着红葡萄酒的重要品质[10]。目前有关非酿酒酵母对葡萄酒颜色物质、口感的研究较少，本实验以酿酒酵母菌株CECA单独发酵为对照，利用三种不同类型的非酿酒酵母菌株NSD、PL09、CT10分别与酿酒酵母菌株CECA混合发酵，探究非酿酒酵母对干红葡萄酒基本理化指标及颜色物质的影响，旨在为葡萄酒酿造工艺提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
户太八号鲜食葡萄：新疆乌鲁木齐葡萄园，采摘于2022年。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisia）CECA，非酿酒酵母（耐热克鲁维酵母（Kluyveromyces thermotolerans）CT10、布鲁塞尔德克酵母（Dekkera bruxellensis）PL09、非酿酒酵母NS-D）：上海鼎唐国际贸易有限公司。
1.1.2 化学试剂
氢氧化钠、无水葡萄糖、无水乙醇、硫酸铜、单宁酸、没食子酸：天津市致远化学试剂有限公司；福林-肖卡、福林-丹尼斯：上海康朗生物科技有限公司；盐酸、磷酸、无水碳酸钠：天津市北联精细化学品开发有限公司；以上试剂均为国产分析纯。果胶酶（酶活性100 000 U/g）：法国Laffort公司。
1.2 仪器与设备
DZK/W-D2型电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；BCD-160型低温冰箱：青岛海尔有限公司；P4PC型紫外可见分光光度计：上海美谱达有限公司；3nhNR200+型色差仪：广东三恩时智能科技有限公司；PHS-3C型pH计：上海仪电科学有限公司。
1.3 方法
1.3.1 干红葡萄酒酿造工艺流程及操作要点
新鲜葡萄→分选→破碎除梗→压榨→葡萄醪→添加偏重亚硫酸钾、果胶酶→装入发酵桶→添加酵母→浸渍发酵→过滤澄清→添加偏重亚硫酸钾中止发酵→瓶储→陈酿干红葡萄酒
操作要点：葡萄原料分选进行破碎除梗，压榨后置于60 L不锈钢发酵桶中，添加30 mg/L偏重亚硫酸钾与30 mg/L果胶酶。分别称取适量的非酿酒酵母CT10、PL09、NSD，用10倍酵母质量的20～25 ℃无氯纯净水进行活化，然后添加约3倍于复水液的无硫葡萄汁，当酵母混合液表面有细腻气泡升起，制备成酵母悬浮液，静置20 min。将纯水加热至35～38 ℃，称取适量酵母CECA，用10 倍酵母质量左右稀释后的葡萄汁，把所需酵母加入其中，搅拌均匀后至泡沫洋溢，静置15～20 min。添加酵母（NS-D：添加0.25 g/L NS-D非酿酒酵母48 h后添加0.25 g/L CECA酿酒酵母，PL09：添加0.25 g/L PL09非酿酒酵母48 h后添加0.25 g/L CECA酿酒酵母，CT10：添加0.25 g/L CT10非酿酒酵母48 h后添加0.25 g/L CECA酿酒酵母，CECA酿酒酵母（CK）：添加0.25 g/L CECA酿酒酵母）。浸渍发酵温度控制在25 ℃。每日检测比重、温度，待比重下降至0.998后酒精发酵结束，添加50 mg/L偏重亚硫酸钾终止发酵，将酒样在酒精发酵结束后25 ℃下装瓶陈酿。将各处理组酒样（酒精发酵结束后、陈酿结束后）分别编号为CK（CECA单独发酵）、CA（CT10+CECA）、PA（PL09+CECA）、NA（NS-D+CECA）。
1.3.2 测定方法
酒精度、总酸、总糖、还原糖、pH值、挥发酸、游离SO2、总SO2、色度、色调、L*、a*、b*值在酒精发酵结束时取样测定，总酸、游离SO2变化、总酚、单宁在酒精发酵结束时、陈酿7 d、14 d、21 d取样测定，在陈酿21 d后进行感官评定。基本理化指标参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[11]中的方法进行测定，每个指标做3次重复。
色度、色调：参照葡萄酒分析检测[11]，采用紫外-分光光度法测定不同酒样波长420 nm、520 nm、620 nm处的吸光度值A420nm、A520nm、A620nm。色度=A420nm+A520nm+A620nm，色调=A420nm/A520nm。
L*值、a*值、b*值：用3nh色差仪进行测定。
总酚：参照葡萄酒分析检测，福林酚（Folin-Ciocalteu）比色法；单宁：参照葡萄酒分析检测，福林-单尼斯（Folin-Denis）法[12]。
感官评定：取各处理组酒样，参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[11]的方法并略作修改。由10名葡萄与葡萄酒工程专业的本科生及研究生（5名女性、5名男性）组成品评小组，一次分析4款酒样，分别从外观、香气、口感、整体评价四个方面对酒样进行评定，取10人平均分，每一酒样做2次重复，总分100分（≥90分为完美；89～80分为优秀；79～70分为良好；69～65分为差，＜65分为不合格），干红葡萄酒感官评分标准见表1。
表1 干红葡萄酒感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of dry red wine
项目 评分标准 评分/分外观（10分）香气（30分）具有明显的典型色泽，澄清透明、有光泽与该产品色泽略有不同，澄清，无夹杂物与该产品应有色泽明显不符，微浑，失光具有纯正、优雅、愉悦和谐的果香与酒香果香、酒香良好较少，尚悦怡，无异味果香、酒香不怡人，有异味，使人厌恶9～10 7～8 0～6 22～30 11～21 0～10
续表
项目 评分标准 评分/分口感（40分）整体印象（20分）酒体丰满平衡，醇厚，舒服爽口，余味悠长酒体平衡，酒质柔顺，柔和爽口，余味较长酒体欠平衡，略寡淡，粗糙，余味一般酒体不平衡，较单薄，余味不良典型完美，优雅无缺典型明确，风格良好有典型性，不够怡雅34～40 21～33 10～20 0～9 17～20 7～16 0～6
1.3.3 数据处理
利用Excel2010对数据进行基本处理，通过SPSS 27.0对数据进行单因素方差分析、相关性分析，应用Origin 2021软件绘图。
2 结果与分析
2.1 不同非酿酒酵母组酒样酒精发酵结束后基本理化指标分析
不同非酿酒酵母组酒样酒精发酵结束后基本理化指标测定结果见表2。
表2 不同处理酒样酒精发酵结束后基本理化指标
Table 2 Basic physicochemical indicators of wine samples with different treatments after alcohol fermentation
注：同行肩标字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
基本指标 CK CA PA NA酒精度/%vol总酸/（g·L-1）总糖/（g·L-1）还原糖/（g·L-1）pH值挥发酸/（g·L-1）游离SO2/（mg·L-1）总SO2/（mg·L-1）10.87±0.12a 4.06±0.14cd 3.05±0.45a 0.97±0.03bc 3.92±0.06b 0.52±0.12b 26.13±4.89a 69.33±0.92b 9.80±0.20c 6.41±0.42a 2.17±0.12c 1.01±0.07b 3.83±0.10cd 0.25±0.03c 18.67±2.44b 46.93±2.44c 10.67±1.01ab 5.62±0.25b 2.82±0.24bc 1.31±0.07a 4.09±0.16a 0.51±0.08bc 27.73±4.89a 88.53±7.39a 10.07±0.46b 4.34±0.06c 2.92±0.47b 0.96±0.05bcd 3.90±0.01bc 0.62±0.12a 26.13±4.89a 85.33±5.14ab
由表2可知，各酒样的基本理化指标均符合GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的标准。CA、PA、NA组酒样总酸含量分别为6.41 g/L、5.62 g/L、4.34 g/L，较CK组分别提升57.88%、38.42%、6.90%，与CK组相比，CA、PA组差异显著（P＜0.05），NA组差异不显著（P＞0.05）。可能是在酒精发酵阶段非酿酒酵母作用产生有机酸[13]。一些非酿酒酵母菌种类改善酒的组成成分和酿酒酵母的发酵行为，增加了葡萄酒的总酸，在与酿酒酵母的混合发酵中，非酿酒酵母能够促进许多化合物的释放，增强葡萄酒香气的复杂性[14]。CA、PA、NA组酒样总糖含量均显著低于CK组（P＜0.05）。CA组的还原糖提升3.96%，酒精度、总糖、挥发酸、pH、游离SO2、总SO2分别下降9.84%、28.85%、51.92%、2.30%、28.55%、32.31%，均显著低于CK组（P＜0.05）。这可能是菌株CT10表现出独特的酿酒特性，与酿酒酵母结合使葡萄糖和果糖的乙醇产量低[15]。非酿酒酵母在高糖浓度下具有生长的能力和亲果性[16]。这说明不同类型的非酿酒酵母中，CT10非酿酒酵母的增酸能力与降低酒精度、挥发酸的能力最佳，与酿酒酵母CECA混菌发酵可提升干红葡萄酒的酸度，改善品质。
2.2 不同非酿酒酵母组酒样陈酿阶段总酸含量变化
酿酒酵母和非酿酒酵母菌株混菌发酵能够增加酒体中甘油、总酸、挥发性酯类物质含量，降低乙酸含量[17]。酸度作为葡萄酒感官品质的重要组成部分，会对葡萄酒的风味、颜色和香气等产生影响[18]。生物增酸是最广泛的一种增酸方法，利用产酸型非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵增加酸度，通过增加甘油、总酸、挥发性酯类含量，降低乙酸含量，形成稳定的吡喃花青素等，进而改善酒的整体品质[19]。由图1可知，不同处理组酒样的总酸含量随陈酿时间的延长呈上升趋势。PA、NA、CA组的总酸均高于CK组，其中CA处理组的总酸显著高于CK组（P＜0.05）。说明添加非酿酒酵母能提升葡萄酒总酸的含量。可能是因为非酿酒酵母CT10产生较高的乳酸，使总酸浓度上升，对葡萄酒的感官特征和总酸度有积极影响[20]。这与OGBONNA N D等[21]的研究结果相似。
图1 不同处理酒样陈酿阶段总酸含量变化
Fig.1 Changes in total acid content of wine samples with different treatments during aging
2.3 不同非酿酒酵母组酒样陈酿阶段游离SO2含量变化
由图2可知，不同处理组酒样的游离SO2随着陈酿时间的延长总体呈降低趋势。与CK组相比，非酿酒酵母处理组的游离SO2含量降低。与CK相比，在陈酿7 d时CA处理组的游离SO2含量下降16.98%，在陈酿14 d时CA处理组的游离SO2含量下降34.97%。CA处理组的游离SO2的含量显著低于CK组（P＜0.05），说明添加非酿酒酵母可以降低葡萄酒游离SO2的含量并减少用量。可能是葡萄酒贮存期间所需的游离二氧化硫含量与葡萄酒的pH值相关，有机酸的相对浓度直接影响葡萄酒的pH，影响了葡萄酒中SO2的平衡反应，特别是游离态和分子态SO2的含量[22]。GARCÍA M J F等[23]研究发现一些非酿酒酵母产生的有机酸是一种良好的抗氧化剂，能减少二氧化硫的用量。
图2 不同处理酒样陈酿阶段游离SO2含量变化
Fig.2 Changes in free SO2 content of wine samples with different treatments during aging
2.4 不同非酿酒酵母对干红葡萄酒颜色的影响
由图3A可知，与CK组相比，CA组酒样的色度显著提升2.49%（P＜0.05）；色调显著降低15.48%（P＜0.05）。色调越低说明葡萄酒的酒体越红。有机酸的相对浓度影响不同形式花色苷之间的平衡转换，从而影响红葡萄酒颜色的稳定性[24-25]。由图3B可知，在AF结束时CA处理组的L*值、a*值、b*值显著高于CK组（P＜0.05），L*值、b*值与CK组相比分别提升8.51%、9.77%。说明CA处理组葡萄酒的亮度最高，添加非酿酒酵母CT10能提升葡萄酒颜色亮度，能明显改善葡萄酒的色泽。在红葡萄酒发酵过程中，酵母可以通过增色效应酸化来增加葡萄酒花青素的颜色[26]。通过对非酵母菌研究发现，耐热克鲁维酵母菌株在发酵过程中通过强烈增加葡萄酒的酸度对花青素的颜色和随后的稳定性产生强烈影响[27]。
图3 不同非酿酒酵母对葡萄酒色度色调（A）及L＊值、a＊值、b＊值（b）的影响
Fig.3 Effect of different non-Saccharomyces on chroma and hue (A)and L＊, a＊, b＊ value (B) of wine
2.5 不同非酿酒酵母对葡萄酒酚类物质含量的影响
酵母自溶产物能增加颜色和多酚稳定性[28]。研究结果表明，酵母不仅可以吸附花青素，还可以吸附乙烯酚类花青素。此外，共接种和顺序发酵实验表明，顺序发酵产生了更高浓度的乙烯酚类吡喃花青素[29]。
由图4A、图4B可知，随着陈酿时间的延长，不同处理组酒样的总酚、单宁总体呈上升趋势，且CA处理组的酒样均显著高于CK组（P＜0.05）。陈酿14d时，与CK组相比，CA处理组的总酚含量提升64.91%，单宁含量提升40.03%。说明添加非酿酒酵母CT10增加了葡萄酒颜色物质的生成，改善了葡萄酒的色泽。非酿酒酵母产生的有机酸相对浓度能影响酚类化合物在陈酿储存期间的氧化、聚合或缩合反应，改善红葡萄酒的颜色稳定性[30-31]。
图4 不同处理酒样的总酚（A）及单宁（B）含量
Fig.4 Total phenols (A) and tanin (B) contents in wine samples with different treatments
2.6 感官评价
不同处理酒样的感官评价结果见表3。由表3可知，CA组酒样的总分（86.70分）显著高于其他三组（P＜0.05）。其中香气、口感、整体印象均显著高于其他组（P＜0.05），外观略低于PA组，但差异不显著（P＞0.05）。说明菌株CT-10产生的有机酸改善了干红葡萄酒的口感并且提升了酒的品质。这与荆思思等[32]的研究结果相似。
表3 不同处理酒样的感官评分比较
Table 3 Comparison of sensory scores of wine samples with different treatments
样品编号 外观/分 香气/分 口感/分 整体印象/分 总分/分CK CA PA NA 8.18±1.08b 9.13±0.70ab 9.73±0.37a 7.93±0.09c 21.62±3.71d 27.98±1.01a 25.84±2.19b 23.41±1.58c 28.88±1.20b 32.34±4.71a 21.65±2.72d 26.56±1.46c 12.28±3.49c 17.24±0.82a 16.53±1.42b 16.45±0.69bc 70.96±3.63c 86.70±4.63a 73.75±4.41bc 74.35±2.66b
3 结论
通过添加不同类型非酿酒酵母对葡萄酒的基本指标、总酸变化、颜色物质、酚类物质进行分析，非酿酒酵母CT10对干红葡萄酒的有明显的增酸作用，与CK组相比总酸、色度总酚、单宁、感官评定总分分别增加了57.88%、2.49%、64.91%、40.03%、22.18%。结果表明非酿酒酵母CT10与酿酒酵母CECA混菌发酵的作用最佳，能明显增加葡萄酒的酸度与总酚的含量，提升了葡萄酒的色泽并改善了酒的品质。这为下一步非酿酒酵母结合其他工艺对葡萄酒品质的改善提供了理论参考。添加非酿酒酵母对葡萄酒颜色物质影响需要进一步深入研究。
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