我国食醋多以谷物酿醋，酿造历史悠久，由于酿造工艺和原料不同造成食醋风味有所差异[1]。谷物醋经过发酵不但保留了谷物本身的营养价值，同时生成了大量生物活性成分，如有机酸、多酚、氨基酸、植物甾醇、矿物质、糖类和四甲基吡嗪等[2-3]。已知这些功能性化合物不仅可提升醋的风味，且现代科学研究已证明其在预防和治疗人类疾病中发挥重要作用[4]，如抗氧化、抑菌、抗肿瘤、控制血压和抗炎等作用[5-8]。
山西老陈醋作为谷物醋的代表，凭借精湛的酿制过程及独特的熏醅和陈酿工艺位于四大名醋（山西老陈醋、镇江香醋、保宁醋、永春老醋）之首，独树一帜的酿造技艺酿制出的老陈醋不仅风味独特、品质优良，还具有良好的生物活性。山西老陈醋可调节血糖和血脂[9]，其多酚提取物可以缓解氧化应激和炎症反应[10]，熏醅工艺有利于提高老陈醋的抗氧化活性[11]。
多糖具有显著的免疫调节活性，在食品和医药领域有较好的开发价值[12]。张祥龙[13]研究表明，山西老陈醋中的含糖大分子单糖组成丰富，由10种单糖组成，主要成分为甘露糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，且具有免疫调节功能。本实验以山西老陈醋为原料，采用乙醇沉淀法提取多糖，采用单因素及响应面试验优化山西老陈醋多糖（Shanxi aged vinegar polysaccharide，SAVP）提取条件，对粗多糖进行脱蛋白、脱色、透析、层析柱分离纯化，并通过红外光谱对分离纯化后的多糖结构进行了初步鉴定、并进行了分子质量、单糖组成及热重分析。旨在为山西老陈醋多糖生物活性的进一步研究奠定基础，并有助于山西老陈醋保健机理的进一步阐明。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
山西老陈醋：山西紫林醋业股份有限公司。
1.1.2 化学试剂
葡萄糖、无水乙醇、苯酚、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；牛血清蛋白（纯度≥98%）：美国Roche公司；葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、核糖、甘露糖醛酸、古罗糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸（均为色谱纯）：美国Sigma公司；葡聚糖标准品（纯度＞98%）：北京Solarbio公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
HC-3018R高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；RV8旋转蒸发仪：艾卡仪器设备有限公司；Nicolet iS20傅里叶变换红外光谱仪、ICS-5000离子色谱、DionexTM CarboPacTM PA20（150 mm×3.0 mm，10 μm）色谱柱：美国赛默飞公司；TGA2热重分析仪：瑞士Mettler公司；Ifinite 200 Pro酶标仪：帝肯（上海）贸易有限公司；ALPHA 2-4 LD plus冻干机：德国Christ公司；DEAE-52纤维素层析柱（2.6 cm×30 cm）、葡聚糖凝胶G-100层析柱（1.6 cm×60 cm）：北京Solarbio公司；TSK-GMPWXL色谱柱（7.8 mm×300 mm，10 μm）：日本Tosoh公司。
1.3 方法
1.3.1 粗多糖提取
利用旋转蒸发仪将山西老陈醋在50 ℃条件下真空浓缩至原质量的1/2，向老陈醋浓缩物中加入一定体积无水乙醇于4 ℃下静置，并通过离心收集沉淀，经冷冻干燥（-70 ℃，12 h）后制得粗多糖。
1.3.2 多糖含量测定
多糖含量测定采用苯酚-硫酸法[14]。以葡萄糖质量浓度（x）和吸光度值（y）分别为横、纵坐标绘制标准曲线，得到葡萄糖标准曲线回归方程为：y=7.433 6x-0.002 4，相关系数R2=0.999 4。按照葡萄糖标准曲线回归方程计算样品中多糖含量，山西老陈醋多糖提取量计算公式如下：
式中：Y为多糖提取量，mg/g；m为1 mL山西老陈醋稀释液中多糖质量，mg；V为多糖提取液总体积，mL；n指稀释倍数；V1为吸取稀释液体积，mL；M为原料质量，g。
1.3.3 多糖提取条件优化
（1）单因素试验
选取醇沉时间（8 h、12 h、16 h、20 h、24 h）、乙醇溶液添加量为多糖溶液的倍数（1、2、3、4、5倍）和乙醇体积分数（75%、80%、85%、90%、95%）这3个单因素进行试验，分别考察其对山西老陈醋粗多糖提取量的影响。
（2）响应面试验
以单因素试验结果为依据，以乙醇体积分数（A）、醇沉时间（B）、乙醇倍数（C）作为自变量，以山西老陈醋多糖提取量（Y）作为响应值，采用Box-Behnken中心组合试验设计的原理，进行3因素3水平的响应面试验。响应面试验因素与水平见表1。
表1 提取条件优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for extraction conditions optimization
水平 A 乙醇体积分数/% B 醇沉时间/h C 乙醇倍数-1 01 85 90 95 12 16 20 345
1.3.4 粗多糖分离纯化
（1）脱蛋白
Sevag法：冻干后的粗多糖配制成8 mg/mL的溶液，取粗多糖溶液40 mL 加入1/4体积的Sevag试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V），振荡30 min后离心（6 000 r/min，10 min）取上清液，重复多次至中间无明显乳状层。
TCA[16]法：冻干后的粗多糖配制成8 mg/mL的溶液，取40 mL粗多糖溶液加入8 mL TCA液（4 mol/L），4 ℃静置过夜后离心（8 000 r/min，10 min），收集上清液。
Sevag-TCA法：用TCA法得到的上清液继续用Sevag法处理。
比较上述粗多糖脱蛋白方法，计算蛋白去除率和多糖保留率。蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250法[15]。以牛血清蛋白质量浓度（x）和吸光度值（y）分别为横、纵坐标绘制标准曲线，得到牛血清蛋白标准曲线方程为y=0.004 2x+0.011 5，相关系数R2=0.995 2。蛋白质去除率及多糖保留率计算公式如下：
式中：A1、A2分别代表脱蛋白前后多糖溶液中的蛋白质含量，mg/g；B1、B2分别代表蛋白去除前后多糖溶液中的多糖含量，mg/g。
（2）脱色
活性炭法：将活性炭用蒸馏水清洗并过滤，烘干至恒质量。取经脱蛋白后多糖溶液添加2%的活性炭于55 ℃水浴搅拌2 h，收集上清液。
AB-8大孔树脂法：取200 mL经脱蛋白处理后的多糖溶液，向其中加入2%的AB-8大孔树脂，45 ℃恒温摇床中200 r/min匀速振荡1.5 h，收集上清液。
硅藻土法[17]：振荡条件为45 ℃恒温摇床中200 r/min匀速振荡1.5 h，收集上清液。
比较上述方法，计算脱色率和多糖保留率。脱色率及多糖保留率计算公式如下：
式中：C1、C2分别代表脱色前后多糖溶液吸光度值；D1、D2分别代表脱色前后多糖溶液中的多糖含量，单位mg/g。
（3）透析
经过脱蛋白、脱色处理的粗多糖溶液经浓缩后装入处理好的透析袋（截留分子质量3 500 Da）中，蒸馏水透析36 h，期间更换3次蒸馏水。透析后经浓缩、冷冻干燥得精多糖。
（4）柱层析
DEAE-52纤维素柱层析[18]：将10 mL精多糖溶液（精多糖加蒸馏水配制为10 mg/mL溶液）上样至处理好的DEAE-52纤维素层析柱（2.6 cm×30 cm）中，以蒸馏水和0.1 mol/L、0.3 mol/L、0.5 mol/L的NaCl溶液作为洗脱液依次洗脱，调节流速为2.5 mL/min，每管收集6 mL，并采用苯酚-硫酸法测定每管稀释后的吸光度值，绘制洗脱曲线。
Sephadex G-100柱层析：将SAVP-1（经DEAE-52柱层析分离收集得到的组分）配制成质量浓度为6mg/mL的溶液，经微孔滤膜（0.45μm）过滤，上样至处理好的SephadexG-100凝胶柱中，用超纯水洗脱，流速为0.4 mL/min，每管收集3 mL，利用苯酚-硫酸法测定每管多糖含量。根据洗脱峰收集纯化后多糖组分，冷冻干燥（-50 ℃，12 h）后备用。
1.3.5 SAVP-1结构鉴定
（1）分子质量测定
采用高效凝胶色谱法[19]测定SAVP-1分子质量。配制不同分子质量的葡聚糖标准品溶液经滤膜过滤后进样，以保留时间（retention time，RT）（x，min）为横坐标，分子质量的对数值（y，lg Mw）为纵坐标绘制葡聚糖标准曲线，根据标准曲线回归方程计算SAVP-1分子质量。色谱条件：TSKGMPWXL色谱柱；柱温为35 ℃；流动相为超纯水；流速1 mL/min；进样量20 μL。
（2）红外光谱分析
称取1 mg SAVP-1和100 mg KBr研细均匀后压片，将样片放入红外光谱仪中测试，波数范围4 000～400 cm-1。
（3）单糖组成分析
单糖组成测定参考方法[20]并稍作修改。称取5.06 mg SAVP-1，加入1mL2 mol/L三氟乙酸溶液，加热（121 ℃，2 h）。通氮气，吹干后，加入甲醇清洗，再吹干（重复2次）；加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。离子色谱条件：采用DionexTM CarboPacTM PA20色谱柱（150 mm×3.0 mm，10 μm）；进样量5 μL；流速0.5 mL/min；柱温30 ℃；流动相A：水；流动相B：0.1mol/LNaOH，流动相C：0.1mol/LNaOH和0.2mol/LNaAc。
（4）热重分析
称取10 mg 纯化后多糖组分SAVP-1，载气为氮气（N2），升温范围设为30～800 ℃，升温速率设为10 ℃/min 进行热重分析。
1.3.6 数据处理
试验进行3次重复，采用Design-Expert 8.0.6进行响应面试验设计和数据分析、Origin 8.0软件作图。
2 结果与分析
2.1 多糖提取条件优化
2.1.1 单因素试验结果
由图1a可知，多糖提取量随乙醇体积分数逐渐增大，多糖提取量呈现先升高后降低的趋势。当乙醇体积分数为75%～90%时，多糖提取量随之增加；当乙醇体积分数为90%时，多糖提取量最大，为13.94 mg/g；当乙醇体积分数＞90%之后，多糖提取量随之下降。由于乙醇可降低水的介电常数，在多糖溶液中加入乙醇后可产生沉淀，当乙醇体积分数过小时只能析出部分多糖，体积分数过大时会导致体系中多糖量减少，不利于多糖饱和析出[21]。因此，最适乙醇体积分数为90%。由图1b可知，当醇沉时间为8～16 h时，多糖提取量的增幅较大；当醇沉时间为16 h时，多糖提取量最大，为10.69 mg/g；当醇沉时间＞16 h之后，多糖提取量趋于平缓。时间过短使多糖溶液和乙醇接触不充分，随时间延长可能会沉降出蛋白、淀粉等物质。因此，最适醇沉时间为16 h。由图1c可知，随着乙醇倍数在1～4倍的范围内增加，多糖提取量随之增加；当乙醇倍数为4倍时，多糖提取量最大，为9.22 mg/g；当乙醇倍数＞4倍之后，多糖提取量变化不明显。因此，最适乙醇添加量为多糖溶液的4倍。
图1 提取条件优化单因素试验结果
Fig.1 Results of single factor experiments for extraction conditions optimization
2.1.2 响应面试验结果
在单因素试验基础上，以乙醇体积分数（A）、醇沉时间（B）、乙醇倍数（C）作为自变量，以山西老陈醋多糖提取量（Y）作为响应值，采用Box-Benhnken试验设计的原理，进行3因素3水平的响应面试验。响应面试验设计结果见表2，方差分析结果见表3。
表2 提取条件优化Box-Behnken试验设计与结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments design for extraction conditions optimization
试验号 A 乙醇体积分数 B 醇沉时间 C 乙醇倍数Y 多糖提取量/（mg·g-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0-1-1 0 0 -1 0 1 -0 0 0 -1-1 0 0 0 -1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 -1 0 0 1 --1 1-1 11 12 13 14 15 16 17 1 0 0 1 0 0 1 -1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 9.86 16.19 16.07 9.26 13.89 13.63 9.75 14.25 13.65 14.11 16.25 13.81 16.23 16.32 14.35 14.21 10.30
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型A BC A B******AC BC A2 B2 C2残差失拟项绝对误差总和94.28 32.12 0.36 0.078 0.19 0.087 0.012 48.59 4.73 4.02 0.10 0.068 0.034 94.38 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6 10.48 32.12 0.36 0.078 0.19 0.087 0.012 48.59 4.73 4.02 0.015 0.023 8.520E-003 717.10 2 198.82 24.73 5.34 13.25 5.96 0.83 3 326.63 323.71 275.27＜0.000 1＜0.000 1 0.001 6 0.054 1 0.008 3 0.044 7 0.393 0＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1*********2.67 0.183 5不显著
采用Design-Expert 8.0.6软件对表2试验数据进行拟合分析得到二次多项回归方程为：
由表3可知，该响应面模型的P值＜0.01、失拟项P=0.183 5＞0.05，说明该模型具有很强的显著性，失拟项不显著说明模型与实际情况能较好地拟合。模型的决定系数R2为0.998 9，调整决定系数R2adj为0.997 5，表明该模型拟合度高。根据P值大小可知，一次项A、B、交互项AB、二次项A2、B2、C2对多糖提取量影响极显著（P＜0.01），交互项AC对结果影响显著（P＜0.05），一次项C、交互项BC对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，各因素对山西老陈醋多糖提取影响程度由大到小为：A（乙醇体积分数）＞B（醇沉时间）＞C（乙醇倍数）。
2.1.3 交互作用分析
响应曲面图中的曲面陡峭程度与因素对多糖提取量的影响大小有关[22]。各因素间交互作用对结果影响的响应面及等高线见图2。由图2可知，随着乙醇体积分数和醇沉时间的增加多糖提取量先升高后降低，随乙醇体积分数变化呈现的幅度较大，两因素对提取量的交互作用影响显著；当其他条件不变时，乙醇体积分数与乙醇倍数所得到的3D图曲面偏陡，在乙醇体积分数为89%～91%范围内和乙醇倍数为4倍附近时多糖提取量逐步增到最大值；在醇沉12～20 h、乙醇倍数3～5倍区间内，提取量变化量不大，曲面平缓。这与方差分析结果一致。
图2 各因素间交互作用对多糖提取量影响的响应面及等高线
Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the extraction amount of polysaccharides
2.1.4 验证试验
经Design-Expert 8.0.6软件优化得到的最优多糖提取条件为乙醇体积分数91.47%、醇沉时间16.27 h、乙醇倍数4.07倍。在此条件下，多糖提取量理论值为16.52 mg/g。结合实际操作可行性，将多糖提取条件修正为：乙醇体积分数91%、醇沉时间16.3 h、乙醇倍数4倍。该条件下进行3次平行验证试验，多糖提取量实际值为16.48 mg/g，与理论值接近，表明该模型有效。
2.2 脱蛋白处理
以蛋白去除率和多糖保留率为评价指标筛选出最优脱蛋白方法，结果如图3所示，Sevag法虽脱除率较高，但需重复多次，费时且试剂损耗量较大；Sevag-TCA法同TCA法相比，多糖保留率无差异，但TCA法蛋白去除率仅为52.32%。故选用Sevag-TCA法进行脱蛋白处理，不仅可减少试验次数且脱除效果好，其蛋白去除率为74.65%，多糖保留率为77.87%。
图3 粗多糖脱蛋白方法比较
Fig.3 Comparison of deproteinization methods of crude polysaccharide
字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.3 脱色处理
由图4可知，多糖溶液使用活性炭法处理后其多糖损失率显著高于另外两种方法（P＜0.05），是由于活性炭在吸附色素同时也会吸附多糖；硅藻土法脱色效果不佳，且本身不易处理；大孔树脂法对多糖溶液进行脱色处理，其脱色率为64.02%，多糖保留率为84.55%，故选择大孔树脂法进行脱色处理，其优点是吸附效果好，操作简便[23]。
图4 粗多糖脱色方法比较
Fig.4 Comparison of decolorization methods of crude polysaccharide
2.4 柱层析
2.4.1 DEAE-52柱层析
将经过脱蛋白、脱色、透析后得到的山西老陈醋精多糖过DEAE-52纤维素柱，洗脱曲线如图5所示，得到三个对称的洗脱峰，即用蒸馏水、0.1 mol/LNaCl和0.3 mol/LNaCl洗脱得到的三种多糖组分A、B、C，分别命名为：多糖组分SAVP-1、多糖组分SAVP-2、多糖组分SAVP-3。后续实验针对含量最多的多糖组分SAVP-1继续研究。
图5 山西老陈醋精多糖DEAE-52纤维素柱洗脱曲线
Fig.5 Elution curve of refined polysaccharide in Shanxi aged vinegar with DEAE-52 cellulose column
2.4.2 葡聚糖柱层析
多糖组分SAVP-1经Sephadex G-100凝胶柱层析洗脱，洗脱曲线如图6所示，得到的曲线单一并较为对称色谱峰，表明SAVP-1是纯的多糖组分。
图6 山西老陈醋多糖组分AVP-1Sephadex G-100色谱柱洗脱曲线
Fig.6 Elution curve of polysaccharide fraction SAVP-1 in Shanxi aged vinegar with Sephadex G-100 chromatographic column
2.5 多糖组分SAVP-1结构鉴定
2.5.1 分子质量测定
经计算得到重均分子质量Mw对数值（lgMw）-保留时间（RT）的葡聚糖标准曲线回归方程为：y=-1.100 4x+14.181，相关系数R2=0.998 4。对山西老陈醋多糖组分SAVP-1进行分子质量检测，得到色谱图结果见图7。由图7可知，洗脱峰单一且对称，根据标准曲线回归方程计算得山西老陈醋多糖组分SAVP-1的分子质量为6.87 kDa。
图7 山西老陈醋多糖组分SAVP-1高效凝胶色谱图
Fig.7 High efficiency gel chromatogram of polysaccharide fraction SAVP-1 in Shanxi aged vinegar
2.5.2 红外光谱分析
由图8可知，多糖组分SAVP-1在波数3387.54cm-1处有宽而高的吸收峰，是由羟基伸缩振动引起，在波数2 930.35 cm-1处的吸收峰是烷烃C-H的伸缩振动所致，均为糖类物质的特征吸收峰。波数1 668.05 cm-1处的吸收峰由羧基官能团中的C═O的拉伸引起[24]，在波数1 400.64 cm-1处的吸收峰是由于C-H弯曲振动引起；在波数1 152.35 cm-1、1 078.59 cm-1和1 026.84 cm-1存在三个吸收峰，是由于醚键（C-O-C）和羟基（-OH）的伸缩振动引起，说明SAVP-1具有吡喃环结构[25]；在波数839.94 cm-1处的吸收峰说明糖苷键为α-D-吡喃糖苷键，同时在波数575.399 cm-1处存在α-糖苷键的特征吸收峰[26]，表明多糖组分SAVP-1为α-型多糖。
图8 山西老陈醋多糖组分SAVP-1红外光谱图
Fig.8 Infrared spectrogram of polysaccharide fraction SAVP-1 in Shanxi aged vinegar
2.5.3 单糖组成
混合单糖标准品和多糖组分SAVP-1离子色谱分析结果见图9。由图9可知，多糖组分SAVP-1中含有的单糖包括鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖，其主要成分为葡萄糖。并通过计算得其摩尔比分别为0.36∶6.53∶3.09∶71.86∶13.97∶4.2。
图9 单糖混标（a）和山西老陈醋多糖组分SAVP-1（b）离子色谱图
Fig.9 Ion chromatograms of monosaccharide mixture standards (a) and polysaccharide fraction SAVP-1 in Shanxi aged vinegar (b)
1.岩藻糖；2.鼠李糖；3.阿拉伯糖；4.半乳糖；5.葡萄糖；6.木糖；7.甘露糖；8.果糖；9.核糖；10.半乳糖醛酸；11.古罗糖醛酸；12.葡萄糖醛酸；13.甘露糖醛酸。
2.5.4 热重分析
山西老陈醋多糖组分SAVP-1热重分析结果见图10。由图10可知，第一阶段是室温至136 ℃，样品质量损失率为12%，主要是由多糖分子中水分丢失引起；第二阶段是136～579 ℃，质量损失率为61.21%，该阶段可能是由于多糖组分SAVP-1的结构和化学键遭到破坏导致质量损失率达到最大，在255.83℃热质量损失率达到最大；第三阶段579～800℃质量损失率下降程度平缓，最终质量损失率达到78.6%，第二、三阶段质量损失和多糖结构解聚和热分解相关[27]。综上所述，多糖组分SAVP-1在136 ℃下热稳定性较好。
图10 山西老陈醋多糖组分SAVP-1热重分析
Fig.10 Thermogravimetric analysis of polysaccharide fraction SAVP-1 in Shanxi aged vinegar
3 结论
本研究通过单因素及响应面试验优化对山西老陈醋粗多糖提取条件，确定最适提取条件为乙醇体积分数91%，醇沉时间16.3 h，乙醇倍数4倍。在此优化条件下，粗多糖提取量为16.48 mg/g。使用Sevag-TCA法蛋白去除率为74.65%，使用大孔树脂法脱色操作简便且脱色率可达60.02%。初步纯化得到的精多糖通过DEAE-52纤维素柱洗脱后得到3个多糖组分SAVP-1、SAVP-2及SAVP-3，SAVP-1又经葡聚糖柱层析进一步纯化用于初步结构鉴定。SAVP-1具有多糖特征吸收峰，为α-型多糖，分子质量为6.87 kDa，其主要单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡糖糖、木糖和甘露糖，摩尔比分别为0.36∶6.53∶3.09∶71.86∶13.97∶4.2，其中葡萄糖含量最高。热重分析表明其热稳定性较好。该研究为进一步研究山西老陈醋多糖体外功能活性奠定了基础，有助于揭示山西老陈醋保健功效。
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