颜色是消费者判定葡萄酒品质的重要指标,影响葡萄酒颜色的主要因素是葡萄果皮中的花色苷[1]。花色苷是许多植物中最大的水溶性色素群[2],由于甲基化水平不同及结构的改变,影响着黄烷醇聚集物等化合物的稳定性和颜色特征[3],从而使植物呈现出红、橙、蓝、紫等鲜艳的色彩[4]。花色苷作为葡萄酒中一种重要的酚类物质,除了对葡萄及葡萄酒的色泽、风味具有重要影响外,也具有重要的营养价值[5-6]。葡萄中的花色苷是以C6-C3-C6骨架为基本结构,由糖苷键将花色素和糖连接在一起而形成的黄酮多酚类化合物[7-8]。葡萄和葡萄酒中的花色苷主要包括飞燕草素、矢车菊素、矮牵牛素、芍药素和锦葵素[9],通常以糖苷形式存在,但也可以通过与不同的酸进行酯化而以酰化形式存在[10-11]。研究表明[12],欧亚种葡萄中锦葵素类花色苷(malvidin,Mv)含量最高,一般不含花葵素类花色苷(pelargonidin,Pg)。植物中花色苷的含量除了受植物激素[13-14]、环境(光、热、水)[15-16]和栽培措施[17-19]等外部因素的影响,主要还受内部遗传基因的调控[20-21],不同品种花色苷含量和组分存在较大差异,从而使葡萄及葡萄酒的颜色有所差异。宁夏贺兰山东麓是我国最重要的优质葡萄酒产区,本试验采用高效液相色谱质谱(high performance liquid chromatographymass spectrometry,HPLC-MS)法,通过研究8个品种红葡萄及以其作为原料酿制的葡萄酒中花色苷的组分构成及含量差异,旨在选育着色优良的酿酒葡萄,以期为优质酿酒葡萄新品种选育及优质干红葡萄酒酿造提供理论依据。
1.1.1 材料
赤霞珠(Cabernet Sauvignon)、黑比诺(Pinot Noir)、马尔贝克(Malbec)、马瑟兰(Marselan)、西拉(Syrah)、品丽珠(Cabernet Franc):宁夏中粮长城天赋酒庄葡萄基地;北冰红(Beibinghong)、蛇龙珠(Cabernet Gernischet):宁夏西鸽酒庄葡萄基地。不同品种葡萄均于2016年定植,单篱架厂字型整形方式,株行距1.0 m×3.5 m,水平叶幕,常规管理。于浆果生理成熟期随机在10个果穗上共采集200个果粒,放入冰盒带回实验室立即置于-80 ℃的低温冰箱中保存备用;同时每个品种采集6 kg果实,用于单品种酿造实验。
1.1.2 化学试剂
甲醇(色谱纯)、碳酸钠、福林酚、甲基纤维素、硫酸铵、氯化钾、乙酸钠、亚硝酸钠、氯化铝、氢氧化钠(均为分析纯):天津科密欧化学试剂有限公司;甲酸、乙腈(均为色谱纯):德国Merck公司;儿茶素(纯度>98%):美国Sigma公司。
PAL-HIKARi 5手持糖度计:日本Atago公司;FD5-2.5E冷冻干燥机:美国SIM公司;5804R离心机:德国Eppendorf公司;UV-1800紫外-可见分光光度计、LC-2030型岛津高效液相色谱仪:日本Shimadzu公司;CR-400手持色差计:日本Konica Minolta公司。
1.3.1 干红葡萄酒的制备
选取无霉烂生青的红葡萄6 kg,除梗破碎后导入5 L广口玻璃瓶中,加入6%亚硫酸(葡萄醪中游离SO2含量为120 mg/L),按100 mg/L(1∶10,溶解于净水中)的标准加入红葡萄酒果胶酶,搅拌均匀。将玻璃瓶密封,低温放置24 h后按400 mg/L添加酿酒酵母。发酵开始后保持发酵罐温度在20~25 ℃,每天监测3次、记录比重及温度,每天压帽3次使皮渣充分浸渍,持续操作至发酵开始后5~7 d。发酵过程中,当检测的葡萄醪液的比重为0.993~0.996且连续2 d不再变化,同时测定原酒残糖含量(<2 g/L),即可终止发酵。按葡萄酒中游离SO2含量为20~25 mg/L量加入6%的亚硫酸并进行皮渣分离,过滤掉酒中的果皮及沉淀物,将酒液转移至玻璃瓶内,封闭玻璃瓶,在冰桶中放置,低温澄清3~4 d,取上清酒液,得到干红葡萄酒。取每个品种葡萄酒酒样转入100 mL装样瓶、每品种3个重复,置于4 ℃冷藏。
1.3.2 分析检测
(1)葡萄酒CIELAB颜色参数
葡萄酒色泽测定使用手持色差计,以纯水作为参比,每个酒样重复3次,测定颜色参数L*值、a*值、b*值。根据CIE制定的表色系统评价葡萄酒色泽,并依据文献[22-23]中的计算公式得到色泽饱和度(chroma,C*)和色度角(hue angle,h)的值。
(2)果实基础理化指标测定
可溶性固形物含量:采用手持糖量计测定;可滴定酸含量:采用酸碱滴定法测定[24];pH值:使用台式数显酸度计测定。
(3)葡萄酒常规理化指标的测定
参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定葡萄酒pH、总酸(以酒石酸计)、挥发酸(以乙酸计)、酒精度等指标,均重复3次。
(4)葡萄果皮及葡萄酒花色苷含量及组分的测定
总花色苷的提取液制备参考文献[25],葡萄果皮及葡萄酒的总花色苷含量(以二甲基花翠素-3-葡萄糖苷计):采用pH示差法测定;葡萄果皮和葡萄酒中单体花色苷的提取和测定方法参考李小龙等[26]的方法。
1.3.3 数据处理
所有分析数据均以3次重复,结果以“平均值±标准差”表示。使用IBM.SPSS.V20进行数据统计分析以及多重比较,P<0.05表示差异显著;利用Excel 2021,Origin 2023进行绘图。
2.1.1 葡萄果实基本理化指标
不同品种葡萄理化指标测定结果见表1。葡萄中可溶性固形物含量是判断葡萄成熟度的重要指标之一。
表1 不同品种红葡萄果实的基本理化指标
Table 1 Basic physicochemical indexes of red grape with different varieties
注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。
品种 可溶性固形物/% 可滴定酸含量/(g·L-1) pH值赤霞珠马瑟兰西拉美乐北冰红品丽珠蛇龙珠媚丽25.80±0.00c 28.03±0.06a 22.33±0.12f 25.60±0.00d 24.80±0.00e 27.00±0.00b 22.37±0.06f 21.00±0.00g 7.66±0.29c 8.22±0.11b 7.91±0.11bc 6.84±0.19d 10.84±0.22a 8.16±0.19b 5.72±0.19e 5.16±0.19f 3.47±0.01d 3.44±0.0le 3.57±0.01b 3.76±0.01a 3.14±0.00f 3.55±0.01c 3.75±0.00a 3.49±0.01d
由表1可知,供试8个酿酒红葡萄品种成熟果实的可溶性固形物及可滴定酸含量存在显著差异(P<0.05),其中可溶性固形物含量为21.00%~28.03%,可滴定酸含量5.16~10.84 g/L。采收期葡萄果实可溶性固形物含量>17%、滴定酸含量在6.5~8.5 g/L时,酿造的葡萄酒才能获得更适宜的平衡度和口感[27-28]。蛇龙珠和媚丽葡萄的可滴定酸含量较低,北冰红的可滴定酸含量较高,其他品种葡萄的糖酸含量均在加工葡萄酒的适宜范围,果实pH值在3.14~3.76之间,各品种间具有差异但变化范围较小。赤霞珠、马瑟兰和品丽珠采收期果实糖酸含量均较高,适宜酿造优质葡萄酒。
2.1.2 葡萄酒基本理化指标
不同品种红葡萄制备葡萄酒理化指标测定结果见表2。由表2可知,供试8个品种红葡萄制备葡萄酒的酒精度、pH、挥发酸等常规理化指标符合国标GB/T 15037—2006《葡萄酒》的要求。花色苷结构在不同pH下产生变化,从而导致葡萄酒的颜色具有差异性,高琛瑜等[29]认为pH值为3.5的葡萄酒酒体以红色调为主,随着pH值升高,酒体逐渐呈现蓝紫色调;而刘霞等[30]认为,花色苷辅色效应在pH值为3.0左右时最强,随着pH值增大辅色效应逐渐减弱。各品种间pH值存在显著差异,其中美乐和蛇龙珠葡萄酒的pH值显著高于其他酒样(P<0.05),北冰红葡萄酒的pH值显著低于其他酒样(P<0.05),为3.23±0.01。酒精度影响着葡萄酒从果皮中提取花色苷的能力及其在酒样中的稳定性,与葡萄酒的色彩饱和度具有正相关性。除西拉、蛇龙珠和媚丽外,其余酒样的酒精度在14.13%vol~15.87%vol,其中马瑟兰葡萄酒的酒精度最高,其可滴定酸含量也较高,为(0.67±0.02)g/L。赤霞珠和马瑟兰葡萄酒的酒精度、pH值以及酸度均较高,葡萄酒颜色更深,酒样在陈酿过程中颜色稳定性更强。
表2 不同品种红葡萄制备葡萄酒的基本理化指标
Table 2 Basic physicochemical indexes of wines prepared by red grape with different varieties
品种 酒精度/%vol pH值 可滴定酸/(g·L-1) 挥发酸/(g·L-1)赤霞珠马瑟兰西拉美乐蛇龙珠媚丽北冰红品丽珠14.81±0.04b 15.87±0.04a 11.22±0.10g 14.46±0.04c 11.93±0.10f 12.07±0.02e 14.13±0.04d 14.51±0.04c 3.77±0.01d 3.79±0.02c 3.55±0.01f 3.86±0.01a 3.83±0.00b 3.79±0.01c 3.23±0.01g 3.68±0.01e 6.14±0.08b 5.57±0.01c 6.09±0.01b 5.43±0.29c 5.19±0.02d 4.95±0.02e 8.31±0.04a 5.39±0.01c 0.63±0.02c 0.67±0.02b 0.54±0.02d 0.46±0.01e 0.46±0.02e 0.48±0.02e 0.86±0.03a 0.56±0.03d
CIELAB参数可从色度、色调及明暗等方面综合反映葡萄酒的颜色状况[31],8个品种红葡萄制备干红葡萄酒由CIELAB色空间法测定的颜色特征参数,结果见表3。由表3可知,L*值、a*值、b*值分别代表光泽明亮度、红绿色调、黄蓝色调,不同品种葡萄酒的L*值、a*值、b*值、C*值及h值存有显著差异(P<0.05)。美乐、媚丽、品丽珠葡萄酒的明亮度较高、颜色较浅,而赤霞珠、马瑟兰、西拉葡萄酒颜色较深。a*值>0表示酒样的红色程度,其数值越大则红色调越强,b*值同理表示黄色调。8个品种葡萄制备干红葡萄酒a*值为22.27~59.13,b*值为6.53~39.54,表明葡萄酒均偏向于红黄色调,其中北冰红葡萄酒的红黄色调显著高于其他品种(P<0.05),马瑟兰酒样蓝紫色调较高,与前文pH值结果相对应。C*值代表了色彩鲜艳度,其值越高则色彩越鲜艳,色调角h表示酒样色彩的倾向。马瑟兰葡萄酒的C*值显著低于其他品种,而北冰红葡萄酒的C*值显著高于其他品种(P<0.05),其值为98.67。其余6个品种酒样的C*值集中在66.30~78.47,色彩较为鲜艳,西拉和蛇龙珠的C*值较低,与前文结果一致,但马瑟兰的C*同样较低,其酒精度却显著高于其他品种(P<0.05)。按陈晓艺等[32]颜色参数测定结果表明,马瑟兰、媚丽和品丽珠的h值在10~20°之间,为胭脂红色,其他品种酒样均为宝石红色。这与本研究结果不一致,可能是马瑟兰酒样的pH值较高使得酒样中花色苷结构发生变化。从葡萄酒的颜色参数指标结果来看,赤霞珠和西拉的酒样颜色较深且色彩较鲜艳,着色表现较好。
表3 不同品种红葡萄制备葡萄酒的颜色参数
Table 3 Colour parameters of wines prepared by red grape with different varieties
品种 L*值 a*值 b*值 C*值 h 值/°赤霞珠马瑟兰西拉美乐蛇龙珠媚丽北冰红品丽珠13.09±0.06f 12.52±0.01g 12.85±0.05gf 47.04±0.07b 18.58±0.04d 52.34±0.07a 26.05±0.05c 46.88±0.03b 44.41±0.05f 22.27±0.06g 44.36±0.11f 48.84±0.05e 50.92±0.05d 51.39±0.09c 59.13±0.08a 54.71±0.03b 22.45±0.09d 6.53±0.01h 21.88±0.04e 28.89±0.11b 27.52±0.03c 18.51±0.03f 39.54±0.07a 14.67±0.03g 66.91±0.06e 28.82±0.05f 66.30±0.06e 77.78±0.09c 78.47±0.03b 69.88±0.03d 98.67±0.05a 69.37±0.01d 26.50±0.02d 16.21±0.02f 26.15±0.01d 30.37±0.03b 28.23±0.01c 19.49±0.02e 33.46±0.04a 15.07±0.12g
2.3.1 不同品种红葡萄果皮单体花色苷种类及含量的差异
不同品种红葡萄果皮中9种重要花色苷单体含量(包括未甲基化、甲基化、未酰化、乙酰化、反式香豆酰化花色苷)测定结果见表4。由表4可知,马瑟兰果皮单体花色苷总量显著高于其他品种(P<0.05),而媚丽、美乐果皮单体花色苷总含量接近,显著低于其他供试品种(P<0.05)。不同品种果皮中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量最高,这与杨晓慧等[33]研究结果一致,其中马瑟兰果皮二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷显著高于其他品种(P<0.05),二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷在葡萄果皮成色中发挥重要作用,因此马瑟兰作为原料的葡萄酒颜色较深,与前文结果一致。
表4 不同品种红葡萄果皮花色苷单体种类及含量
Table 4 Anthocyanin monomer types and contents in pericarp of red grape with different varieties mg/g
花色苷单体 赤霞珠 马瑟兰 西拉 美乐 蛇龙珠 媚丽 北冰红 品丽珠花翠素-3-O-葡萄糖苷花青素-3-O-葡萄糖苷甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷甲基花青素-3-O-葡萄糖苷二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷非酰化花色苷含量及比例/%甲基花青素-3-O-(6'-O-乙酰化)-葡萄糖苷二甲花翠素-3-O-(6'-O-乙酰化)-葡萄糖苷甲基花青素-3-O-(6'-O-反式对香豆酰化)-葡萄糖苷二甲花翠素-3-O-(6'-O-反式对香豆酰化)-葡萄糖苷酰化花色苷含量及比例/%总含量2.69±0.02e 0.31±0.00g 2.17±0.02f 2.02±0.06e 24.68±0.94c 31.87±1.04d/60.30 0.34±0.13ef 3.55±0.06d 0.98±0.02d 16.11±0.07a 20.98±0.28a/39.70 52.85±1.32c 3.94±0.05c 0.41±0.00d 3.80±0.04c 2.91±0.03d 35.33±0.29a 46.39±0.41a/69.63 0.39±0.00de 4.24±0.02a 0.88±0.02e 14.72±0.17b 20.23±0.21b/30.37 66.62±0.62a 4.60±0.01a 0.78±0.00c 5.15±0.00a 3.88±0.00c 27.07±0.01b 41.48±0.02b/69.81 0.69±0.00b 3.66±0.04c 1.68±0.01a 11.91±0.03f 17.94±0.08d/30.19 59.42±0.10b 3.01±0.06d 1.42±0.02b 2.75±0.05d 4.88±0.09b 14.94±0.28f 27.00±0.50e/70.94 0.69±0.02b 1.87±0.06e 1.37±0.01b 7.13±0.14g 11.06±0.23f/29.06 38.06±0.73f 2.43±0.04f 0.34±0.00e 2.42±0.04e 1.92±0.02f 24.60±0.28c 31.71±0.38d/64.39 0.46±0.01cd 3.55±0.04d 0.76±0.01f 12.77±0.22d 17.54±0.28e/35.61 49.25±0.66d 4.28±0.01b 8.10±0.01a 3.85±0.01b 5.83±0.05a 17.12±0.03e 39.18±0.11c/87.28 3.62±0.05a 1.63±0.02f 0.13±0.00g 0.33±0.00h 5.71±0.07g/12.72 44.89±0.18e 2.42±0.06f 0.32±0.00f 1.77±0.03h 1.84±0.05g 20.15±0.09d 26.50±0.23e/58.88 0.48±0.00c 3.81±0.02b 0.03±0.00h 14.19±0.02c 18.51±0.04c/41.12 45.01±0.27e 1.91±0.02g 0.26±0.00h 1.82±0.01g 1.60±0.01h 26.48±0.07b 32.07±0.11d/64.62 0.25±0.05f 3.83±0.08b 1.06±0.04c 12.42±0.10e 17.56±0.27e/35.38 49.63±0.38d
花色苷的稳定性与其成分组成有较强的相关性,研究表明[34],葡萄和葡萄酒的着色程度与甲基化花色苷占比具有正相关性。由图1可知,8个品种红葡萄果皮花色苷甲基化程度较高,葡萄果皮中花色苷的非酰化程度大于酰化程度,马瑟兰、西拉果皮中花色苷的甲基化程度显著高于其他品种(P<0.05),赤霞珠、马瑟兰果皮中花色苷的酰化程度显著高于其他品种(P<0.05),3种葡萄原料对于葡萄酒颜色的增强具有更显著的作用。8个供试品种花翠素类花色苷占比均显著较高,与已有文献报道一致[33],马瑟兰的花翠素类花色苷含量占比最高,达到了93.11%,而美乐和媚丽葡萄果皮中花翠素类花色苷含量占比显著低于其他品种(P<0.05),特别是媚丽葡萄酒中花翠素类花色苷仅含量占比有60.61%,其原料不适于酿造颜色较深的葡萄酒,与前文结果一致。马瑟兰、赤霞珠和西拉葡萄果皮中单体花色苷总量高、花翠素类花色苷占比高且花色苷修饰化程度高,适用于加工着色较深的葡萄酒。
图1 不同品种红葡萄果皮中花色苷单体含量占比
Fig.1 Proportion of anthocyanin monomer contents in pericarp of red grape with different varieties
2.3.2 不同品种红葡萄制备葡萄酒花色苷单体种类及含量的差异
不同品种红葡萄制备葡萄酒花色苷单体种类及含量测定结果见表5。
表5 不同品种红葡萄制备的葡萄酒花色苷单体种类及含量
Table 5 Anthocyanin monomer types and contents in wines prepared by red grape with different varieties mg/L
花色苷单体 赤霞珠 马瑟兰 西拉 美乐 蛇龙珠 媚丽 北冰红 品丽珠花翠素-3-O-葡萄糖苷花青素-3-O-葡萄糖苷甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷甲基花青素-3-O-葡萄糖苷二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷非酰化花色苷含量及比例/%甲基花青素-3-O-(6'-O-乙酰化)-葡萄糖苷二甲花翠素-3-O-(6'-O-乙酰化)-葡萄糖苷23.66±3.55d 18.20±0.18b 20.20±0.37c 42.34±1.92b 334.34±10.51c 438.74±16.53c/64.59 22.16±1.19c 169.78±3.20b 29.16±0.90c 12.81±0.77c 27.17±1.22a 66.57±31.28a 519.94±24.38a 655.65±58.55a/70.40 35.01±0.43a 170.71±5.48b 35.74±2.17b 22.94±1.90a 22.81±1.25b 39.95±2.31b 455.90±9.01b 577.34±16.64b/68.12 25.29±2.63b 201.59±11.48a 46.74±4.09a 12.21±1.06c 16.14±0.46e 39.69±0.34b 235.34±13.36e 350.12±19.31e/74.26 6.90±0.03e 71.77±1.24d 29.66±2.45c 11.91±1.14c 17.98±0.34d 37.46±2.00b 355.16±3.60c 452.17±9.53c/72.91 15.37±2.80d 110.32±1.61c 13.58±0.38e 6.73±1.75d 9.76±0.75g 31.31±1.47b 133.55±7.50f 194.93±11.85f/84.25 4.14±0.00e 10.86±1.64e 22.49±5.03cd 4.14±0.00e 15.54±1.88e 29.86±11.02b 294.08±0.76d 366.11±18.69e/74.59 4.14±0.00e 70.06±8.22d 15.77±0.50e 6.02±0.39de 12.57±0.12f 20.93±1.48b 334.71±6.73c 390.00±9.22d/66.66 13.26±2.25d 114.04±0.74c
续表
花色苷单体 赤霞珠 马瑟兰 西拉 美乐 蛇龙珠 媚丽 北冰红 品丽珠甲基花青素-3-O-(6'-O-反式对香豆酰化)-葡萄糖苷二甲花翠素-3-O-(6'-O-反式对香豆酰化)-葡萄糖苷酰化花色苷含量及比例/%总含量22.58±0.19d 40.60±0.79a 28.87±1.34c 18.33±0.95e 26.93±0.32c 9.51±1.62f 37.72±2.14b 6.03±0.08g 26.04±0.25b 240.56±4.83b/35.41 679.30±21.36c 29.34±0.11b 275.66±6.81a/29.60 931.31±65.36a 14.5±0.67c 270.25±16.12a/31.88 847.59±32.76b 24.34±0.60b 121.34±2.82e/25.74 471.46±22.13f 15.35±0.05c 167.97±4.78d/27.09 620.14±14.31d 11.92±5.89c 36.43±9.15f/15.75 231.36±21.36g 12.80±8.65c 124.72±19.01e/25.41 490.83±37.70f 61.77±2.88a 195.10±5.95c/33.34 585.10±15.17e
由表5可知,8个品种红葡萄酒的单体花色苷组分与其果皮中的结果一致。媚丽葡萄酒中的单体花色苷总量最低,为(231.36±21.00)mg/L,马瑟兰、西拉、赤霞珠等葡萄酒的单体花色苷总量最高,分别为(931.31±65.36)mg/L、(847.59±32.76)mg/L、(679.30±21.36)mg/L,这一结果同葡萄果皮中单体花色苷含量结果一致。
由图2可知,8个品种红葡萄酒中花色苷甲基化程度、酰化程度与葡萄果皮中表现一致,所有品种的甲基化程度较高,酰化程度较低,赤霞珠、马瑟兰、西拉葡萄酒中花色苷的甲基化程度及酰化程度显著高于其他品种(P<0.05)。8个供试品种红葡萄酒中花翠素类花色苷占比较高,与果皮中结果表现一致,不同品种红葡萄酒中单体花色苷含量占比结果与果皮中一致,赤霞珠、马瑟兰和西拉葡萄酒中单体花色苷含量显著高于其他品种(P<0.05),且三种酒样中花翠素类花色苷占比高、花色苷修饰程度高,从而使三种葡萄酒着色更深。
图2 不同品种红葡萄制备葡萄酒中花色苷单体含量占比
Fig.2 Proportion of anthocyanin monomer contents in wines prepared by red grape with different varieties
马瑟兰和赤霞珠采收期葡萄的糖酸含量较高,适宜于加工口感优良的葡萄酒,同时赤霞珠和马瑟兰葡萄酒的酒精度、pH值以及酸度均较高,葡萄酒颜色在陈酿过程中的稳定性更强。对不同品种红葡萄果皮及酒样的花色苷分析结果表明,马瑟兰、赤霞珠和西拉葡萄及其酿制的葡萄酒中主要的9种单体花色苷的总量及花色苷修饰程度显著高于美乐和媚丽葡萄酒。葡萄酒的着色程度与葡萄和葡萄酒中花色苷组分及含量相对应,马瑟兰、赤霞珠和西拉葡萄酒的亮度低、着色深,其果皮中花翠素含量显著高于其他供试品种,尤其是二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷。马瑟兰、赤霞珠和西拉葡萄果皮和葡萄酒花色苷含量高、着色好,适用于加工颜色深的葡萄酒,且葡萄酒颜色在陈酿过程中稳定性更高,可作为着色优良的酿酒葡萄品种。
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Analysis of anthocyanin composition in different red grape varieties and wine from the eastern foot of Helan Mountain