龙眼（Dimocarpus longan Lour.）属于无患子科（Sapindaceae Juss.）植物，主要分布在我国南部及西南部地区，是广西、广东、福建、海南等地的主要栽培果树之一[1]。龙眼的营养价值高，有“南方人参”之称，其肉为白色，味甘、性平、无毒，具有抗菌、抑癌、降脂护心、增强记忆力及延缓衰老等功效[2]。近年来，关于龙眼品质的国内研究报道较多，张义[3]对不同地区、不同品种的龙眼汁香气成分进行研究，确定反式-罗勒烯、D-柠檬烯、γ-松油烯和乙醇这4种主要的挥发性物质是龙眼中的香气活性物质，这对采摘后龙眼的深加工处理提供了有利的参考价值，为龙眼香气成分的研究奠定了基础。高蓓[4]优化了采用固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）法检测龙眼汁香气成分的条件，同时分析了不同品种龙眼汁香气成分以及它们和呈味物质的相关性，结果表明，糖、酸主要与萜烯类和醇类物质呈现一定的相关性。
果酒可以提高水果营养成分的利用率及附加值。目前对龙眼果酒的研究报道集中在龙眼果酒的风味物质、生产工艺及抗氧化活性等方面。邱松山等[5]采用二氯甲烷萃取龙眼酒中的香气成分，利用气相色谱-质谱联用（gas chro matography-mass spectrometry，GC-MS）鉴定出龙眼酒中含有49种挥发性物质，主要风味物质有2,3-丁二醇、苯乙醇、乙酸乙酯；姚荣清等[6]采用正交试验法优选出龙眼酒最佳发酵条件为发酵温度21 ℃，接种量0.20 g/L，糖度25%，柠檬酸添加量6 g/L，发酵时间10 d；冉娜等[7]研究表明，不同酵母对龙眼酒质量有不同影响，酵母性状的好坏直接影响果酒的口感和风味；何思莲等[8]研究表明，发酵能够促使龙眼中的活性成分更好地溶出，增加果酒中的抗自由基能力，提高机体免疫机能；刘佳艺等[9]研究发现，龙眼酒经过发酵后，具有良好的抗氧化能力，能有效清除2,2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate），ABTS）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基并展现出较高的还原能力。因此，分析不同酵母发酵果酒的香气成分，筛选出关键性香气成分，对优化发酵工艺、提高果酒品质具有重要的参考意义，也能够为龙眼果酒的生产和加工提供一定的技术和理论基础。
本研究以新鲜龙眼为原料，选用了三种不同酵母进行发酵，采用顶空固相微萃取（head space-solid-phase microex traction，HS-SPME）富集酿造的龙眼果酒中的香气成分，利用气相色谱-质谱法（GC-MS）对其香气成分进行定性定量分析，结合相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）筛选关键性香气成分，以明确不同酵母酿造的龙眼果酒的香气品质特征，探究不同酵母所产生的香气品质差异形成的物质基础，以期为不同酵母酿造龙眼果酒品质的化学判别、感官评价及龙眼果酒香气品质形成机理等研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
龙眼：市售；酿酒酵母（LABA、L-EL、CRI）：安琪酵母股份有限公司；柠檬酸、蔗糖：天津市富宇精细化工有限公司；氢氧化钠标准溶液：天津市大茂化学试剂厂；无水乙醇、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、盐酸：西陇科学股份有限公司；冰乙酸、葡萄糖：广州化学试剂厂；酚酞、氯化钠：天津市福晨化学试剂厂。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
7890A-5977A气质联用仪：安捷伦科技有限公司；1300 SERIES A2净化工作台：赛默飞世尔科技有限公司；ZHWY-2102C恒温摇床培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SCM-1000手持糖度折光仪：韩国HM公司；SPME萃取头（DVB/CAR/PDMS）：美国Supelco公司；PHS-3E酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 龙眼果酒酿造工艺流程及操作要点
操作要点：挑选龙眼，用清水清洗，去壳去核后切块打浆，以水与龙眼果浆的比例为1∶1加水，添加白砂糖将发酵醪总糖提高至22%，同时加入4 g/L柠檬酸调至pH5.0，巴氏杀菌（90 ℃水浴20 min），冷却至25 ℃左右。将0.15 g LABA、CRI和L-EL酿酒酵母分别溶于3 mL 5%蔗糖溶液中，于30 ℃、120 r/min恒温摇床中培养30 min活化，得到酵母活化液，然后将酵母活化液接种至龙眼果浆中进行主发酵（25 ℃、5 d），然后进行后发酵（20 ℃、25 d），发酵完成后分离酒脚得原酒，加入0.6 g/L的皂土澄清龙眼果酒，硅藻土过滤，自然陈酿3个月，即得龙眼果酒成品。
1.3.2 龙眼果酒香气成分分析
龙眼果酒香气成分采用HS-SPME-GC-MS进行分析[5]。
取15 mL的龙眼果酒于30 mL样品瓶中，加入5 g NaCl，用聚四氟乙烯-硅胶隔垫加盖密封，40 ℃平衡15 min，然后将老化（270 ℃，1 h）的DVB/CAR/PDMS萃取头插入样品瓶，顶空萃取45 min，搅拌速率300 r/min。
气相色谱条件：DB-23色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度270 ℃，不分流进样，45 s后打开分流，分流比10∶1，流速20 mL/min。程序升温为35 ℃保持3 min，然后以3 ℃/min的速率升高至205 ℃，保留5 min。
质谱条件：采用电子电离（electronic ionization，EI）源，溶剂延迟4.9～8.0 min，离子源温度为230 ℃，传输线温度为240 ℃。
定性定量分析：将化合物与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）数据库检索识别时，选择化合物匹配度＞50，确定化合物保留时间。定量分析采用峰面积归一法计算各成分的相对百分含量。
1.3.3 龙眼果酒香气成分相对气味活度值计算与评价
采用相对气味活度值（ROAV）评价挥发性成分对龙眼果酒香气体系的贡献度[10]。ROAV计算公式如下：
式中：ROAVi为某一香气组分的相对气味活度值；Ci为某一香气组分的相对含量，%；Cmax为香气体系中贡献最大组分的相对含量，%；Ti为该组分的香气阈值；Tmax为香气体系中贡献最大组分的香气阈值。
所有挥发性成分ROAV≤100，对于某一种确定组分，ROAV越大，则该物质对龙眼果酒香气体系贡献度越大。ROAV≥1的化合物为关键香气成分，0.01≤ROAV＜1.00为修饰香气成分，ROAV＜0.01为潜在香气成分[10]。
1.3.4 理化指标的检测
总酸、总糖、酒精度、总酯：按照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[11]进行测定。
1.3.5 数据处理
对GC-MS Chemistry Station工作站采集到的原始数据采用Masshunter Qualitative Analysis软件进行分析，利用SPSS Statistics 25.0进行邓肯单因素方差分析（P＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 不同酵母发酵龙眼果酒理化指标检测结果
由表1可知，龙眼果酒主发酵的总酸含量（8.60～8.62 g/L）、酒精度（8.12%vol～11.77%vol）均低于后发酵的总酸含量（8.66～8.91 g/L）、酒精度（11.20%vol～11.95%vol）。相反，龙眼果酒主发酵的总糖含量高于后发酵。由此可知，随着龙眼果酒发酵时间的延长，果酒中总酸、酒精度不断增加；而龙眼果酒中总糖含量不断减少。因为糖在发酵过程中会转化成酒精，故主发酵的总糖含量比后发酵的总糖含量高，不同发酵阶段的总糖含量是判断龙眼果酒发酵程度的重要依据。随着发酵程度的加深，CRI消耗糖的速度加快，同时酒精度升高的速度也加快。与其他2种酵母相比，CRI酿酒酵母发酵更为彻底，产酒精能力较强，更适合龙眼果酒的发酵。
表1 LABA、CRI、L-EL酵母发酵的龙眼果酒理化指标检测结果
Table 1 Determination results of physicochemical indexes of longan fruit wine fermented by yeast LABA, CRI, L-EL
指标总酸/（g·L-1）酒精度/%vol总糖/%总酯/（mg·L-1）主发酵LABA CRI 8.60±0.17a 11.77±0.23a 0.64±0.13a 1 070.92±0.54b 8.62±0.16a 9.51±0.65b 0.14±0.42b 1 176.61±0.33a L-EL 8.62±0.22a 8.12±0.15c 0.15±0.10b 998.03±0.37c后发酵LABA CRI L-EL 8.66±0.54a 11.95±0.36a 0.61±0.27a 1 254.38±0.13b 8.91±0.31b 11.84±0.55a 0.12±0.19b 1 536.64±0.32a 8.88±0.12a 11.20±0.11b 0.13±0.33b 1 177.26±0.67c
2.2 不同酵母发酵龙眼果酒中的香气成分分析
由表2可知，LABA酵母发酵果酒共检出挥发性成分32种，其中，酯类12种、醇类4种、醛类3种、烯类1种、酸类2种、醚类1种，其他类9种；CRI酵母发酵果酒共检出挥发性成分43种，其中，酯类14种、醇类5种、醛类5种、烯类1种、酸类3种、醚类1种，其他类14种；L-EL酵母发酵果酒共检出挥发性成分39种，其中，酯类14种、醇类4种、醛类3种、酸类1种、醚类3种，其他类14种。3种龙眼果酒中含量最高的香气成分为醇类和酯类，其次为醚类和酸类，最少的为烯类。3种酵母发酵的龙眼果酒中，酯类种类最为丰富，醇类含量最为丰富。3种酵母发酵果酒中共同含有的酯类物质分别是正己酸乙酯、3-己烯酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、水杨酸甲酯和苯乙酸乙酯；共同含有的醇类物质分别是异丁醇、苯乙醇；共同含有的醛类物质是苯甲醛；共同含有的酸类物质是乙酸；共同含有的醚类物质是二乙二醇乙醚。果酒中大部分醇类、酯类和醛类等香气成分是通过酵母发酵产生的，这些香气成分在发酵过程中不断富集，互相调和，从而形成了果酒独特的风味[19]。CRI酵母发酵果酒挥发性风味物质的种类最丰富（43种），其酯类物质含量最高（1 536.64 mg/L）。
表2 LABA、CRI、L-EL酵母发酵的龙眼果酒主要香气成分分析
Table 2 Analysis of main aroma components in longan fruit wine fermented by yeast LABA, CRI, L-EL
序号 化合物 保留时间/min 香气描述相对含量/%LABA CRI L-EL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0.17±0.34/酯类硝基乙酸叔丁酯乙酸异丁酯丁酸乙酯丙酸甲酯正己酸乙酯戊酸乙酯3-己烯酸乙酯十六碳四烯酸乙酯庚酸乙酯辛酸乙酯氨基苯甲酸肉桂酯苯甲酸甲酯苯甲酸乙酯癸酸乙酯丁二酸二乙酯5.671 8.990 10.294 19.718 20.628 20.805 23.060 23.071 25.148 29.320 29.915 34.166 36.501 36.816 38.160/// /果香[12]带菠萝底香蕴的果香[13]强烈的果香和酒香香气，并有苹果、菠萝、香蕉样的香气[5]苹果香[14]11 12 13 14 15 8.75±0.32a/0.07±0.11c 0.61±0.12/20.83±0.45a 0.13±0.22 0.13±0.28a 0.36±0.45a 1.98±0.42a 0.89±0.25a 0.14±0.21a 0.16±0.22a 0.05±0.25 3.16±0.28c/0.25±0.22b/0.12±0.33a 5.83±0.54c/0.06±0.32b 0.17±0.56c 0.33±0.57b 0.70±0.27b 0.22±0.32a 0.22±0.12a/4.84±0.23b 0.05±0.03 0.37±0.13a/0.09±0.12a 9.39±0.56b/0.08±0.27b 0.26±0.22b 0.46±0.34b 0.83±0.29a有菠萝香气味[13]具有白兰地酒香味[13]具香脂膏香、水果香气[15]有橙花及葡萄糖香气和甜味[15]蜂蜜，花香，洋槐花香，玫瑰花香[16]果香和酒香，梨和白兰地似的香韵[13]水果香，花香，花粉香[16]
续表
注：同行不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），“/”表示未检出。
序号 化合物 保留时间/min 香气描述相对含量/%LABA CRI L-EL 16 17 18 19 38.469 39.150 41.067 49.209//乙基-9-癸烯酸酯水杨酸甲酯苯乙酸乙酯十四酸异丙酯小计醇类异丁醇异戊醇正戊醇2-（2-亚甲基环丙基）乙醇蘑菇醇庚醇3-氨基-2-吩嗪醇苯乙醇小计醛类甘油缩甲醛巴豆醛丙烯醛糠醛苯甲醛苯乙醛4-苯基丁醛小计烯类1,3-戊二烯1,4-戊二烯小计酸类乙酸（3-氧代-1,2-苯并噻唑-2-基）乙酸N-乙酰-DL-苯丙氨酸肉桂酸小计醚类二乙二醇乙醚三乙二醇单乙醚4-羟基-3-叔丁基-苯甲醚0.93±0.42a 0.73±0.52a/35.58 0.36±0.22c 0.32±0.32b 0.08±0.34 11.73 0.37±0.08 0.51±0.32b 0.41±0.28b/18.10具有冬青叶香味[15]发酵香、花香、蜂蜜香[16]12345678 1234567 12 1234 123 8.635 14.923 14.935 25.406 26.258 26.607 35.505 42.709 0.29±0.42c/40.05±1.45 2.30±1.01a 有醇油、酒精气味[14]酒香和果香[17]// /// /清香带甜的薰衣草[15]水蜜桃香，水果香，花香[16]0.16±1.23 7.40±0.67a 47.90 1.80±0.32b 34.99±1.22/0.64±1.43/0.05±1.56b/6.66±0.76b 44.14 0.10±1.37 0.10±1.1a/7.11±0.88a 9.61具微弱玫瑰香味[5]8.783 10.037 22.024 27.346 30.979 36.546 41.891//甜香，花香[18]0.09±1.52 0.72±1.04a 3.65±1.78a// / ///坚果香[16]杏仁香，坚果香[16]玫瑰，花香[18]4.46 0.14±0.45 0.11±0.56/0.09±1.50b 2.64±1.67b 0.04±1.04a/3.02 2.40±1.89b 0.04±1.08a 0.55±1.77 2.99 25.412 25.511 0.58±1.86/0.58/1.10±1.67 1.10//19.264 26.473 50.516 52.916 3.37±1.56c 0.56±0.29 8.05±0.76a//// /3.93 5.66±0.89b/0.25±0.62 0.98±0.82 6.89 8.05 33.516 32.730 49.545 3.49±0.45b 23.43±0.66a 具有中等令人愉快的气味[15]////小计其他类小计3.49 23.43 0.24±1.22c 0.36±1.89 0.11±1.70 0.71 3.86 8.97 58.29
2.2.1 醇类分析
醇类成分是龙眼果酒中重要的风味物质，主要来源于糖类的分解代谢以及氨基酸的脱羧、脱氨反应[20]。3种龙眼果酒中检出8种醇类物质，其中2种为共有醇类物质，分别为异丁醇和苯乙醇。异丁醇有醇油和酒精的气味，是酒中主要的风味物质[21]，苯乙醇有蜂蜜、玫瑰和丁香花的香味[12]，在果酒中起到增香增甜及调和的作用[22]。LABA酵母发酵果酒产生的醇类成分相对含量为47.90%；CRI酵母发酵果酒产生的醇类成分相对含量为44.14%；L-EL酵母发酵果酒产生的醇类成分相对含量仅为9.61%，适宜浓度的醇类物质可以衬托酯香，对香气的协调性有促进作用，是龙眼果酒中含量最多的香气成分。其中，CRI酵母发酵果酒产生的异戊醇含量最高，相对含量为34.99%，为龙眼果酒带来更加丰富的酒香和果香。
2.2.2 酯类分析
酯类成分是龙眼果酒中最丰富的香气成分，LABA酵母发酵果酒产生的酯类有12种，相对含量为35.58%；CRI酵母发酵果酒产生的酯类有14种，相对含量为11.73%；L-EL酵母发酵果酒产生的酯类有14种，相对含量为18.10%，其中乙酯类成分居多。一般认为，在酵母脂肪酸代谢过程中产生的脂酰辅酶A醇解后产生部分脂肪酸乙酯，如丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯等[23]。含有酯类物质种类多的果酒，其风味也较丰富；酯类风味物质含量越多，其果香和花香就越浓郁。酯类物质可以增加酒体的香味，有助于酒体形成浓郁厚重的风味[24]，酸味影响果酒的口感，果酒中适量的酸类物质可以使酒有清新感和爽口感，没有酸味的果酒品尝起来口味比较平淡[25]。在检测到的酯类成分中，丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯等都是广泛应用于食品加工行业的食用香料，丁酸乙酯具有菠萝香蕴的果香气味，己酸乙酯具有菠萝-香蕉香型的气味，苯甲酸甲酯具有橙花及葡萄糖香气和甜味，苯甲酸乙酯具有令人愉悦的水果香气，苯乙酸乙酯具有花香及蜂蜜香气味。
2.2.3 醛类分析
3种龙眼果酒检测出醛类成分共有7种，分别是甘油缩甲醛、巴豆醛、丙烯醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛和4-苯基丁醛。CRI酵母发酵的龙眼果酒中醛类成分为5种，其余2种酵母发酵的龙眼果酒中醛类成分均为3种，其中苯甲醛为三种酵母在发酵过程中形成的共有醛类物质。一般认为醛类物质的产生主要来源于发酵过程中各种代谢途径，其中包括糖代谢、脂肪酸代谢以及氨基酸代谢等。
2.2.4 其他类分析
3种龙眼果酒检测出其他类成分主要有酚类、醛酮类、呋喃类等，共同含有的4种物质分别是萘、1-甲基萘、2-甲基萘、1-（1-乙氧基乙氧基）戊烷。其中萘和1-甲基萘有温和芳香气味；2-甲基萘和1-（1-乙氧基乙氧基）戊烷有令人愉快的气味。
2.3 不同酵母发酵龙眼果酒中主要酯类成分的ROAV分析
挥发性风味物质对食品总体风味的贡献依赖其浓度和阈值共同决定[30]，果酒中挥发性风味物质对酒体气味有直接影响的物质主要是酯类物质[31]。3种酵母酿造龙眼果酒中的主要酯类成分的ROAV见表3。由表3可知，L-EL酵母酿造的龙眼果酒中关键香气成分（ROAV≥1）有3种，分别是己酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯；CRI酵母酿造的龙眼果酒中关键香气成分（ROAV≥1）有7种，分别是丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、水杨酸甲酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯；LABA酵母酿造的龙眼果酒中关键香气成分（ROAV≥1）有6种，分别为丁酸乙酯、己酸乙酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯。其中共有的关键香气成分为辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、己酸乙酯，而辛酸乙酯在3种龙眼果酒中对总体风味的贡献度最大。与LABA和L-EL这两种酵母相比，CRI酵母酿造的龙眼果酒中多了水杨酸甲酯和苯乙酸乙酯这2种关键香气成分，水杨酸甲酯具有冬青叶香味，苯乙酸乙酯具有发酵香、花香和蜂蜜香，这两种香气的结合丰富了龙眼果酒醇正淡雅的特性，由此可知CRI酵母酿造的龙眼果酒香气层次更加丰富，赋予酒体更加独特的花香和果香特征，增加了香气复杂性。
表3 LABA、CRI、L-EL酵母发酵的龙眼果酒主要酯类成分相对气味活度值分析
Table 3 Relative odor activity values of main esters in longan fruit wine fermented with yeast LABA, CRI, L-EL
注：“*”表示香气体系中贡献最大的组分。
编号 化合物 相对含量/% 阈值/（μg·kg-1）[26-29] ROAV LABA酵母CRI酵母L-EL酵母乙酸异丁酯丁酸乙酯己酸乙酯戊酸乙酯庚酸乙酯辛酸乙酯*苯甲酸甲酯苯甲酸乙酯癸酸乙酯丁二酸二乙酯乙酸异丁酯丁酸乙酯己酸乙酯庚酸乙酯辛酸乙酯*苯甲酸甲酯苯甲酸乙酯癸酸乙酯水杨酸甲酯丁二酸二乙酯苯乙酸乙酯己酸乙酯辛酸乙酯*苯甲酸甲酯苯甲酸乙酯癸酸乙酯丁二酸二乙酯水杨酸甲酯苯乙酸乙酯0.22 0.22 4.84 0.05 0.09 9.39 0.08 0.26 0.46 0.83 0.14 0.16 3.16 0.12 5.83 0.06 0.17 0.33 0.36 0.70 0.32 8.75 20.83 0.13 0.36 1.98 0.89 0.93 0.73 66.00 1.00 55.33 1.50 2.20 12.87 73.00 55.56 1 122.30 15.00 66.00 1.00 55.33 2.20 12.87 73.00 55.56 1 122.30 71.00 15.00 47.00 55.33 12.87 73.00 55.56 1 122.30 15.00 71.00 47.00 0.46 30.15 11.99 4.57 5.61 100.00 0.15 0.64 0.06 7.58 0.47 35.32 12.61 12.04 100.00 0.18 0.68 0.06 1.12 10.30 1.50 9.77 100.00 0.11 0.40 0.11 3.67 0.81 0.96
3 结论
本研究采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术分析酵母L-EL、CRI和LABA酿造龙眼果酒的香气成分，3种酿酒酵母酿造的龙眼果酒中共检出挥发性风味物质58种，包括酯类19种、醇类8种、醛类7种、烯类2种、酸类4种、醚类3种、酚类5种、醛酮类6种、呋喃类4种。结合ROAV计算，筛选出由L-EL酵母酿造的龙眼果酒中关键香气成分（ROAV≥1）有3种；由CRI酵母酿造的龙眼果酒中关键香气成分（ROAV≥1）有7种；由LABA酵母酿造的龙眼果酒中关键香气成分（ROAV≥1）有6种，其中，辛酸乙酯在3种龙眼果酒中对总体风味的贡献度最大。综合考虑，CRI酵母发酵果酒挥发性风味物质的种类最为丰富，其酯类物质含量最高，更适合酿造龙眼果酒。
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