果酒口感独特、酒精度低（酒精度一般为7%vol～18%vol），以各种新鲜水果为原料酿造而成，根据酿造工艺不同可分为发酵果酒、起泡果酒、配制果酒和蒸馏果酒[1-3]。果酒富含各类氨基酸，氨基酸除了作为重要的营养物质外，还能呈现酸、甜、苦、鲜味，用于调味、增香[4-5]。在食品加工过程中，氨基酸可被利用和转化是评价食品质量及营养价值的重要指标[6-7]。
我国是水果生产大国[8]，但在各类水果深加工方面（如果酒）还存在明显不足，与发达国家还有相当差距[9-10]。随着我国消费升级，给各类果酒带来了发展新机遇[11]。林波等[12]研究了甘蔗混合汁发酵为甘蔗果酒、醋后必需氨基酸的配比更趋合理。秦红艳等[13]评价了软枣猕猴桃发酵成果酒后的氨基酸比值系数分（score ofratiocoefficientofamino acids，SRC）升高，加工后必需氨基酸的配比更加合理，更有利于人体吸收利用。买买提依明等[14]对新疆药桑果酒营养成分研究结果表明，药桑果酒各类氨基酸的含量符合世界粮农组织和卫生组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）/世界卫生组织（World Health Organization，WHO）提供的参考蛋白模式值。陈振林等[15]研究了柿子发酵成柿子果酒后的营养价值变化发现，发酵后柿子果酒中总氨基酸含量无明显变化，但对酒体的风味和营养价值有很大影响。目前，鲜见多种水果发酵成果酒后氨基酸营养组成变化对比的相关研究报道。
本研究以4种常见水果（百香果、水蜜桃、杨梅和甜橙）为研究对象，对果汁和果酒氨基酸组成进行检测，采用数学模糊识别分析法考察4种果酒与FAO/WHO模式和全鸡蛋蛋白模式的贴近度，并以FAO/WHO必需氨基酸模式为标准，采用氨基酸比值系数法考察果酒氨基酸组成的均衡性。以期为各类水果酿造成果酒提供基于营养价值的理论依据，为拓展水果深加工方式提供思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫色百香果、水蜜桃、杨梅、甜橙：广西农垦明阳农场；RW型果酒专用酵母：安琪酵母股份有限公司；牛肉浸膏：广东环凯微生物科技有限公司；葡萄糖：常德比克曼生物科技有限公司；NaHCO3：亿龙源食品有限公司；无水柠檬酸：山东英轩实业股份有限公司；无水醋酸钠、柠檬酸、乙酸、氯化钠、盐酸、苯酚、柠檬酸钠、氢氧化钠、茚三酮：国药集团化学试剂有限公司；18种氨基酸混标（纯度＞98%）：美国Sigma公司。所用试剂均为分析纯或生化试剂。
发酵培养基：向300 mL蒸馏水中加入酵母膏1%、牛肉浸膏2%、葡萄糖2%，置于高压灭菌锅中，121 ℃高压灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
MS205D型电子分析天平：瑞士梅特勒公司；S-443D型全自动氨基酸分析仪：德国赛卡姆公司；CRM2520型微滤膜：山东博纳生物科技集团有限公司；1.0T型全自动螺旋式压榨机：河南福煦机械设备有限公司；50L RSFG型小型立式恒温发酵罐：浙江睿森机械科技有限公司；手持测糖仪（0～32%）：上海力辰邦西仪器科技有限公司；LHS-24B型手提式蒸汽压力灭菌锅、SW-DJ-2F型超净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；THZ-100型恒温培养振荡器：上海叶拓科技有限公司；pHS-3DW型pH计：绍兴市苏珀仪器有限公司；TD4型立式离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
1.3 方法
1.3.1 果酒加工工艺流程及操作要点
新鲜水果→挑选、清洗、去皮、去核后压榨→过滤→果汁→调pH→糖度调整→酵母活化→恒温发酵→倒罐、陈酿→离心、过滤→果酒成品
操作要点：
水果预处理：挑选一定数量成熟、新鲜和无腐烂的4种鲜果，去除皮、籽和核后取可食部分切碎。在室温和常压条件下，使用全自动螺旋式压榨机压榨出汁，先经过粗滤去除大部分果渣，然后在室温和0.01 MPa压力下，经孔径10 μm的微滤膜过滤，收集4种水果的澄清果汁，按照1.0∶0.5的比例分别加入无菌蒸馏水，加入柠檬酸和NaHCO3调节果汁pH值至4.0±0.1。
糖度调整：加入白砂糖调节糖度，并采用手持式测糖仪测定糖度，调节初始糖度至（25±1）°Bx。
酵母活化：向调好糖、酸的果汁体系中接入活化后的酵母母液0.15%（将RW型果酒专用酵母4.00 g接入至发酵培养基中，于28 ℃条件下恒温振荡培养60 h，即完成酵母活化，得到酵母母液）。
发酵和陈酿：将果汁倒入恒温发酵罐中，控制发酵温度21 ℃，密闭发酵8 d，主发酵期间每24 h打开排气阀门排气1次。期间检测酒体糖度，当糖度趋于稳定不再降低时，主发酵完成。倒罐，将酒样置于4 ℃冰箱，继续静置发酵10 d，进行陈酿。
离心、过滤：4 500 r/min离心20 min，收集上层酒液于储酒罐中。取离心后的果酒，在室温、压力0.01 MPa条件下，采用孔径10 μm的微滤膜进行过滤，收集过滤后的澄清酒液为果酒成品。
1.3.2 氨基酸含量的测定
氨基酸含量的测定参照国标GB/T 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》中的方法[16]。
1.3.3 模糊识别分析法[17]
在采用模糊识别方法来评价氨基酸组成的数学模型中，设U为待评价样品，即U={u1，u2，u3，u4，u5，u6，u7，u8}，u1为百香果汁，u2为百香果果酒、u3为水蜜桃汁，u4为水蜜桃果酒、u5为杨梅汁，u6为杨梅果酒，u7为甜橙汁，u8为甜橙果酒。对于每一个对象u1对应的一个模式P（ui）=（uik），i=1，2，…，7，8，k=1，2，…，7，模式中7个分量k分别表示对象ui中的7种必需氨基酸。ak为标准模式的第k种必需氨基酸含量（%），1≤k≤7，即P（a）=（ak），k=1，2，…，7，P1=（3.5，6，4，5，7，4，5.5），P2=（5.7，9.3，4.7，6.6，8.6，5.4，7），其中P1代表FAO/WHO模式、P2代表全鸡蛋蛋白模式，a1-a7分别蛋氨酸+半胱氨酸、苯丙氨酸＋酪氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸。
贴近度可以反映评价样本的蛋白质与标准蛋白的接近程度，即两者氨基酸组成的相似程度，贴近度越接近1，表明两个样本的接近程度越高。根据兰氏距离法[18]计算样本和标准模式氨基酸的贴近度U（a，u），计算如公式（1）如下：
式中：c为适当选择的常数，常数c取0.09以使计算结果处于区间[0，1]，能增加分辨度，有利于结果比较。
1.3.4 氨基酸比值系数法[19]
根据氨基酸平衡理论，利用FAO/WHO建议的必需氨基酸模式，计算样品的必需氨基酸比值（essential amino acid ratio，RAA）、氨基酸比值系数（ratio coefficient of amino acid，RC）、氨基酸比值系数分，计算公式如下：
RC＞1表示该种必需氨基酸相对过剩，RC＜1表示该种必需氨基酸相对不足，RC最小者为第一限制性氨基酸。若食物中的必需氨基酸的组成比例与标准模式中必需氨基酸一致，则RC的变异系数（coefficient of variation，CV）=0，SRC=100；RC的CV越大，SRC变小，营养价值越小[20-22]。
2 结果与分析
2.1 4种果汁及发酵后果酒的氨基酸含量分析
4种果汁和对应果酒样品的游离氨基酸含量检测结果见表1。由表1可知，果汁和果酒样品均检测到16种游离氨基酸，其中包含7种人体必需氨基酸（essential amino acid，EAA），包括苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸，9种非必需氨基酸（nonessential amino acid，NEAA）。4种果汁中氨基酸含量排在前3位的均为脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸，这也与已有文献结果较为相近[23-24]。果汁发酵为果酒后，氨基酸种类没有发生变化，但是含量变化较明显，总氨基酸（total essential amino acids，TAA）含量均下降。
表1 4种果汁和对应发酵果酒中游离氨基酸含量检测结果
Table 1 Determination results of free amino acids contents in 4 kinds of fruit juice and corresponding fermented fruit wine
注：“*”为必需氨基酸。
氨基酸种类组氨酸（His）*赖氨酸（Lys）丙氨酸（Ala）*缬氨酸（Val）酪氨酸（Tyr）谷氨酸（Glu）丝氨酸（Ser）*蛋氨酸（Met）*亮氨酸（Leu）*异亮氨酸（Ile）*苯丙氨酸（Phe）精氨酸（Arg）甘氨酸（Gly）天冬氨酸（Asp）*苏氨酸（Thr）脯氨酸（Pro）必需氨基酸（EAA）非必需氨基酸（NEAA）总氨基酸（TAA）（EAA/TAA）/%（EAA/NEAA）/%含量/（mg·100 mL-1）百香果汁 百香果水酒 水蜜桃汁 水蜜桃酒 杨梅汁 杨梅酒 甜橙汁 甜橙酒8.75 18.26 17.31 14.32 5.87 43.73 19.86 4.58 13.17 8.49 11.98 15.45 14.41 46.68 7.14 60.36 77.94 232.42 310.36 25.11 33.53 2.71 5.67 2.08 4.57 1.02 8.48 4.55 1.98 7.34 3.61 4.89 3.61 3.72 5.52 3.97 41.86 32.03 73.55 105.58 30.34 43.55 11.79 9.41 43.49 11.08 7.19 40.08 6.08 5.02 6.52 6.17 4.94 4.92 4.82 57.63 8.06 19.14 51.20 195.14 246.34 20.78 26.24 1.98 2.00 5.31 1.88 1.88 4.53 2.19 1.05 1.98 1.32 1.08 1.17 1.07 6.35 1.65 9.48 10.96 33.96 44.92 24.40 32.27 14.29 10.35 15.52 9.11 6.38 33.51 15.45 2.55 9.68 5.87 5.54 11.98 15.02 34.46 7.86 26.42 50.95 173.00 223.95 22.75 29.45 3.53 2.13 2.36 2.05 1.07 2.40 0.95 0.97 2.86 1.05 1.06 4.65 7.86 3.77 1.68 7.50 11.80 34.09 45.89 25.71 34.61 8.01 14.08 50.04 10.38 8.91 54.23 16.77 7.14 10.15 6.32 8.61 9.83 5.66 60.54 9.81 50.06 66.49 264.05 330.54 20.12 25.18 1.71 2.92 10.17 4.46 1.92 3.93 2.11 2.89 6.45 3.54 2.98 5.43 1.41 3.57 2.16 51.00 25.40 81.25 106.65 23.82 31.26
4种果汁发酵成果酒后总氨基酸含量下降幅度最大的是蜜桃汁，下降幅度接近82%（TAA从246.34 mg/100 mL降到44.92 mg/100 mL）。而百香果汁发酵前后总氨基酸下降幅度最小，下降幅度约66%（TAA从310.36 mg/100 mL降到105.58 mg/100 mL）。果汁发酵过程中，酵母会利用大量氨基酸来合成结构性和功能型蛋白质，用于合成酵母菌和合成酶类物质，因此果酒中的氨基酸总量往往会呈现大幅下降[25]。
4种果汁的EAA/TAA为20.12%～25.11%，EAA/NEAA为25.18%～33.53%。4种果酒的EAA/TAA为23.82%～30.34%，EAA/NEAA为31.26%～43.55%。根据FAO/WHO提出的理想蛋白质模式，质量较好的蛋白质其EAA/NEAA在60%以上，EAA/TAA在40%左右[26-27]，可见4种果汁和果酒均未达到理想蛋白质模型，但是对比发酵前的果汁，发酵后果酒EAA/NEAA和EAA/TAA均较高，说明果汁发酵为果酒后的蛋白质较接近理想蛋白质的要求。其中EAA/TAA和EAA/NEAA比值最高的果酒是百香果酒（EAA/TAA为30.34%，EAA/NEAA为43.55%）。说明在4种果酒中，百香果汁发酵成果酒后蛋白质相对其余3种果酒更加靠近理想蛋白质模型。
2.2 氨基酸营养价值评价
2.2.1 模糊识别法评价结果
按照模糊识别法的公式（1）计算获得待评价果汁和果酒必需氨基酸水平相当于FAO/WHO模式（P1）和全鸡蛋蛋白模式（P2）的贴近度U1和U2，结果见表2。
表2 4种果汁发酵前后必需氨基酸与两种参考模式的贴近度
Table 2 Closeness of essential amino acids to two reference modes before and after fermentation of 4 kinds of juice
样品必需氨基酸贴近度 百香果汁（u1） 百香果果酒（u2） 水蜜桃汁（u3） 水蜜桃酒（u4） 杨梅汁（u5） 杨梅酒（u6） 甜橙汁（u7） 甜橙酒（u8）U1 U2 0.89 0.81 0.94 0.87 0.88 0.79 0.92 0.85 0.89 0.80 0.92 0.83 0.86 0.78 0.89 0.80
由表2可知，以FAO/WHO模式为标准（P1），4种果汁的必需氨基酸贴近度为U1为0.86～0.89，而果酒的必需氨基酸贴近度U1为0.89～0.94。以全鸡蛋蛋白模式为标准（P2），4种果汁的必需氨基酸贴近度为U2为0.78～0.81，而果酒的必需氨基酸贴近度U2为0.80～0.87。4种果汁的必需氨基酸相对两种模式的贴近度均＜0.9，其中百香果汁必需氨基酸贴近度u1=0.89（P1）和0.81（P2），杨梅汁必需氨基酸贴近度u5=0.89（P1）和0.80（P2）在四种果汁中相对较高。
对比4种果汁发酵成果酒后必需氨基酸的贴近度发现，果酒必需氨基酸相对两种标准模式的贴近度（P1和P2）均有不同程度的提升（百香果汁u1＜百香果果酒u2，水蜜桃汁u3＜水蜜桃酒u4，杨梅汁u5＜杨梅酒u6，甜橙汁u7＜甜橙酒u8）。说明经酵母发酵利用后，果酒中必需氨基酸构成比例更加贴近两种氨基酸标准模式，其原因可能是在酵母作用下，转化了部分原先果汁中的氨基酸，新生成比原先果汁中更有利于人体利用的必需氨基酸组合[13]。4种果酒中的氨基酸组成比果汁均要更加平衡，这也印上述结果。其中，百香果果酒的必需氨基酸贴近度最大u2=0.94（P1）或0.87（P2）。因此，百香果果酒的必需氨基酸组成与两种标准模式氨基酸组成更接近，相对氨基酸营养价值会更高。与上述结果一致。
2.2.2 氨基酸比值系数法评价结果
果酒发酵前后样品必需氨基酸比值、氨基酸比值系数及必需氨基酸比值系数分见表3。
表3 果酒发酵前后样品必需氨基酸比值、氨基酸比值系数及必需氨基酸比值系数分
Table 3 Essential amino acid ratio, amino acid ratio coefficient and essential amino acid ratio coefficient of fruit wine before and after fermentation
类别 项目 Met Phe+Tyr Thr Val Leu Leu Lys SRC百香果果汁68.23百香果果酒82.02蜜桃汁74.13蜜桃酒RAA RC RAA RC RAA RC RAA RC 0.41 0.56*0.50 0.61*0.58 0.85 1.11 0.82 1.03 1.28 1.54 1.07 0.94 1.19 1.40 1.35 0.56 0.77 0.87 1.08 1.00 1.19 1.25 1.13 1.08 1.23 0.91 0.99 0.89 1.31 1.99 1.03 0.59 0.81 0.92 1.14 0.37 0.55*0.53 0.77*0.66 0.91 0.79 0.98 0.62 0.91 0.62 0.90 1.37 1.43 1.39 1.12 0.61 1.01 1.08 0.99 80.32
续表
注：“*”为第一限制性氨基酸。
类别 项目 Met Phe+Tyr Thr Val Leu Leu Lys SRC杨梅汁71.70杨梅酒81.86甜橙汁75.40甜橙酒RAA RC RAA RC RAA RC RAA RC 0.31 0.45*0.56 0.77 0.61 0.95 0.76 1.07 1.27 1.24 1.43 0.99 1.03 1.36 1.06 1.06 1.10 1.22 1.62 1.17 0.74 1.14 0.50 0.70 0.94 1.14 1.11 1.14 0.62 0.96 0.82 1.15 0.71 0.86 1.12 1.13 0.43 0.67*0.85 1.19 0.94 0.91 1.13 0.73*0.47 0.73 0.81 1.14 1.26 1.17 1.15 1.08 0.77 1.19 0.49 0.69*78.46
由表3可知，4种果汁的必需氨基酸SRC为68.23～75.40分，其中甜橙汁的必需氨基酸SRC最高，为75.40，而果酒的必需氨基酸SRC为78.46～82.02，其中百香果果酒必需氨基酸SRC最高（为82.02）。4种果酒的必需氨基酸SRC均有明显提升，但是提升幅度不同，百香果果酒必需氨基酸SRC提升20.2%，水蜜桃果酒必需氨基酸SRC提升8.3%，杨梅酒必需氨基酸SRC提升14.22%，甜橙酒必需氨基酸SRC提升了4.1%。说明果汁经过酵母的繁殖利用后，可以转化为必需氨基酸SRC更高的体系，营养价值得到提升。
根据FAO/WHO氨基酸评分模式[27]，百香果果酒、水蜜桃酒发酵前后限制氨基酸没有发生变化（第一限制氨基酸分别为Met、Leu）。而杨梅酒、甜橙酒的第一限制氨基酸发生了变化，杨梅汁的第一限制氨基酸为Met，而杨梅酒的第一氨基酸为Ile。甜橙汁的第一限制氨基酸为Leu，甜橙酒第一限制氨基酸为Lys。说明酵母在发酵不同果汁时，利用了不同比例的氨基酸来进行自身繁殖，并且转化成不同比例组成的氨基酸体系。这也为与不同果酒搭配食用的食物提供指引[28]。
2.2.3 呈味氨基酸分析
不同水果发酵成的果酒口感独特，与其所含丰富的呈味游离氨基酸有关[29]。氨基酸的呈味特性与它侧链R基团的疏水性有密切关系，当R基团疏水性较小时，呈甜味；当R基团疏水性较大时，呈苦味；当R基团为酸性时，以酸味为主；当R基团含有苯环结构时，呈芳香味[30]。
4种酒样的呈味氨基酸总含量见图1。从图1可知，百香果果酒和甜橙果酒的呈味氨基酸总含量相当（分别为111.49 mg/100 mL、111.55 mg/100 mL），并且明显高于杨梅果酒和蜜桃果酒（分别为47.88 mg/100 mL、48.02 mg/100 mL）。4种果酒的甜味氨基酸占比均最大，其次是苦味氨基酸和鲜味氨基酸，芳香味氨基酸占比最小。甜橙酒和百香果果酒的甜味氨基酸含量（分别为66.85 mg/100 mL、56.18 mg/100 mL）明显高于其他2种果酒，较高含量甜味氨基酸能够提升相关评价对象的感官评分。虽然果酒的甜味可以靠糖来调节，但相对高含量的甜味氨基酸也能给果酒的甜味带来增益作用，减少对糖调节甜味口感的依赖，使果酒更加健康营养。饮用果酒时感受到的综合甜味感能够有效覆盖酒精的刺激感，让果酒口感更加被大众所接受。因此，百香果果酒和甜橙酒在口感上会更倾向于被大众所接受。
图1 四种果酒的呈味氨基酸含量雷达图
Fig. 1 Radar plots of flavored amino acids contents in four types of fruit wines
3 结论
对4种水果果汁发酵成果酒前后的氨基酸组成进行检测分析，采用数学模糊识别分析法和氨基酸比值系数法对氨基酸营养价值进行分析评价。结果表明，4种果汁发酵成果酒后必需氨基酸组成更接近两种标准模式（FAO/WHO模式和相对全鸡蛋蛋白模式），且发酵后果酒的必需氨基酸SRC均有不同程度提升，百香果果酒在4种果酒中必需氨基酸组成与标准模式更接近，且必需氨基酸SRC最高。因此，4种果酒的必需氨基酸配更加合理，氨基酸营养价值有所提升，更利于人体利用，4种果酒中甜味氨基酸占比最高，而百香果果酒和甜橙果酒甜味氨基酸含量明显高于另外两种果酒，对果酒呈现甜味口感有增益作用。
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