黄精（Polygonatum sibiricum），是一种药食同源的百合科黄精属植物的根茎，又称“鸡头参”、“老虎姜”、“白芨”，根据2015年版《中国药典》中的收录，黄精可分为多花黄精、滇黄精和黄精[1-2]。中医认为，黄精具有健脾补肾、补气养阴、润肺等功效，可以预防治疗肾虚头晕、体倦乏力、糖尿病等多种疾病[3-6]。黄精中富含丰富的黄酮、甾体皂苷、黄精多糖等活性成分，其中黄精多糖是含量最丰富，具有抗疲劳、抗氧化、调节血糖等作用[7-9]。
黑糯米，别名为“药米”[10]、“黑珍珠”[11]、“紫米”[12]，是一种药食两用的糯性大米，具有补中益气、增强抵抗力、活血明目、固发抗衰、滋阴益肾、补胃暖肝等功效[13-16]。与白糯米相比，黑糯米的营养和药用价值更加全面，且蛋白质和维生素等均高于白糯米，其中，赖氨酸是普通白糯米的3.0～3.5倍，精氨酸比普通白糯米高1.15%[17-18]。黑糯米中的花色苷、黄酮类、植物甾醇和生物碱等活性物质在调节人体机能和维持健康方面也发挥着重要作用[19]。糯米酒中含有醛类、酚类物质、羰基化合物和高级醇类的特殊风味物质以及蛋白质、糖类、钙、多种维生素等基本营养成分[20-22]。目前对添加药食同源辅料的保健米酒酿造研究日益增多，张阳阳等[23]通过正交试验优化得到桑葚米酒最佳工艺，预测其货架期为15 d。杨丽华等[24]对黄芪米酒酿造工艺进行了优化，得到最佳工艺条件为黄芪添加量5%，酒曲添加量0.6%，黄米与糯米质量比1∶2，发酵时间72 h。李刚凤等[25]以鲜天麻、糯米为原料研发了一款酒精度为9.5%vol的天麻糯米发酵酒。目前鲜见以黄精和黑糯米为原辅料进行米酒酿造的研究报道。
该研究以黑糯米为主要原料，黄精提取液为辅料制备黄精黑糯米酒，以感官评分为考察指标，通过单因素试验和正交试验优化液态法发酵黄精黑糯米酒工艺条件，并对其理化指标及活性成分进行测定，以期获得营养健康的黄精黑糯米酒，为黄精产品的多样化发展提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡头黄精、酒曲：市售；黑糯米：哈尔滨鑫恒德食品有限公司；安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力≥100 000 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；纤维素酶（酶活力≥30 000 U/g）、α-淀粉酶（酶活力≥10 000 U/g）：山东科隆特酶制剂有限公司；糖化酶（酶活力≥150 000 U/g）：江苏博立生物制品有限公司；苯酚、亚铁氰化钾、D-无水葡萄糖、邻苯二甲酸氢钾、氯化钾、甲醛、酒石酸钾钠、氢氧化钠、酚酞、次甲基蓝、硫酸铜、活性炭、甲醇、乙酸钠、中性红、乙酸、乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、浓盐酸、浓硫酸、高氯酸（均为分析纯）、芦丁（纯度＞98%）：斯坦福石油化工（天津）有限公司。
1.2 仪器与设备
ZHP-250型智能恒温振荡培养箱：上海三发科学仪器有限公司；800Y多功能粉碎机：铂欧五金厂；SK8210LHC超声清洗器：上海科导超声仪器有限公司；RE-52B旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器设备有限公司；SHZ-DⅢ予华牌循环水真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；DHG-9076电热恒温鼓风干燥箱：江苏省金坛市大地自动化仪器厂；BSA224S分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；PAL-1数显测糖仪：广州市爱宕科学仪器有限公司；V-5000可见分光光度仪：上海元析仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 黄精提取液制备工艺流程[26]
选择无霉变、新鲜的黄精，用清水清洗表面污渍和泥垢，用切片器分成均匀的薄片（约1～2 mm）。将切片后的黄精均匀的铺在蒸锅，蒸至可被轻易戳破即可。然后平铺于烘盘，放入烘箱烘至黄精片可被轻轻捏碎（65 ℃、11 h）。将烘干后的黄精粉碎至可通过80目筛过筛。按黄精粉及水的比例为1∶20（g∶mL）加入蒸馏水，添加黄精粉质量的3%的纤维素酶和木瓜蛋白酶（纤维素酶∶木瓜蛋白酶=4∶6（g∶g）），调节pH=5.0时放入50 ℃、500 W超声波提取器中提取40 min。将超声提取后的黄精液于90 ℃处理5 min灭酶。用300目绢布趁热过滤，得到黄精提取液，备用。
1.3.2 黄精黑糯米酒加工工艺流程及操作要点[27-28]
操作要点：
浸泡、打浆：选用无霉变、新鲜的黑糯米，用清水冲洗2～3次，加入适量的纯净水于70 ℃水浴锅内浸泡2 h，每30 min搅拌一次，浸泡后糯米按照料液比1∶6（g∶mL）加纯净水打浆。
液化：糯米打浆后加入20 U/g α-淀粉酶（以糯米质量计），在70 ℃水浴锅中酶解30 min。
糖化：将上述酶解液冷却至60 ℃左右，加入200 U/g糖化酶（以糯米质量计），在60 ℃水浴锅糖化2.5 h，每30 min搅拌一次。
灭酶：将糯米糖化液放入水浴锅中于90 ℃处理5 min灭酶。
发酵：将糯米糖化液倒入缸中，添加一定量的黄精提取液，接入2.0%酒曲与酵母混合发酵剂（1∶1）（g∶g），在30 ℃条件下发酵5 d，酒精度基本不变终止发酵。
过滤、灭菌：用4层纱布过滤发酵液，滤液装罐，于100 ℃灭菌15 min即得黄精黑糯米酒成品。
1.3.3 黄精黑糯米酒发酵条件优化
单因素试验：在上述加工工艺流程条件下，以产品的感官评分、酒精度、可溶性固形物含量为考察指标，分别考察添加酒曲与酵母质量比（0∶1、1∶3、1∶1、3∶1、1∶0）、发酵时间（4 d、5 d、6 d、7 d、8 d）、黄精提取液添加量（0、11%、22%、33%、44%）、料液比（1.0∶4.0、1.0∶5.0、1.0∶6.0、1.0∶7.0、1.0∶8.0（g∶mL））4个因素对黄精糯米酒品质的影响。
正交试验：根据单因素试验结果，以感官评分作为评价指标，以酒曲与酵母质量比（A）、发酵时间（B）、黄精液提取液添加量（C）为影响因素，设计3因素3水平L9（34）正交试验，其因素与水平见表1。
表1 酿造工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for brewing process optimization
水平 A 酒曲与酵母质量比B 发酵时间/d C 黄精提取液添加量/%123 0∶1 1∶3 1∶1 567 16 22 28
1.3.4 总黄酮的测定
采用分光光度计法测定[29]，以芦丁质量浓度（X）为横坐标，以吸光度值（Y）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，得到标准曲线回归方程Y=0.090 3X-0.011 2，相关系数R2=0.996，根据标准曲线回归方程计算总黄酮含量。
1.3.5 花色苷的测定
参照T/NXFSA 022—2022《黑果枸杞提取物花色苷》中分光光度计法测定，用示差法计算出花色苷总量（以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计）。
1.3.6 感官评价
将样品随机给10名经过感官培训的食品专业人士进行感官评价，根据黄精黑糯米酒的口感、色泽、气味及组织状态进行感官评分，满分为100分，黄精黑糯米酒感官评价标准见表2。
表2 黄精黑糯米酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Polygonatum sibiricum and black glutinous rice wine
评价项目 评价标准 感官评分/分20～25口感（25分）口感细腻，味道醇厚，有轻微苦味、涩味，带有黄精风味口感较细腻，味道较醇厚，有苦味、涩味，黄精味略轻或略重口感粗糙，味道刺激，明显有苦味、涩味，黄精味重或轻10～19 0～9色泽（25分）颜色为紫红色，且鲜明透亮，有光泽颜色为暗红色，色泽较暗，光泽一般颜色为暗红色，光泽差20～25 10～19 0～9 20～25气味（25分）具有浓厚酒气，有黄精风味，无酸味，酒香浓郁协调具有浓厚酒气，黄精气味较淡或较重，有轻微酸味，酒香浓郁较协调具有浓厚酒气，黄精气味无或重，有明显酸味，酒香浓郁不协调10～19 0～9组织状态（25分）酒体澄清，无明显沉淀酒体较澄清，有少许沉淀酒体浑浊，有明显沉淀20～25 10～19 0～9
1.3.7 理化指标检测
可溶性固形物含量的测定：手持糖度计法；酒精度的测定：手持酒精浓度测量仪；总糖和还原糖（以葡萄糖计）的测定：参照GB/T 13662—2018《黄酒》费林法；总酸（以乳酸计）的测定：参照GB/T 13662—2008《黄酒》酸碱滴定法；氨基态氮的测定：参照GB 5009.235—2016《食品中氨基态氮的测定》酸度计法。
1.3.8 数据处理
每个试验重复3次，结果以“平均值±标准差”表示；正交试验设计与数据分析采用Design-Expert 8.0和Excel 2019软件进行处理。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 酒曲与酵母质量比对黄精黑糯米酒品质的影响
由图1可知，酒曲与酵母质量比的改变对米酒的酒精度基本无影响，说明两种发酵剂的发酵能力基本相似。当酒曲与酵母质量比为1∶3时，感官评分和可溶性固形物含量最高，分别为73分和4.6%，酒精度为12%vol，其原因可能是酒曲与酵母协同发酵，不仅可以保留酒曲的独特发酵风味，还可以丰富米酒的风味物质[30-31]。综合考虑，最佳酒曲与酵母的质量比为1∶3。
图1 酒曲与酵母质量比对黄精黑糯米酒品质的影响
Fig. 1 Effect of Jiuqu and yeast ratio on the quality of Polygonatum sibiricum and black glutinous rice wine
2.1.2 发酵时间对黄精黑糯米酒品质的影响
由图2可知，发酵时间对米酒的可溶性固形物含量基本无影响。当发酵时间为4～6 d时，酒精度及感官评分均呈升高趋势；当发酵时间为6 d时，感官评分及酒精度均达到最大值，分别为77分和12.2%vol，此时，可溶性固形物含量为4.5%；当发酵时间＞6 d时，酒精度及感官评分均呈下降趋势。当发酵时长太短时，微生物作用时间短，未降解完酒中的糖类等营养成分，发酵不够彻底，导致糯米酒风味不足，不断延长发酵时间，糖类等物质被酵母等利用产生乙醇和酚类物质，米酒的酒精度及可溶性固形物含量增加。随着发酵的继续进行，糖类物质被酵母菌等微生物消耗殆尽，部分乙醇和酚类物质被氧化，使得酒体出现明显酸味、苦涩味，感官品质下降[30]。综合考虑，最佳发酵时间为6 d。
图2 发酵时间对黄精黑糯米酒品质的影响
Fig. 2 Effect of fermentation time on the quality of Polygonatum sibiricum and black glutinous rice wine
2.1.3 黄精提取液添加量对黄精黑糯米酒品质的影响
由图3可知，当黄精提取液添加量在0～44%时，酒精度和可溶性固形物含量随之增加。当黄精提取液添加量为0～22%时，感官评分随之升高；当黄精提取液添加量为22%时，感官评分最高（77分），可溶性固形物含量和酒精度分别为4.3%、11.8%vol；当黄精提取液添加量＞22%时，感官评分有所下降。这是因为黄精提取液中含有黄精多糖和还原糖等成分，可为酵母菌发酵提供营养物质，但是黄精提取液较多时，黄精风味会掩盖米酒风味，沉淀物增加，口感也随之变差。综合考虑，最佳黄精提取液添加量为22%。
图3 黄精提取液添加量对黄精黑糯米酒品质的影响
Fig. 3 Effect of Polygonatum sibiricum extract addition on the quality of P. sibiricum and black glutinous rice wine
2.1.4 料液比对黄精黑糯米酒品质的影响
由图4可知，随着料液比在1.0∶4.0～1.0∶8.0（g∶mL）范围内的不断增加，酒精度和可溶性固形物含量呈不断下降的趋势。当料液比为1.0∶4.0～1.0∶7.0（g∶mL）时，感官评分随之增加；当料液比为1.0∶7.0（g∶mL）时，感官评分最高（78分），此时，可溶性固形物含量和酒精度分别为4.4%和11.5%vol；当料液比为1.0∶7.0～1.0∶8.0（g∶mL）时，感官评分逐渐下降。其原因可能是，当发酵用水比例较低时，糖化液中葡萄糖等浓度高，可能导致发酵不均匀，酒精度和糖度高，形成了高糖渗透环境影响了酵母的发酵功能，使得风味成分产生少，口感不佳，感官评分较低[32]。当发酵用水比例较高时，导致酒体风味不足，口感不协调[31]。因此，最佳料液比为1.0∶7.0（g∶mL）。
图4 料液比对黄精黑糯米酒品质的影响
Fig. 4 Effect of material and liquid ratio on the quality of Polygonatum sibiricum and black glutinous rice wine
2.2 正交试验结果
根据单因素试验的结果，以感官评分作为评价指标，以酒曲与酵母质量比（A）、发酵时间（B）、黄精液提取液添加量（C）、空列（D）为4个影响因素优化黄精黑糯米酒工艺条件，正交试验结果与分析见表3。方差分析结果见表4。
表3 发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization
试验号 A B C D（空列） 感官评分/分123456789k1 111222333 123123123 123231312 123312231 75 76 75 80 84 83 84 84 82 k2 k3极差75.333 82.333 83.333 8.000 79.667 81.333 80.000 1.666 80.667 79.333 81.000 1.667 80.333 81.000 79.667 1.333
表4 回归模型方差分析结果
Table 4 Results of variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
因素 偏差平方和 自由度 均方 F 值 显著性ABCD误差114.000 4.667 4.667 2.667 2.667 22222 57.000 2.333 2.333 1.333 1.333 42.745 1.750 1.750 1.000*
由表3可知，影响黄精黑糯米酒感官品质的各因素的顺序是A＞C＞B，即酒曲与酵母质量比＞黄精液提取液添加量＞发酵时间。发酵条件最优的组合方案为A3B2C3，即酒曲与酵母质量比1∶1、发酵时间6 d、黄精提取液添加量28%。根据正交试验最优组合A3B2C3进行3次平行验证试验，得到黄精黑糯米酒的酒精度为12.0%vol，感官评分为87分，黄精黑糯米酒澄清透亮、呈紫红色、香气醇厚具有黄精风味。由表4可知，酒曲与酵母质量比对黄精黑糯米酒感官品质影响显著（P＜0.05）。
2.3 理化指标与活性成分测定结果
对黄精黑糯米酒的理化指标和活性成分进行测定，测得其总糖含量为4.13 g/100 mL、还原糖含量为3.74 g/100 mL、总酸含量为6.32 g/L、氨基酸态氮含量为0.22 g/L、花色苷含量为37.9 mg/L、总黄酮含量为0.023 g/100 mL。
3 结论
以黑糯米和黄精为原料制备黄精黑糯米酒，经过单因素与正交试验得出最佳工艺条件为：酒曲与酵母质量比1∶1、发酵时间6 d、黄精提取液添加量28%、料液比（糯米与水）1.0∶7.0（g∶mL），在此优化工艺条件下，黄精黑糯米酒的酒体澄清透亮、呈紫红色、酒香醇厚、具有黄精风味，感官评分为87分，酒精度达12.0%vol，总糖含量为4.13 g/100 mL、还原糖含量为3.74 g/100 mL、总酸含量为6.32 g/L、氨基酸态氮含量为0.22 g/L，花色苷含量为37.9 mg/L、总黄酮含量为0.023 g/100 mL，本研究丰富了黄精产品的多样性，也满足了消费者的对健康和口感的需求，具有较好的市场前景。
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