白酒是中国的国酒，有着几千年的历史[1]。传统的白酒是以固态发酵、固态蒸馏，再经储存、勾兑而成[2-3]。白酒中的主要成分是乙醇和水，占其总量的99%，剩下的1%是构成白酒独特风味的微量化合物[4]。目前在白酒中检测到的微量风味化合物达1 700多种[5]，主要包括醇类、酯类、醛类、酮类、酸类等[6]，这些风味物质之间又发生一系列复杂的反应，使得白酒具有丰富的香气和协调的口感[7]。
液态法白酒是指原料加水糊化后，再添加相应的酶进行液化、糖化，经液态发酵、蒸馏所得的白酒[8-9]。液态法白酒相对于固态法白酒有明显的优势[10]，如原料利用率高、发酵周期短、机械化程度高等[11]。但是，液态法白酒又有一些缺陷，如高级醇含量高、酯类、酸类物质含量少、口味寡淡，饮后易上头等[12-13]。有研究报道，与固态法白酒相比，液态法白酒的高级醇含量高2倍左右，酸类物质含量为1/10左右，酯类物质含量为1/3左右，酸类物质、酯类物质种类更少[14-15]。因此，合理调控风味物质构成，提升风味物质含量是液态法白酒亟待解决的问题。
氨基酸作为有机氮源，不仅与微生物的生长代谢密切有关，还与发酵过程中的某些风味化合物的生成有关[16]，在白酒发酵过程中有着十分重要的作用[17]。不同氨基酸通过分解代谢，可以形成相应的高级醇。氨基酸在分解代谢中首先被转氨为α-酮酸，α-酮酸脱羧成醛，最后醛被还原成醇，特定的氨基酸可形成特定的高级醇[18]，亮氨酸（Leu）与异戊醇的生成有关[19]，缬氨酸（Val）与异丁醇的生成有关[20]，苯丙氨酸（Phe）与苯乙醇的生成有关[21]，同时Leu、Val、Phe等对于葡萄酒中的乙酸酯也有明显的提升[22]。本实验室已有研究表明，在液态法白酒发酵过程中，当添加200 mg/L Val时，发酵所得酒中异丁醇含量提高了近3倍；当添加200 mg/L Leu时，异戊醇的含量提高了1.89倍；当添加200 mg/L Phe时，苯乙醇含量提高了4.2倍。有研究者在果酒中添加氨基酸来探究其对产风味物质的影响[23-25]，张雪等[26]在冰酒发酵过程中添加可同化氮提高酒中的醇类和酯类物质。张文叶等[27]在山楂发酵液中分别添加甘氨酸（Gly）、Val、Phe、Leu，结果表明Gly使山楂酒中异戊醇含量升高，Val、Phe和Leu使得生成更多的异丁醇、苯乙醇和异戊醇。孙时光等[28]研究表明Ala、Arg能显著降低桑椹果酒总高级醇含量，并且对于总酸含量有一定的提高。李智慧等[29]在不同氮源对黄酒酵母产高级醇的研究中发现Phe、Val、Leu分别提高β-苯乙醇、异丁醇、异戊醇的含量。
在果酒和黄酒中外源氨基酸的加入使得高级醇等风味物质含量改变，酒的品质提升。然而氨基酸的加入对液态法白酒产生的影响尚未见报道。为提高液态法白酒的风味与品质，本研究结合已有研究中氨基酸对发酵产风味物质的影响，在发酵前添加不同量的Gly、Val、Leu、Phe，探究其对液态法发酵白酒产酒精、总酸、总酯和主要风味物质的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
高粱：产地四川省；大曲：四川某酒厂；酿酒酵母：安琪酵母有限公司；α-淀粉酶（≥3 700 U/g）、糖化酶（10万活力/g）：北京奥博星生物技术有限责任公司；L-甘氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；邻二氯苯（色谱纯）：北京迈瑞达科技有限公司。
1.2 仪器与设备
FW-100粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；HZQ-F160恒温恒湿培养箱：太仓市实验设备厂；DK-S22恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；PHS-3D pH计：上海精科实验设备有限公司；Agilent 7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；固相微萃取手柄和50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维萃取头：美国Supelco公司；PAL多功能样品前处理平台（带有固相微萃取模块）：瑞士CTC公司。
1.3 方法
1.3.1 液态法发酵白酒工艺流程及操作要点
操作要点：称取30 g粉碎高粱，放入250 mL三角瓶中，以1∶5（g∶mL）的料液比加入150 mL蒸馏水，于100 ℃的恒温水浴锅中搅拌糊化30 min，完成之后冷却至室温，添加60 U/g原料的α-淀粉酶，于65 ℃恒温水浴锅中保持180 min，然后在相同的温度下加入550 U/g原料的糖化酶保持70 min，冷却至室温后调节pH至5.5，添加原料质量1.2‰的酵母、15%的大曲，于32 ℃恒温培养箱中发酵9 d，发酵结束后取100 mL发酵液于500 mL蒸馏瓶中，加入100 mL蒸馏水进行常压蒸馏，收集前100 mL酒样进行后续分析。
1.3.2 添加氨基酸对液态法发酵白酒品质的影响
在液态发酵醪液制备完成后，调整pH至5.5，分别添加0、200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L的Gly、Val、Leu、Phe，发酵完成后取发酵液进行蒸馏，测定酒中酒精度、总酸、总酯和风味物质含量。
1.3.3 理化指标测定
酒精度的测定：采用比重计法；总酸、总酯的测定：参考国家标准GB/T 10345—2022《白酒分析方法》，采用指示剂法。
1.3.4 挥发性风味物质分析
顶空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）条件：选用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，在20 mL顶空瓶中加入4 mL蒸馏酒样和1.5 g氯化钠，加入1 mg/mL的邻二氯苯内标5 μL，加盖带垫的铝帽，60 ℃预热10 min，插入萃取头，萃取吸附30 min，进样口解吸5 min（230℃），用于气相色谱-质谱（gaschromatographymassspectrometer，GC-MS）分析。
气相色谱条件：色谱柱为DB-Wax毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：35 ℃保持4 min，以5 ℃/min的速度升温至150 ℃，恒温保持4 min，然后以3 ℃/min的速度升温至220 ℃，保持5 min；载气为高纯氦气（He）流速1.0 mL/min，不分流进样。
质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源；电子能量为70 eV；离子源温度为230 ℃；质量扫描范围35～500 m/z。
定性定量分析：通过质谱计算机的美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）11.0质谱库定性；各香气物质组分的质谱经计算机谱库检索，结合解析谱图，采用内标法进行定量，内标物为1 mg/mL的邻二氯苯，添加量5 μL。香气成分含量计算公式如下：
1.3.5 数据处理
数据统计和作图由Microsoft Office 2007和Origin 2021b完成，利用Multi Experiment Viewer 4.9.0对风味物质和酒样进行聚类分析和热图可视化分析。
2 结果与分析
2.1 氨基酸添加对酒精度、总酸、总酯的影响
氨基酸参与微生物的生长代谢，影响微生物的生长代谢活动，不同的氨基酸种类、不同的氨基酸浓度，对微生物代谢产酒精、总酸、总酯的影响不同。四种氨基酸的不同添加量对酒精度、总酸和总酯含量的影响见图1。
图1 氨基酸添加量对酒精度（A）、总酸（B）及总酯（C）含量的影响
Fig. 1 Effect of amino acid addition on alcohol content (A), total acid(B), and total ester (C) contents
由图1A可知，添加Gly对酒精度的影响最明显，酒精度升高明显，随着Gly添加量的增加，酒精度先升高后降低，当Gly添加量为400 mg/L时，酒精度最高为12%vol，比空白组增加了7.14%；由图1B可知，添加四种氨基酸后，发酵产生的总酸含量先增加后降低，其中当Gly、Leu、Phe添加量为400 mg/L、Val添加量为800 mg/L时总酸含量最大，与空白相比，添加Leu总酸含量增加8.10%，含量为0.277 g/L；由图1C可知，随着Gly、Leu、Val、Phe添加量的增加，均促进了酯的生成，Gly、Leu、Val、Phe添加量分别为600 mg/L、600 mg/L、200 mg/L、800 mg/L时，总酯含量最大，分别为0.419 g/L、0.427 g/L、0.421 g/L、0.426 g/L，比空白相分别增加了10.50%、9.97%、12.07%、11.81%。
氨基酸代谢产物乙酰辅酶A是三羧酸循环的中间产物，添加氨基酸后，增加了体系中乙酰辅酶A的含量，导致糖酵解等相关途径中丙酮酸转化为乙酰辅酶A的量减少，从而积累了丙酮酸，转化成了更多的乙醇，使酒精度升高[24]。发酵体系中有着丰富的微生物菌群，氨基酸可促进微生物生长代谢，促进了发酵产酸。随着氨基酸添加量的增加，反应产生更多的乙醇，醇类与酸类物质发生酯化反应，导致总酸含量降低，总酯含量升高。同时，乙醇体积分数的升高可能会对一些酶活性产生影响，进而影响酸类物质的形成。在已有的相关研究中也有类似的结果[30]。在本研究中，添加400～600 mg/L的Leu对于液态法白酒的总酸和总酯的提高具有较为明显的作用；添加400 mg/L的Gly对酒精度生成影响最大；添加200 mg/L的Val对总酯生成影响最大；添加800 mg/L的Phe对总酯生成影响最大。
2.2 氨基酸添加对辛酸、正癸酸、月桂酸含量的影响
产酸是发酵过程的必然趋势，主要酸类物质的构成是影响产物风味的重要因素。对蒸馏酒样进行GC-MS分析，对检出结果最高的前几种酸类物质辛酸、正葵酸及月桂酸进行比较分析，结果见图2。
图2 氨基酸添加量对辛酸（A）、正癸酸（B）及月桂酸（C）含量的影响
Fig. 2 Effect of amino acid addition on the contents of caprylic acid(A), n-caprylic acid (B) and lauric acid (C)
由图2可知，添加不同的氨基酸，发酵产生辛酸、正癸酸和月桂酸含量均有所降低。由图2A可知，随着Gly、Leu、Val添加量的增加，发酵产生的辛酸含量先降低后升高、最后再降低；随着Phe添加量的增加，辛酸含量逐渐降低。由图2B可知，随着Gly、Leu、Val添加量的增加，发酵所得的正癸酸含量先降低、后趋于稳定；随着Phe添加量的增加，发酵所得的正癸酸含量先降低、后升高、最后趋于稳定。由图2C可知，随着Gly添加量的增加，发酵所得的月桂酸含量先降低、后升高、最后趋于稳定；随着Leu、Val、Phe添加量的增加，发酵所得的月桂酸含量先降低、后趋于稳定。当Gly、Leu、Val、Phe添加量分别为1 000 mg/L、800 mg/L、200 mg/L、800 mg/L时，辛酸生成量最低，与空白相比分别降低了45.98%、33.57%、40.04%、34.44%；当Gly、Leu、Val、Phe添加量分别为400 mg/L、1 000 mg/L、400 mg/L、200 mg/L时，正癸酸含量最低，与空白相比分别降低了49.39%、38.27%、23.83%、51.70%；当Gly、Leu、Val、Phe添加量分别为200 mg/L、200 mg/L、200 mg/L、1000 mg/L时，月桂酸含量最低，与空白相比分别降低了60.75%、30.72%、10.58%、36.18%。
酸类物质是白酒最重要的味感剂，有研究表明其含量的多少和比例协调性对新酒老熟有显著的催化效应[31]。添加氨基酸后，辛酸、正癸酸、月桂酸含量降低，究其原因可能是添加氨基酸促进了相应的醇类物质增加，这些醇类物质与酸类物质发生酯化反应，生成了相应的酯类物质，导致酸类物质含量的降低[32]。另外，酸类物质与醛类物质等的形成也有关[33]。此外，添加氨基酸后，促进了乙醇含量的增加，乙醇影响菌群生长、抑制相关产酸酶的活性，产酸能力降低，酸类物质含量下降[34]。在本研究中，添加200～400 mg/L的Gly时，辛酸、正癸酸和月桂酸生成量低，被转化为酯类等其他物质，对液态法白酒风味的提高效果更好。
2.3 氨基酸添加对异丁醇、异戊醇、苯乙醇含量的影响
对蒸馏酒样进行GC-MS分析，对检出含量最高的3种高级醇类物质异丁醇、异戊醇及苯乙醇进行比较分析，结果见图3。
图3 氨基酸添加量对异丁醇（A）、异戊醇（B）及苯乙醇（C）含量的影响
Fig. 3 Effect of amino acid addition on the contents of isobutanol (A),isopentanol (B) and phenylethanol (C)
由图3A可知，Val对异丁醇的生成有明显增加，另外三种氨基酸对异丁醇生成影响较小；随着Val添加量的增加，异丁醇生成量逐渐增加后趋于稳定，在Val添加量为800 mg/L时异丁醇生成量最大，与空白相比增加了404.28%。由图3B可知，Leu对异戊醇的生成有明显增加，另外三种氨基酸对异戊醇生成影响较小；随着Leu添加量的增加，异戊醇生成量逐渐增加后趋于稳定，在Leu添加量为800 mg/L时异戊醇生成量最大，与空白相比增加了92.94%。由图3C可知，Phe对苯乙醇的生成有明显增加，另外三种氨基酸对苯乙醇的生成有一定的抑制作用；随着Phe添加量的增加，苯乙醇生成量逐渐增加后趋于稳定，在Phe添加量为400 mg/L时苯乙醇生成量最大，与空白相比增加了81.54%；随着Gly、Leu、Val添加量的增加，苯乙醇的生成逐渐降低后趋于稳定，在Gly、Leu、Val添加量分别为400 mg/L、800 mg/L、200 mg/L时苯乙醇生成量最低，与空白相比分别降低了38.25%、40.84%和33.88%。
氨基酸主要影响微生物的代谢活动从而影响高级醇的生成，当发酵体系中氮源过量时，通过Ehrlich途径合成高级醇[27]，氨基酸转氨基形成α-酮酸中间体，继而脱羧形成醛类，醛类被还原为高级醇[35]。有研究者利用13C核磁共振波谱法和气相色谱质谱法发现，Leu经由Ehrlich途径代谢得到异戊醇[36]。酿酒酵母内能够通过Val代谢途径合成异丁醇[37]，同时芽孢杆菌属、片球菌属和变形杆菌属也能产生异丁醇[38]，Val通过促进相关微生物的生长，从而促进异丁醇的生成。苯乙醇在微生物机体内的主要代谢路径是Phe代谢途径，其生成是通过Phe去羧基生成苯乙胺，苯乙胺去氨基作用生成苯乙醛，苯乙醛再经还原作用生成苯乙醇[39]，Phe促进了苯乙醇的生成，本研究中添加相应的氨基酸，对应的高级醇生成变化，与已有研究结论相符[40-41]。在本研究中，800 mg/L的Val对异丁醇的生成影响最大；800 mg/L的Leu对异戊醇的生成影响最大；400 mg/L的Phe对苯乙醇的生成影响最大。在实际应用过程中，要综合分析白酒中的酸类、酯类物质的含量，根据相应的比例合理升高或降低高级醇的含量。
2.4 氨基酸添加对乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、月桂酸乙酯含量的影响
对蒸馏酒样进行GC-MS分析，对检出含量高的4种酯类物质乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯及月桂酸乙酯进行比较分析，结果见图4。
图4 氨基酸添加量对乙酸乙酯（A）、己酸乙酯（B）、辛酸乙酯（C）及月桂酸乙酯（D）含量的影响
Fig.4 Effect of amino acid addition on the contents of ethyl acetate(A),ethyl caproate(B),ethyl caproate(C)and ethyl laurate(D)
添加不同质量浓度的Gly、Leu、Val、Phe发酵对常见酯类的生成均有促进作用。由图4A可知，随着Gly添加量的增加，乙酸乙酯生成量先降低，后升高，最后再降低；随着Leu添加量的增加，乙酸乙酯生成量先升高后降低；随着Val、Phe添加量的增加，乙酸乙酯的生成量逐渐升高后趋于稳定；乙酸乙酯的生成量随氨基酸的添加浓度增加明显；其中当Phe添加量为1 000 mg/L时，乙酸乙酯生成量最大，与空白相比提高了32.66%；添加Gly、Leu时趋势相似，都是在600 mg/L时乙酸乙酯的生成量达到最大。由图4B和图4C可知，添加不同质量浓度的Gly、Leu、Val、Phe均促进了己酸乙酯和辛酸乙酯的生成，在Gly、Leu、Val、Phe添加量分别为600 mg/L、600 mg/L、600 mg/L、800 mg/L时己酸乙酯生成量达最大，与空白组相比分别增加了45.05%、42.08%、32.74%和55.09%；在Gly、Leu、Val、Phe添加量分别为600 mg/L、800 mg/L、200 mg/L、1 000 mg/L时辛酸乙酯生成量达最大，与空白组相比分别增加了69.75%、53.60%、67.32%和31.03%。由图4D可知，添加Gly、Leu、Val趋势对月桂酸乙酯产生的影响相似，都是在200 mg/L时达到高峰，与空白相比分别增加了36.50%、22.39%、20.25%，而添加Phe则是在800 mg/L时月桂酸乙酯生成量达到最大，与空白相比增加了40.64%。
有研究认为，添加氨基酸对微生物的生长代谢产生影响，促进了与酯类物质生成有关的酶（酰基辅酶A合成酶和醇乙酰转移酶）的生成，提高了酯类物质的含量[42]；另外，添加氨基酸后促进了酸类、醇类物质生成，有利于发酵体系中的酯化反应，导致酯类物质含量增加；体系中其他相关的生物化学反应，也促进了酯类物质含量的增加[43]。有研究表明，乙酸乙酯的生成与游离氨基酸相关，与Gly、Leu、Val、Phe显著相关[34]，本研究结果与其相一致。参与到Phe代谢的酶类主要有醛脱氢酶、酰胺酶、转氨酶以及氨基酸脱羧酶，在这些酶的作用下Phe代谢可合成相应的醛与酸，后又经系列反应转化为相应的醇和酯[44]。张双梅等[45]在外源氨基酸对桑葚酒风味品质的影响的研究中发现，添加Leu、Val、Phe可增加桑葚酒中风味物质含量，促进辛酸乙酯生成，本研究结果与其相一致。在本研究中，添加800 mg/L的Phe对于乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和月桂酸乙酯的生成具有较为明显的提高。
2.5 液态发酵法白酒挥发性风味物质聚类分析
对蒸馏酒含量最高的3种酸类、3种高级醇类、4种酯类物质共10种挥发性风味物质进行聚类分析，结果见图5。
图5 添加氨基酸的液态发酵法白酒中挥发性风味物质聚类分析
Fig. 5 Cluster analysis of volatile flavor compounds in liquid-fermentation Baijiu with amino acids addition
由图5可知，添加不同质量浓度的4种氨基酸发酵和空白液态发酵的21种样品酒被分为三类，添加Leu聚为第一类，添加Gly和Val聚为第二类，添加Phe和空白组聚为第三类。添加低质量浓度的Leu时富含苯乙醇、正癸酸和月桂酸乙酯，高质量浓度时富含乙酸乙酯，所有质量浓度都富含异戊醇。添加低质量浓度的Gly时富含月桂酸乙酯，高质量浓度时富含异戊醇和辛酸乙酯；添加低质量浓度的Val时富含辛酸乙酯，高质量浓度时富含乙酸乙酯和辛酸，所有质量浓度都富含异丁醇和正癸酸。空白组富含苯乙醇、正癸酸和辛酸；添加低质量浓度的Phe时富含辛酸，高质量浓度时富含乙酸乙酯、己酸乙酯和月桂酸乙酯，所有质量浓度都富含苯乙醇。
不同质量浓度的Gly、Leu、Val、Phe添加对液态法白酒产风味物质的影响不同，合理添加不同质量浓度的氨基酸对于提高液态法白酒的风味具有积极的意义。
3 结论
添加Gly、Leu、Val、Phe对液态法白酒发酵酒精、总酸、总酯形成均有促进作用。Gly对酒精生成影响最大，Leu对总酸和总酯的生成影响最大。不同种类、不同浓度的氨基酸对液态发酵法白酒风味物质的产生影响不同。Leu、Val和Phe对液态法白酒风味物质生成具有较为明显的促进作用，Gly对液态发酵法白酒风味物质生成的影响较低。在液态发酵法白酒发酵过程中合理添加氨基酸，可明显提高液态法白酒酒精度、总酸及总酯的含量，有效抑制或调整高级醇产生，对提高液态法白酒的质量产生积极影响。本研究可为提升液态发酵法白酒品质提供参考。
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