香气是葡萄酒的重要感官品质之一,决定着产品的风格与典型性,是决定葡萄酒产品感官品质的主要因素之一[1]。葡萄酒中香气物质种类复杂,按照来源主要分为品种香、发酵香、陈酿香[2];而按照香气物质结构主要有酯类、醇类、脂肪酸类、醛类、酮类、萜烯类、挥发性酚类、内酯类、呋喃酮类、苯环化合物类和含硫化合物等[3]。葡萄酒香气的组成及含量受到葡萄酒原产地风土的影响,包括了气候、地质、土壤等自然因素和栽培管理措施、酿造工艺等人为因素,这些因素在葡萄生长过程及葡萄酒发酵过程中影响物质的合成和转化,从而影响葡萄酒的风格与品质,不同产区的风土条件造就了不同个性特征的葡萄酒[4]。
中国幅员辽阔,经度范围为73°33′E至135°05′E,东西跨度大,地势西高东低,呈阶梯状分布,地形地貌丰富,气候类型复杂多变。新疆天山北麓产区、甘肃河西走廊产区、宁夏贺兰山东麓产区、河北碣石山产区、山东胶东半岛产区由东至西分布,风土差异大,葡萄酒风格迥异[5]。近年来,关于各个产区葡萄酒香气的研究丰富,有研究报道了我国各产区内葡萄酒的香气物质和感官差异,如新疆不同产区‘赤霞珠’干红葡萄酒香气品质的研究[6]、河西走廊基于多个品种干红葡萄酒香气特征研究[7]、贺兰山东麓产区‘赤霞珠’和‘美乐’干红葡萄酒香气典型性研究[8]以及子产区香气特征差异研究[9],以及碣石山四个子产区‘赤霞珠’干红葡萄酒香气特征差异研究[10]、胶东半岛产区不同品种干红葡萄酒香气差异研究[11],也不乏多个大产区间单品种和多品种干红葡萄酒香气特征比较研究[12-15]。此类研究中,东西部产区间香气差异性与气象因子的关联分析较少。由于缺乏气象因子与葡萄酒关键香气物质的关联分析,无法明晰葡萄酒香气品质形成的规律和影响因素,难以科学有效地通过生产技术和管理方法实现葡萄酒风味的精准调控。
本研究收集了天山北麓产区、贺兰山东麓产区、河西走廊产区、碣石山产区、胶东半岛产区共43款‘赤霞珠’和‘美乐’干红葡萄酒。采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)和固相萃取-气相色谱三重四极杆串联质谱联用(solid phase extraction-gas chromatography-triplequadrupoletandemmassspectrometry,SPE-GC-QqQ-MS/MS)技术检测干红葡萄酒的香气物质成分及含量,使用偏最小二乘-判别分析(partial least squaresdiscriminant analysis,PLS-DA)明确各产区干红葡萄酒香气特征,并利用单因素方差分析判别其关键挥发性组分的差异,进一步通过皮尔逊相关性分析明确气象因子对葡萄酒关键香气物质积累的影响。以期发挥各产区自然资源优势,挖掘产区风格,生产独具地域特色的优质干红葡萄酒。
1.1.1 葡萄酒样品
本研究收集了河西走廊产区(HX)、天山北麓产区(TS)、贺兰山东麓产区(HL)、胶东半岛产区(JD)、碣石山产区(JS)的‘赤霞珠’和‘美乐’干红葡萄酒,2022年不同产区葡萄酒样品信息及理化指标见表1。
表1 葡萄酒样品信息及理化指标
Table 1 Information and physicochemical indexes of wines samples
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。
品种 产区 样品数量 酒精度/%vol pH值 总酸/(g·L-1)赤霞珠美乐TS HX HL JD JS TS HX HL JD JS 5 5 5 4 4 5 4 4 4 3 13.57±1.05bc 14.09±0.72b 16.10±0.65a 12.47±0.35c 13.58±0.50b 14.08±1.10bc 14.88±0.76ab 15.80±0.31a 13.44±0.13c 13.54±0.45c 4.04±0.40ab 3.83±0.24b 3.71±0.08b 3.76±0.14b 4.28±0.12a 4.03±0.24ab 3.96±0.14a 3.64±0.18bc 3.41±0.13c 3.91±0.06a 4.81±1.48ab 5.45±0.70ab 6.32±0.66a 5.25±0.51ab 4.73±0.40b 4.79±0.76bc 5.57±0.48b 6.40±0.32a 5.20±0.60b 4.32±0.07c
1.1.2 化学试剂
葡萄糖、酒石酸、氯化钠、氢氧化钠、无水硫酸钠、柠檬酸和磷酸氢二钠(均为分析纯):北京蓝弋化工产品有限公司;甲醇、乙醇、二氯甲烷(均为色谱纯):美国霍尼韦尔公司;D-葡萄糖酸内酯、聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVPP)、C6~C30正构烷烃、香气标准品:美国西格玛奥德里奇公司。
固相萃取柱Cleanert PEP-SPE(500 mg/6 mL):天津博纳艾杰尔科技有限公司;JY10002电子天平:上海舜宇恒平科学仪器有限公司;SG3200JST超声波清洗机:上海冠特超声仪器有限公司;FotectorPlus-60全自动固相萃取仪:厦门睿科集团股份有限公司;UGC-24C氮吹仪:北京优晟联合科技有限公司;SPME萃取头DVB/CAR/PDMS:美国Supelco公司;7890-5975B气相色谱质谱联用仪、7890B-7000D三重四极杆气质联用系统:美国安捷伦科技有限公司;CTC CombiPAL autosampler多功能自动进样器、CTC PAL RSI85多功能自动进样器:瑞士思特斯分析仪器有限公司;HPINNOWAX气相色谱柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm)、HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm):美国J&W Scientific公司。
1.3.1 气象数据
通过国家气象信息中心-中国气象数据网[16]收集了河西走廊产区、天山北麓产区、贺兰山东麓产区、胶东半岛产区、碣石山产区的2000-2017年全年气象数据,包括光照时数、昼夜温差、平均温度和降雨量;2000-2014年全年光合有效辐射数据来源于中国光合有效辐射重构数据集[17]。
1.3.2 干红葡萄酒香气物质的测定
(1)挥发性风味物质的测定
干红葡萄酒中挥发性风味物质采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用(HS-SPME-GC-MS)技术测定[18-19]。
SPME萃取头采用2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS,采用CTC CombiPAL autosampler多功能自动进样器实现自动化的顶空固相微萃取。20 mL 玻璃样品瓶中加入5 mL葡萄酒样品、1.5 g NaCl 和10 μL 内标(4-甲基-2-戊醇,质量浓度1.008 6 g/L),然后迅速用带有聚四氟乙烯隔垫的盖子拧紧。样品瓶首先在40 ℃加热槽中振荡30 min,振荡速度为500 r/min,然后将已活化的SPME萃取头插入样品瓶的顶空部分,在40 ℃条件下下继续振荡30 min后,取出SPME萃取头,立即插入气相色谱进样口,进样口温度为250 ℃,热解吸8 min。
GC色谱条件:色谱柱为HP-INNOWAX毛细管柱(60m×0.25 mm×0.25 μm),载气为高纯氦气(He)(>99.999%),流速为1.0 mL/min;采用不分流进样,进样口温度为250 ℃。柱温箱的升温程序:起始温度为50 ℃,保持1 min,然后以3 ℃/min的速率升温至220 ℃,保持5 min。质谱条件:电子电离(electronic ionization,EI)源,电子能量70 eV,离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃,辅助加热器温度250 ℃,质量扫描范围为30~350 amu。每个样品进行两个独立重复。
定性定量方法:通过比较保留指数(retention index,RI)和使用AMDIS获得的美国国家标准技术研究所(National Institute of Standards and Technology,NIST)11 MS数据库中的挥发性参考标准的质谱,确定了香气物质类别。每种香气标准品的校准曲线是根据10个梯度的模拟酒溶液进行分析后,通过目标化合物的峰面积与内标的峰面积之比与每种化合物的浓度之比建立校准曲线,对香气物质进行定量。
(2)呋喃酮和内酯类化合物的测定
干红葡萄酒中呋喃酮和内酯类化合物测定采用固相萃取-气相色谱三重四极杆串联质谱联用(SPE-GC-QqQMS/MS)技术测定[20]。Cleanert PEP固相萃取柱(500 mg/6 mL)依次用10 mL二氯甲烷、10 mL甲醇和10 mL体积分数为12%的乙醇水溶液进行活化。在20 mL葡萄酒样品中加入10 μL内标(L-薄荷醇,580 mg/L),以1 mL/min的流速通过萃取柱。然后加入5 mL纯水淋洗萃取柱,去除色素、糖和酸等极性物质。最后,加入15 mL二氯甲烷洗脱目标化合物,收集的洗脱液用适量的无水硫酸钠干燥后,采用氮吹浓缩至500 μL后用0.45 μm滤膜过滤。
GC-QqQ-MS/MS分析采用安捷伦7890B-7000D气相色谱三重四极杆串联质谱联用仪,配备CTC PAL RSI85多功能自动进样器,色谱柱为HP-5MS UI超惰性气相色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。进样量为1 μL,不分流进样,进样口温度为250 ℃。载气为高纯氦气(He)(>99.999%),流速为1.0 mL/min。柱温箱的升温程序如下:起始温度为40 ℃,保持1 min;然后以5 ℃/min的速率升温至160 ℃;最后以30 ℃/min的速率升温至220 ℃,并保持1 min。每次分析运行后,在280 ℃下后运行2 min以去除色谱柱中的残留物。质谱采用电子电离(EI)源,电子能量70 eV,离子源温度230 ℃,辅助加热器温度300 ℃,MS1和MS2四极杆温度为150 ℃。淬灭气为高纯氦气(He),流速为2.25 mL/min;碰撞气为高纯氮气(N2),流速为1.5 mL/min。每个样品进行两个独立重复。
通过比较保留指数(RI)和AMDIS获得的NIST 11 MS数据库中挥发性参考标准的质谱,确定了香气物质类别。每种香气标准品的校准曲线是根据10个梯度的模拟酒溶液进行分析后,通过目标化合物的峰面积与内标的峰面积之比与每种化合物的浓度之比建立校准曲线,对呋喃酮和内酯类化合物进行定量。
1.3.3 数据处理与统计学分析
使用Microsoft Excel 2021进行数据整理与计算;使用IBM SPSS Statistics 26进行统计学分析,所得数据统一进行单因素方差分析(anaylsis of variance,AVONA)(Duncan检验,P<0.05);使用SIMCA14进行偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)及绘图;使用Origin 2022绘制柱形图和相关性热图。
河西走廊产区、天山北麓产区、贺兰山东麓产区、胶东半岛产区、碣石山产区气象数据统计分析见图1。
图1 不同葡萄酒产区气象数据
Fig. 1 Meteorological data of different wines producing areas
由图1可知,西部的天山北麓产区、河西走廊产区和贺兰山东麓产区气候特征较为相似,有较高的光合有效辐射、光照时数、昼夜温差和较低的平均温度、降雨量,日照充足,较为干旱。其中,河西走廊产区有最高的光合有效辐射、昼夜温差和最低的平均温度,天山北麓产区有最高的光照时数。虽同为温带大陆性气候区[5],贺兰山东麓产区较其余两产区有较低的光合有效辐射、光照时数、昼夜温差和较高的平均温度、降雨量,气候更湿润温和。东部的胶东半岛产区、碣石山产区光合有效辐射、光照时数、昼夜温差较低,而平均温度、降雨量较高。这两个产区虽同属温带季风气候区[5],但胶东半岛产区光热水平较低且多雨。
对天山北麓产区、河西走廊产区、贺兰山东麓产区、胶东半岛产区、碣石山产区‘赤霞珠’、‘美乐’干红葡萄酒的香气物质含量进行分析,‘赤霞珠’和‘美乐’干红葡萄酒中香气物质含量测定结果分别见图2和图3。
图2 不同产区‘赤霞珠’干红葡萄酒挥发性风味物质含量测定结果
Fig. 2 Determination results of volatile flavor compounds contents in Cabernet Sauvignon dry red wines from different producing areas
图3 不同产区‘美乐’干红葡萄酒挥发性风味物质测定结果
Fig. 3 Determination results of volatile flavor compounds in Merlot dry red wines from different producing areas
由图2可知,‘赤霞珠’干红葡萄酒中内酯、呋喃酮及醛类物质含量总体呈现出西部产区高、东部产区低的特征,其中处于最西部的天山北麓产区内酯和呋喃酮类化合物显著最高(P<0.05)。相反,萜烯类和降异戊二烯类化合物在处于东部的胶东半岛及碣石山产区含量较高,显著高于河西走廊和贺兰山东麓产区(P<0.05)。此外,其他类物质在‘赤霞珠’干红葡萄酒中的浓度并未表现出明显的东西部差异(P>0.05),而是具有一定产区特色。河西走廊产区C6类物质含量较高,显著高于天山北麓产区(P<0.05),其苯环化合物及酯类物质含量显著较低(P<0.05);贺兰山东麓产区样品中醇类含量较高,其脂肪酸类物质含量显著较低(P<0.05)。
由图3可知,‘美乐’干红葡萄酒中内酯、呋喃酮、醛类物质在天山北麓产区含量较高;萜烯、降异戊二烯在胶东半岛产区含量较高,与‘赤霞珠’干红葡萄酒特点一致。此外,贺兰山东麓产区C6化合物含量显著低于其他产区(P<0.05),碣石山产区苯环化合物含量显著低于除贺兰山东麓产区的其他产区(P<0.05),胶东半岛产区酯类物质含量显著低于贺兰山东麓产区(P<0.05)。
为了明确各个产区‘赤霞珠’干红葡萄酒特征香气物质,建立PLS-DA模型,结果见图4。并对通过香气活性值(odor activity values,OAVs)进行定量评估的关键香气物质进行单因素方差分析见表2。香气活性值是香气化合物浓度与阈值的比值,能确切评价单一香气成分对整体香气的贡献,一般认为OAV>1的成分能被感知并促进葡萄酒的整体香气,本研究筛选出OAV>0.1的挥发性化合物作为关键香气物质。
图4 不同产区‘赤霞珠’干红葡萄酒香气物质偏最小二乘-判别分析的得分图(A)和载荷图(B)
Fig. 4 Score plot (A) and loading plot (B) of partial least squaresdiscriminant analysis of aroma substances in Cabernet Sauvignon dry red wines from different producing areas
表2 五个产区‘赤霞珠’和‘美乐’干红葡萄酒中关键香气化合物含量差异分析
Table 2 Differential analysis of key aroma compounds contents in Cabernet Sauvignon and Merlot dry red wines from 5 producing areas
注:小写字母不同表示差异显著(P<0.05);“nd”表示未检出。
-1)/(μg·L含量美乐珠霞赤描述香气阈值/-1)(μg·L JS JD HL HX TS JS JD HL HX TS 5 820.13±1087.17a 3 562.12±929.01b 1 905.13±380.12c 3 386.66±671.19b 4 646.11±2 343.15ab 6 717.92±2417.76b 5 820.31±859.36b 5 835.27±1 062.21b 8 462.65±2 149.46a 5 070.95±1 357.44b青、生青草[36]8 000 5.73±1.72a 6.11±2.68a 3.10±0.44bc 1.64±0.39c 4.71±1.86ab 3.37±0.84b 8.67±4.51a 3.25±0.91b 4.92±1.46b 4.18±1.53b蜜、花香甜香、蜂[36]0.02 6.61±5.40b 2.00±2.79b 12.62±2.03a 4.24±2.32a 13.66±2.2a nd 12.43±3.27a nd 12.80±2.94a 2.15±2.82ab 14.98±3.99a 5.14±1.61a 13.45±2.28a 4.09±1.04ab 11.01±2.12b 0.31±0.97b 9.96±2.11b nd 13.71±1.73a 4.75±0.80ab花香花香[36]25[3 7]23 31.67±8.5c 45.42±15.2b 60.58±19.84a 51.24±9.66ab 63.18±9.70a 45.01±8.27b 45.40±9.37b 33.40±5.03c 47.32±8.32b 108.24±15.75a莓草、煮焦糖[32]5 16.81±16.48ab 25.29±24.15ab 8.20±7.40ab 0.48±0.9b 27.99±29.28a 28.30±25.99a 32.61±20.82a 13.23±8.64ab 3.72±2.70b 33.52±30.7a莓草、煮焦糖[32]125 2.57±0.82ab 2.63±1.14ab 1.98±0.60b 2.36±1.80ab 4.55±3.55a 4.62±2.04a 3.69±0.26b 1.40±0.19d 3.66±0.52b 2.70±0.48c甜香、焦糖、咖喱[38]8 1.18±0.14ab 1.11±0.16b 1.42±0.28a 1.20±0.1ab 1.28±0.32ab 1.50±0.41a 1.23±0.17b 1.14±0.13b 1.18±0.19b 1.15±0.13b、核桃椰子、果香[30]7 6.60±1.49ab 5.79±2.32b 5.46±2.27b 7.87±1.31a 7.21±1.48ab 11.62±6.15ab 9.46±3.75bc 6.35±2.97c 6.39±2.36c 13.55±2.81a椰子、甜香、脂肪、桃、杏[30]25 0.65±0.13 0.71±0.12 0.62±0.14 0.76±0.13 0.65±0.23 0.67±0.43 0.85±0.16 0.63±0.13 0.70±0.16 0.66±0.10干、果肪、桃、脂焦糖[30]0.7 102538.45±16984.77b 109 232.54±9 819.46b 120475.38±16155.70ab 132886.65±23490.13a 115785.96±14514.87ab 127596.71±13874.38b 127723.90±35090.77b 158217.72±24155.15a 122509.40±23410.51b 120889.40±9337.34b奶酪[36]30 000 924.31±65.67ab 1 055.22±264.77a 753.62±109.66b 926.37±339.73ab 1 050.69±161.05a 1 082.83±142.86a 943.41±284ab 788.52±156.60b 923.92±100.11ab 1013.41±185.18a、奶酪、粗糙酸败[39]500 8.88±9.97 6.14±2.24 24.13±9.21 9.82±8.00 23.90±24.82 7.79±4.05 9.25±7.85 9.85±4.84 18.79±21.21 23.08±20.16生青、刺鼻[40]1 51 434.72±2 0805.62 58 433.13±32 185.51 73 936.88±23 260.30 96 577.03±37 282.38 58 413.45±22 286.20 86 078.65±35 114.10a 100109.75±69099.16a 86282.04±32579.34a 44 856.91±13 387.77b 77079.25±29511.76ab、瑰、玫蜜、蜂兰罗香紫、甜香果[36]14 000 153.20±93.33 111.21±46.23 77.06±16.35 141.69±25.18 189.42±76.76 163.13±19.91a 215.32±93.81a 96.35±13.35b 195.77±80.08a 182.33±47.18a花瑰玫[36]250 59 026.06±13 589.45c 86 904.57±21 112.27b 150538.36±15285.09a 90 503.5±25 688.54b 79 331.09±16 645.15b 83 365.79±28 903.66b 76074.62±30616.31b 129987.79±17114.51a 89582.40±18820.93b 77996.88±16821.24b果香、甜香[36]7 500 108.50±33.09ab 134.87±61.92a 90.35±7.72b 54.23±5.10c 91.29±18.76b 104.31±78.59ab 78.06±40.3b 133.41±39.07a 117.71±28.02ab 86.88±31.31ab果红色浆[29]20 7.20±6.94ab 4.55±1.91ab 8.80±2.27ab 4.13±0.54b 10.62±9.12a 4.84±2.52b 5.36±2.51ab 7.18±1.91ab 8.72±4.29a 8.70±4.41a果色浆果香、黑[29]1 3.82±0.90c 6.73±3.07b 14.56±3.12a 7.72±1.52b 6.45±3.23bc 3.79±2.43c 6.00±1.96bc 11.40±2.92a 3.91±1.11c 7.71±2.75b学味果香、化[29]3 1 151.53±182.15a 1 080.28±271.53a 986.92±114.15a 700.36±60.18b 1 124.09±207.74a 984.88±206.58bc 825.29±141.6c 1 355.06±403.54a 1 343.01±206.70a 1 125.74±237.56ab果浆红色[29]5 21379.52±20886.42b 45863.28±19475.76ab 38 976.69±24 623.89b 69 744.03±19 272.15a 46066.25±39070.40ab 50882.42±13850.47ab 63 043.42±28 410.67a 26 710.07±29 004.43b 29511.02±26134.010b 62370.63±31542.18a果香、甜香[31]100 000 393.63±81.58 390.31±142.26 403.59±94.42 354.9±100.42 468.42±77.62 380.77±122.38ab 288.32±158.68b 499.42±163.47a 504.94±110.26a 448.91±178.84ab果浆红色[29]2 8.16±81.29 66.37±71.42 51.20±56.93 69.11±54.68 128.86±90.23 115.27±75.69ab 47.14±68.82b 74.37±61.96ab 161.71±98.501a 126.95±125.82ab、果香甜香[41]200物合化己醇酮士β-大马醇那里醇茅香酮喃呋酮油酱内酯芭葫芦酯内γ-辛酯内γ-壬酯内γ-癸醇戊异辛酸壬醛醇乙苯乙酯苯乙酸乙酯乙酸丁酸乙酯酯乙丁酸基2-甲酯乙丁酸3-甲基己酸乙酯乳酸乙酯酯辛酸乙酯癸酸乙化合物种类物化合C6降异戊二烯类萜烯类类呋喃酮内酯类类醇高级类酸脂肪类醛环苯化合物类酯
由图4A可知,五个产区‘赤霞珠’干红葡萄酒均得到较好的聚类,东部的胶东半岛产区和碣石山产区葡萄酒集中在第二象限,说明两产区‘赤霞珠’干红葡萄酒香气轮廓接近,且区别于西部三个产区。由图4B可知,东部产区特征香气物质丰富多样,有降异戊二烯、萜烯、C6化合物、内酯、呋喃酮类、苯环化合物、高级醇、酯类和脂肪酸。结合关键香气物质单因素方差分析,东部产区里那醇含量显著高于西部河西走廊产区和贺兰山东麓产区(P<0.05),为葡萄酒贡献花香[21]。胶东半岛产区β-大马士酮含量显著高于其他产区(P<0.05),其阈值极低,对葡萄酒的香气有着非常重要的贡献,为葡萄酒贡献花香和甜香[22]。碣石山产区葫芦巴内酯和γ-辛内酯含量显著高于其他产区(P<0.05),前者为葡萄酒贡献甜香、焦糖、咖喱的香气[23-24],后者为葡萄酒贡献果香、椰子和核桃香气[25-26]。在发酵产生的香气物质中,东部产区乙酸苯乙酯和辛酸含量较高,前者贡献玫瑰花香[27],后者带来奶酪味[28]。推测东部产区‘赤霞珠’干红葡萄酒总体香气轮廓复杂,以花香、甜香为主。
由图4亦可知,西部产区特征香气物质种类多样,有C6化合物、内酯、呋喃酮类、降异戊二烯、萜烯、苯环化合物、高级醇、酯类和脂肪酸,推测总体香气轮廓以果香、甜香为主。河西走廊产区葡萄酒集中在第一象限,特征香气物质以酯类为主,此外还有C6化合物、苯环化合物和高级醇。结合关键香气物质单因素方差分析(见表2),河西走廊产区己醇含量显著高于其他产区(P<0.05),同时己酸乙酯、丁酸乙酯含量较高,香气轮廓可能生青味、红色浆果香突出[21,29]。天山北麓产区葡萄酒集中于第三象限,特征香气物质种类多样,有内酯、呋喃酮类、萜烯、苯环化合物、高级醇、醛类、脂肪酸和酯类。其呋喃酮含量显著高于其他产区(P<0.05),且γ-壬内酯、酱油酮、苯乙醇、乳酸乙酯和香茅醇含量较高,香气轮廓可能甜香、花香和果香突出[21,30-32]。贺兰山东麓产区葡萄酒集中于第四象限,特征香气物质以酯类物质为主,此外还有内酯、高级醇和醛类。其异戊醇含量显著高于其他产区(P<0.05),且辛酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯含量较高,香气轮廓可能以红、黑浆果香为主,伴有奶酪味[33-34]。
为了明确各个产区‘美乐’干红葡萄酒特征香气物质,建立PLS-DA模型见图5。由图5A可知,五个产区‘美乐’干红葡萄酒均得到较好的聚类,东西部产区由第一预测主成分区分。东部两产区葡萄酒集中于第一预测主成分负半轴,‘美乐’干红葡萄酒香气轮廓接近。由图5B可知,东部产区特征香气物质种类多样,有降异戊二烯、萜烯、C6化合物、内酯、呋喃酮类、苯环化合物、高级醇、酯类和脂肪酸。结合关键香气物质单因素方差分析(见表2),东部产区香茅醇、β-大马士酮含量显著高于河西走廊产区和贺兰山东麓产区(P<0.05),该产区的葡萄酒香气轮廓可能花香、甜香更为突出[22]。此外,碣石山产区己醇含量较高,可能具有植物味、青草味、生青味[21]。
图5 不同产区‘美乐’干红葡萄酒香气物质偏最小二乘-判别分析的得分图(A)和载荷图(B)
Fig. 5 Score plot (A) and loading plot (B) of partial least squaresdiscriminant analysis of aroma substances in Merlot dry red wines from different producing areas
由图5亦可知,西部三个产区葡萄酒均分布在第一主成分的正半轴,香气轮廓接近,且河西走廊产区和天山北麓产区葡萄酒主要集中在第一象限,说明两产区香气轮廓相似性较高。西部产区主要与内酯和酯类物质相关,香气轮廓可能甜香、果香突出。其中天山北麓产区和河西走廊产区葡萄酒主要集中于第一象限,香气轮廓接近,γ-壬内酯、呋喃酮、2-甲基丁酸乙酯和异戊醇含量较高,甜香与果香突出,有桃、杏、椰子、焦糖和煮熟的草莓香气,伴有奶酪味[30,32-33]。贺兰山东麓产区葡萄酒集中于第四象限,主要与内酯、高级醇、酯类相关,里那醇、γ-辛内酯、乙酸乙酯和3-甲基丁酸乙酯含量较高,香气轮廓可能花香、甜香、果香突出[22,30,34-35]。
产区气候差异对葡萄酒中果实来源的香气物质积累有较大影响,为进一步解析各产区气候对干红葡萄酒特征香气物质形成的影响,选取特征香气物质中源于果实并形成花香和甜香的萜烯、β-大马氏酮、呋喃酮和内酯类含量数据,与各产区气象因子进行皮尔逊相关性分析,结果见图6。
图6 气象因子与‘赤霞珠’(A)和‘美乐’(B)干红葡萄酒香气物质的相关性分析
Fig. 6 Correlation analysis between meteorological factors and aroma substances in Cabernet Sauvignon (A) and Merlot (B) dry red wines
由图6可知,‘赤霞珠’和‘美乐’干红葡萄酒中降异戊二烯类物质β-大马氏酮以及萜烯类物质α-萜品醇和香茅醇含量,与降水量和平均温度呈正相关,与光合有效辐射、光照以及昼夜温差呈负相关。萜烯类物质从葡萄转色开始大量积累,在接近成熟时含量达到峰值,随后略有下降,其积累通常与果实中糖分积累同步。
WEN Y Q等[42]研究了气候差异极大的两个葡萄酒产区白麝香葡萄挥发性化合物的差异,发现来自降雨量少、日照强度大的产区浆果游离和糖苷结合的萜类化合物含量较低,结合转录因子和成熟相关基因的表达模式推测,少雨和强光照环境促进成熟相关基因的早期表达,加速果实成熟,最终限制萜类挥发物的生成,与本研究结果一致。但也有研究表明,高温、充足的日照和水分胁迫有利于萜烯类化合物的形成[43]。降异戊二烯类化合物是类胡萝卜素降解的产物,类胡萝卜素的含量主要受果实发育阶段的调节,但温度、土壤、光照、降雨等环境因素也影响其含量。ROBINSON A L等[44]研究显示,来自温暖或炎热气候的雷司令葡萄酒与来自凉爽气候的雷司令葡萄酒相比,有更高浓度的降异戊二烯类物质,而CHEN W K等[45]的研究则显示,在凉爽气候区域β-大马氏酮及成熟葡萄中的总降异戊二烯类化合物的浓度高于温暖气候区域。BINDON K A等[46]的研究则证明,水分胁迫能够提高葡萄果实中类胡萝卜素和降异戊二烯类物质的含量,同时,TIAN M B等[47]研究了新疆‘赤霞珠’葡萄的果穗微气候与酿酒葡萄栽培以及葡萄酒的关系,结果表明光照促进了萜烯和降异戊二烯的积累。环境因素对于萜烯和降异戊二烯类化合物的调节十分复杂,尤其是果际微气候的影响,现有针对多个葡萄品种的研究显示摘叶处理能够显著提高葡萄或葡萄酒中萜烯和降异戊二烯类化合物浓度[48-53]。研究表明,植株覆盖遮光网导致的光合有效辐射降低会提高葡萄酒中β-大马士酮含量[54],但也有行间覆盖实验证明减弱葡萄园地面反射的光辐射会降低‘赤霞珠’果实中的萜类和降异戊二烯类化合物的含量[55]。由于很难区分各个环境因素,加之栽培管理方式对果际微气候的影响,目前无法彻底明确单一风土条件对萜烯和降异戊二烯积累的影响。
‘赤霞珠’和‘美乐’干红葡萄酒中呋喃酮含量与光合有效辐射、光照和昼夜温差呈正相关,与降水量呈负相关。葡萄酒中呋喃酮来源于葡萄果实中糖代谢、酵母代谢和橡木制品,大量研究证实在植物中D-果糖-1,6-二磷酸是生物合成这类物质的关键前体物[56-57],其关键酶烯酮氧化还原酶(enone oxidoreductase,FaEO)与果实成熟进程呈正相关[58]。有研究表明在葡萄果实过熟过程中和成熟前后的高温会导致戊糖或己糖的美拉德反应会增加呋喃酮的浓度[59]。此外,呋喃酮也在酒精发酵阶段通过酵母代谢大量释放,其浓度与葡萄果实的干化程度呈正相关[23]。KOBAYASHI H等[60]研究了四个地区'Muscat Bailey A'葡萄酒酒中呋喃酮含量差异,结果显示环境条件的影响并不显著,而晚收则会提高最终呋喃酮含量。现有研究中产区环境因素对于呋喃酮类物质积累的影响研究较少,需进一步探索。
内酯类物质含量总体呈现出与光合有效辐射、光照、昼夜温差呈正相关,与降水量、平均温度呈负相关。大量的研究证实长链脂肪酸是生物合成内酯类物质的前体物,据报道,植物和微生物中不饱和脂肪酸首先经羟基化产生羟基脂肪酸,然后经β-氧化、异构化和内酯化产生内酯类物质[56],DE FERRON P等[61]的研究证实了在葡萄酒中4-氧代壬酸通过酿酒酵母转化为γ-壬内酯。FANG Y等[62]研究发现,葡萄酒中γ-壬内酯含量与‘黑比诺’葡萄成熟度呈正相关,LONGO R等[63]的研究也表明较晚采摘、成熟度更高的‘小味儿多’葡萄酿造的葡萄酒中γ-壬内酯含量显著更高。非生物胁迫如日灼和成熟后期失水引起的葡萄果实干化也可以增加葡萄果实和相应的葡萄酒中内酯类物质的浓度[64-67]。风土对于内酯类物质的影响研究较少,ALLAMY A等[26]研究了同一区域不同年份葡萄酒香气物质含量,发现在平均温度较高的年份C10马索亚内酯和γ-壬内酯的浓度较高,但此结果并未考虑其他气候因子,环境因素对于内酯类物质积累的影响还需进一步研究。
本研究分析了来自西部的天山北麓产区、贺兰山东麓产区、河西走廊产区和东部的碣石山产区、胶东半岛产区五个产区的‘赤霞珠’和‘美乐’干红葡萄酒的特征香气物质及其与气候因子的关联。结果表明,东部和西部产区干红葡萄酒香气轮廓差异明显,东部产区花香与甜香突出,西部产区甜香与果香突出,来源于果实的主要差异物质是萜烯、降异戊二烯、呋喃酮和内酯类化合物。萜烯和降异戊二烯类化合物含量总体呈现出东部产区高、西部产区低的特征,与东部产区较高的降水量和平均温度和较低的光合有效辐射、光照以及昼夜温差相关。而内酯、呋喃酮类物质含量总体呈现出西部产区高、东部产区低的特征,与西部产区较高的光合有效辐射、光照和昼夜温差和较低的降水量相关。
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