水溶性维生素包括维生素B2（vitamin B2，VB2）（核黄素）、烟酸（VB3）、烟酰胺（VB3）、吡哆醇（VB6）、吡哆醛（VB6）、吡哆胺（VB6）、生物素（VB7）等，是维持人体生长、发育和代谢所必需的物质，婴幼儿一旦长期缺乏维生素，可能会引起多种疾病[1-5]。由于婴幼儿食物来源单一，婴幼儿配方奶粉中必须含有满足婴幼儿生长发育需要的各种营养素，其中很重要的一类是水溶性维生素，VB2、烟酸、烟酰胺、吡哆醇、吡哆醛对婴幼儿获得最佳生长发育和生理功能的维持是必需的，是婴幼儿配方食品中必需营养素，因此，有必要对婴幼儿配方奶粉中的B族维生素含量进行测定。
婴幼儿配方奶粉中水溶性维生素的测定方法主要有微生物法[6-8]、分光光度法[9]、高效液相色谱法（high perfor mance liquid chromatography，HPLC）[10-12]、毛细管电泳法[13]、液相色谱-串联质谱法[14-16]、二维液相色谱法[17]等。由于婴幼儿奶粉中水溶性维生素结构和性质各不相同，含量水平差异较大，且奶粉基质复杂，现行国标方法多以测定单一维生素为主[18-19]，流程繁琐，效率较低，具有一定的局限性。近年来，文献报道的采用液相色谱法同时检测婴幼儿配方奶粉中水溶性维生素方法，大都采用单一检测器（二极管阵列检测器或荧光检测器）[20-22]，部分维生素响应很低，检出限较高，导致同时测定婴幼儿奶粉中多种维生素的方法不理想。采用液相色谱-串联质谱法[23]、二维液相色谱法[24]同时测定婴幼儿奶粉中水溶性维生素含量方法，成本较高，难以普及，而高效液相色谱-串联二极管阵列检测器和荧光检测器（high performance liquid chromatography-diode array detector-fluorescence detector，HPLC-DAD/FLD）双检测器法成本较低，既能确保数据的准确性又能满足实际工作的需要[25]。
本研究结合二极管阵列和荧光检测器特点，基于双检测器串联的方法，使用二极管阵列检测器测定婴幼儿奶粉中含量较高的烟酸、烟酰胺，荧光检测器测定含量较低的VB2、吡哆醇、吡哆醛，同时，对高效液相色谱双检测器串联测定VB2、烟酸、烟酰胺、吡哆醇、吡哆醛含量方法的不确定度进行评定，旨在为婴幼儿配方奶粉中B族维生素的测定提供简便、快速、高通量、准确度高的方法，对方法的可行性和准确性提供科学的判断依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
婴幼儿配方奶粉：市售；甲醇、异丙醇、磷酸（均为色谱纯）：Supelco公司；甲酸（色谱纯）：Aladdin公司；VB2（97.34%）、烟酸（99.9%）、烟酰胺（99.39%）、吡哆醇（99.1%）、吡哆醛（99.9%）（均为标准物质）：Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司；庚烷磺酸钠（分析纯）：上海展云化工有限公司；高氯酸（分析纯）：上海沪试实验室器材股份有限公司。
1.2 仪器与设备
DionexUltiMate3000高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器和荧光检测器）、Hypersil GOLDTM aQ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美国Thermo公司；PM3-900TL型超声波清洗机：英国PRIMA公司；QDirect8超纯水处理器：美国Millipore公司；Vortex Genie 2涡旋振荡器：美国Scientific Industries公司；TOLEDOME204型分析天平（精确到±0.1mg）、FE28 pH计：瑞士METTLER TOLEDO公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
水溶性B族维生素标准储备液的制备：分别称取约10mg烟酸、烟酰胺、VB2、吡哆醇、吡哆醛标准物质，0.1 mol/L盐酸定容至10 mL，配制成1 mg/mL标准储备液。标准储备液在使用前按照GB 5009.85—2016《食品安全国家标准食品中维生素B2的测定》附录A、GB 5009.89—2016《食品安全国家标准食品中烟酸和烟酰胺的测定》附录B、GB 5009.154—2016《食品安全国家标准食品中维生素B6的测定》附录A方法分别对其进行校正。取上述标准储备液适量，分别用超纯水稀释，配制成混合标准工作溶液。
1.3.2 样品前处理
称取奶粉试样约3.0 g（精确到0.000 1 g），加入1%甲醇的0.1%磷酸水溶液30 mL，涡旋1 min，超声30 min，冷却至室温，用1%甲醇的0.1%磷酸水溶液定容至50 mL，混匀后经滤纸过滤，滤液用0.45 μm的水系微孔滤膜过滤，待测。
1.3.3 色谱条件
色谱柱：Thermo Hypersil GOLDTM aQ 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：35 ℃；流动相A：异丙醇-庚烷磺酸钠水溶液（20 mL异丙醇，1 g庚烷磺酸钠，150 μL高氯酸，超纯水定容至1 L），流动相B：甲醇；梯度洗脱程序：0～22 min，95%A，22～33 min，70%A，33～38 min，95%A；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；检测器：二极管阵列检测器与荧光检测器串联。检测波长：烟酸与烟酰胺261 nm（二极管阵列检测器）；吡哆醇与吡哆醛激发波长293 nm，发射波长395 nm（荧光检测器）；VB2激发波长462 nm，发射波长522 nm（荧光检测器）。
1.3.4 定性定量方法
根据标准物质的保留时间对样品峰进行定性，采用外标法，通过建立峰面积和标准工作溶液的线性关系，计算样品中目标化合物的含量。
2 结果与分析
2.1 前处理条件的选择
本研究比较了沉降剂沉降、酸沉降、酶解法3种前处理方法对目标物定性、定量结果的影响，HPLC检测结果见图1。
图1 利用沉降剂（a）、酶解法（b）和酸沉降法（c）处理婴幼儿配方奶粉样品的色谱图
Fig.1 Chromatogram of infant formula sample treated with settling agent (a), enzymatic hydrolysis (b) and acid deposition (c)
图c中1为烟酸，2为烟酰胺，3为吡哆醛，4为吡哆醇，5为核黄素。
由图1可知，沉降剂（92 g/L亚铁氰化钾溶液和183 g/L乙酸锌溶液）沉降法不能较好的去除强极性杂质，对烟酸、烟酰胺的定量和定性产生干扰；酶解法（木瓜蛋白酶），操作较复杂，耗时长，且在色谱峰出峰前5 min内杂质较多，影响烟酸的定量；酸（1%甲醇的0.1%磷酸水溶液）沉降除杂效果较为理想，溶剂效应较小，且前处理操作简单。故选择酸沉降的方法对蛋白质进行沉淀。
2.2 色谱条件优化
2.2.1 色谱柱选择
本研究比较了三种液相色谱柱，Thermo Hypersil GOLDTM aQ液相色谱柱、PFP液相色谱柱和C30液相色谱柱对目标物及干扰物质的分离效果。结果表明，PFP色谱柱对于极性较强的烟酸、烟酰胺保留较差，出峰时间在2.5 min之前，不易与强极性化合物杂质分离，C30色谱柱在耐酸性及耐纯水性方面不理想，柱子容易塌陷；Thermo Hypersil GOLDTM aQ液相色谱柱柱效更高，能够有效分离五种目标物，且抗干扰能力更强，所以选择该色谱柱进行试验。
2.2.2 流动相的选择
通过对比GB 5009.85—2016《食品安全国家标准食品中维生素B2的测定》、GB 5009.89—2016《食品安全国家标准食品中烟酸和烟酰胺的测定》、GB 5009.154—2016《食品安全国家标准食品中维生素B6的测定》中流动相乙酸钠溶液-甲醇体系、三乙胺-辛烷磺酸钠-甲醇体系与异丙醇-庚烷磺酸钠水溶液-甲醇体系，从出峰时间和峰型等影响因素分析，最终选择异丙醇-庚烷磺酸钠水溶液-甲醇体系，并比较了异丙醇-庚烷磺酸钠水溶液-甲醇体系流动相pH在2.5、3.0、3.5、4.0时的色谱图，根据峰型最终选用高氯酸调节pH至3.5，梯度洗脱的方式对目标物进行分离。
2.3 检测器的选择
B族维生素混合标准溶液在二极管阵列检测和荧光检测器检测的色谱图见图2。由图2可知，5种目标化合物在二极管阵列检测器上均有响应，VB2、吡哆醇、吡哆醛在荧光检测器上也有响应，但是用二极管阵列检测器对VB2、吡哆醇、吡哆醛进行检测灵敏度很低，故考虑使用二极管阵列检测器测定烟酸、烟酰胺，用灵敏度较高的荧光检测器测定VB2、吡哆醇、吡哆醛。采用两个检测器串联的方式，达到一次进样、同时测定的目的。
图2 B族维生素混合标准溶液色谱图
Fig.2 Chromatogram of B vitamins mixed standard solution
1.烟酸；2.烟酰胺；3.吡哆醛；4.吡哆醇；5.核黄素。
2.4 方法的线性范围、检出限与定量限
在优化的最佳测定条件下，对各浓度梯度下B族维生素进行测定，以峰面积（Y）为纵坐标，以各营养素质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，分别根据信噪比（S/N）=3和S/N=10确定各种水溶性维生素的检出限和定量限，结果见表1。
表1 方法的线性范围、回归方程、检出限与定量限
Table 1 Linear range, regression equation, detection limit and quantification limit of the method
B族维生素 线性范围/（μg·mL-1） 回归方程 相关系数（R2） 检出限/（μg·100 g-1） 定量限/（μg·100 g-1）VB2烟酸烟酰胺吡哆醇吡哆醛0.025～4.000 0.125～20.00 0.125～20.00 0.025～4.000 0.025～4.000 y=175 572x+102.18 y=0.736 5x+0.006 7 y=0.769 2x+0.010 2 y=228 863x+710.43 y=154 782x+2407.5 1.000 0 0.999 9 0.999 9 0.999 5 0.999 7 20.0 70.0 70.0 20.0 20.0 40.0 200.0 200.0 40.0 40.0
由表1可知，VB2在0.025～4.000 μg/mL范围内相关系数R2为1.000 0，烟酸、烟酰胺在0.125～20.00 μg/mL范围内相关系数R2都为0.999 9，吡哆醇、吡哆醛在0.025～4.000 μg/mL范围内相关系数R2分别为0.999 5、0.999 7，各目标物在一定的质量浓度范围内线性关系良好。VB2、烟酸、烟酰胺、吡哆醇、吡哆醛的检出限为20.0～70.0 μg/100 g；定量限为40.0～200.0 μg/100 g，均能满足婴幼儿配方奶粉的检测要求。
2.5 方法的精密度与加标回收率
用空白基质进行加标回收实验，分别按定量限、2倍定量限和10倍定量限三种浓度水平添加，制备加标回收样品，按照上述实验操作进行6次平行实验，并计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表2。
表2 方法的回收率和精密度实验结果
Table 2 Results of recovery rates and precision tests of the method
名称 加标量/（μg·mL-1）测定平均值/（μg·mL-1）平均回收率/%相对标准偏差/%VB2烟酸烟酰胺吡哆醛吡哆醇0.020 0 0.040 0 0.200 0 0.040 0 0.080 0 0.400 0 0.048 0 0.096 0 0.480 0 0.020 0 0.040 0 0.200 0 0.020 0 0.040 0 0.200 0 0.020 5 0.042 3 0.186 4 0.039 6 0.084 1 0.381 7 0.050 9 0.091 8 0.473 5 0.021 6 0.040 9 0.200 1 0.021 2 0.038 8 0.188 9 102.50 105.75 93.20 99.00 105.13 95.43 106.04 95.63 98.65 108.00 102.25 100.05 106.04 97.00 94.45 1.48 6.43 4.96 2.19 2.85 2.33 3.42 1.17 4.11 8.12 7.63 5.64 6.01 2.95 7.55
由表2可知，VB2的回收率为93.20%～105.75%，相对标准偏差为1.48%～6.43%；烟酸的回收率为95.43%～105.13%，相对标准偏差为2.19%～2.85%；烟酰胺的回收率为95.63%～106.04%，相对标准偏差为1.17%～4.11%；吡哆醛的回收率为100.05%～108.00%，相对标准偏差为5.64%～8.12%；吡哆醇的回收率为94.45%～106.04%，相对标准偏差为2.95%～7.55%。该方法的准确度和精密度较好，可以满足实验需求。
2.6 不确定度评定
应用该方法对婴幼儿配方食品中烟酸、烟酰胺、吡哆醇、吡哆醛、VB2的含量进行测定，通过构建不确定度评定数学模型，根据CNAS—GL006：2018《化学分析中不确定度的评估指南》及JJF1135—2005《化学分析测量不确定度评定》，对其不确定度的来源进行分析和量化，计算各个影响因素的不确定度，其中重复性相对不确定度与回收率相对不确定度中取较大值带入标准不确定度的合成计算，结果见表3。
表3 B族维生素的不确定度分量
Table 3 Uncertainty components of B vitamins
不确定度来源样品前处理标准物质（标准储备液）混合标准中间液配制标准系列工作溶液配制标准曲线拟合测量重复性测量偏差（回收率）相对标准不确定度烟酸 烟酰胺 吡哆醇 吡哆醛 VB2 0.005 2 0.011 0.005 3 0.004 4 0.031 0.013 0.013 0.005 2 0.011 0.005 3 0.004 4 0.015 0.0092 0.0095 0.005 2 0.011 0.005 3 0.004 4 0.057 0.015 0.016 0.005 2 0.011 0.005 3 0.004 4 0.039 0.012 0.012 0.005 2 0.011 0.005 3 0.004 4 0.017 0.013 0.013
根据表3评定结果计算得知，取包含因子k=2、95%置信度下，当婴幼儿配方食品中烟酸含量为4 mg/100 g时，其扩展不确定度为0.300 mg/100 g（k=2）；烟酰胺含量为4 mg/100 g时，其扩展不确定度为0.182 mg/100 g（k=2）；吡哆醇含量为800 μg/100 g时，其扩展不确定度为100 μg/100 g（k=2）；吡哆醛含量为800 μg/100 g时，其扩展不确定度为71.5 μg/100 g（k=2）；VB2含量为800μg/100g时，其扩展不确定度为41.9μg/100 g（k=2）。从表3可知，不确定来源主要为标准溶液配制及标准曲线拟合。在实验过程中，考虑选用高等级标准物质、对移液器等量具和仪器进行检定校准、增加平行测定次数等手段来尽可能地降低测量不确定度，提高检测结果的可信性。
2.7 实际样品检测
随机选取12批次市售婴幼儿配方奶粉，按照上述优化的方法对B族维生素进行测定，结果见表4。随机选取一批次样品与国标方法进行比较，结果见表5。
表4 婴幼儿配方奶粉中B族维生素的测定结果
Table 4 Determination results of B vitamins in infant formula μg/100 g
样品 VB2 烟酸 烟酰胺 吡哆醛 吡哆醇1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 1 256 1 100 1 408 1 361 1 179 1 373 1 614 2 090 1 839 1 819 1 563 1 240 166 4 526 23 72 196 139 78 83 7 80 422 460 4 173 352 4 205 6 511 4 279 4 684 6 896 4 713 8 137 6 042 4 473 4 900 37 29 35 60 94 56 94 73 36 74 65 52 693 509 591 618 641 476 659 448 730 348 413 247
表5 该方法与国标方法测定的对比结果
Table 5 Comparison results of the method with national standard methods
VB2/（μg·100 g-1）VB6/（μg·100 g-1）本方法测定值国标方法测定值VB3/（μg·100 g-1）1 256 1 250 4 372 3 863 730 691
由表5可知，测定结果均符合GB 10765—2010《食品安全国家标准婴儿配方食品》、GB 10767—2010《食品安全国家标准较大婴儿和幼儿配方食品》相关限量规定，且满足GB 13432—2013《食品安全国家标准预包装特殊膳食用食品标签》中规定的营养成分的实际含量不应低于标示值的80%的要求。
3 结论
本方法建立了利用液相色谱法同时测定婴幼儿配方奶粉中多种B族维生素的方法，利用二极管阵列检测器和荧光检测器串联的方式，实现含量较高的烟酸、烟酰胺和含量较低的VB2、吡哆醇和吡哆醛同时测定，大大提高了工作效率，该方法能同时满足GB 5009.85—2016、GB 5009.89—2016、GB 5009.154—2016三个食品安全国家标准的检测要求，为婴幼儿配方奶粉中水溶性营养素的检测方法提供了新的思路，可以为婴幼儿配方奶粉中水溶性营养素的质量监控与检测提供技术参考。
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