芥菜（Brassica juncea（L.）Czern.et Coss.）是十字花科（Cruciferae）芸薹属植物，含有丰富的维生素和纤维素等[1]。腌制后的芥菜，具有淡黄的色泽，爽脆的口感，酸香的风味，深受人们喜爱，因此，芥菜产业具有很大的发展前景[2]。湖南省岳阳市华容县由于其优越的地理位置，十分适宜芥菜生长，是中国芥菜之乡，“华容芥菜”也成为国家地理标志[3]。发酵芥菜深受人们欢迎的一个重要原因是其独特的香气风味，芥菜原料本身自带某些特殊的气味，在发酵过程中乳酸菌、酵母菌等微生物发酵也产生许多风味物质，共同构成了发酵芥菜产品独特复杂的风味[4]。目前，工业化生产发酵芥菜均采用标准腌制池进行发酵，但是关于标准腌制池发酵的华容芥菜挥发性成分研究较少，且发酵芥菜挥发性成分研究的对象主要是实验室自制发酵芥菜[5-7]。
目前，主要采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（headspace solid phase microextration gas chromatographymass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术研究挥发性风味物质[5，8]。HS-SPME-GC-MS技术能较真实地反映样品挥发性风味组成，但要鉴定对整体有重要贡献的关键活性香气成分，则需要借助香气活度值（odor activity value，OAV）[9]。目前，多元统计学分析方法也常被用于深入分析挥发性风味物质[10-12]，同时也有许多研究者将多种方法结合起来进行研究，如高航等[11]采用GC-MS、电子鼻和气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技术结合正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）的多元统计分析方法筛选出了不同发酵阶段红曲米醋的特征性组分；邵淑贤等[12]采用电子鼻、HS-SPME-MS技术结合OPLS-DA、OAV技术筛选出不同产地黄观音茶差异香气物质。
为了进一步了解标准腌制池发酵华容芥菜过程中挥发性风味成分的变化规律，本研究采用HS-SPME-GC-MS方法对不同发酵阶段华容芥菜的挥发性风味物质进行跟踪检测，结合OPLS-DA和OAV筛选发酵过程中的特征挥发性风味成分，以期为发酵华容芥菜的香气调控和风味改善提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
新鲜芥菜（D0），发酵30d（D30）、90d（D90）、180d（D180）、270 d（D270）、360 d（D360）的发酵芥菜样品来源于湖南插旗菜业有限公司。腌制的芥菜品种为华容大叶芥菜，在标准腌制大池内采用一层盐一层芥菜的方法铺满腌制池，食盐用量为15%左右，表层用食品级薄膜覆盖密封，重物压实。从标准腌制池的上层、中层和底层随机抽取发酵芥菜样品，用搅拌机研磨碎，混合均匀后为一个样品，每组样品进行3次重复。
1.1.2 试剂
邻二氯苯（纯度≥99%）：上海麦克林生化科技股份有限公司；正己醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头：美国Supelco公司；QP2010 Ultra GC-MS联用仪：日本Shimadzu公司。
1.3 方法
1.3.1 挥发性风味物质分析
参照文献[7]的方法，稍作修改。
HS-SPME条件：将发酵芥菜样品4.00 g于20 mL顶空进样瓶中，加入10 μL内标（26.12 μg/mL邻二氯苯，溶剂为正己醇），密封后置于70 ℃恒温磁力搅拌器加热20 min，再将老化后的萃取头插入顶空进样瓶中70 ℃吸附45 min，然后将萃取头插入GC-MS仪器进样口，250 ℃解吸5 min。
GC条件：DB-5ms色谱柱（0.25 μm×0.25 mm，30 m）；载气为高纯氦气（He），流速1 mL/min；进样口温度250 ℃；升温程序为初始温度40 ℃保持2 min，以4 ℃/min线性升温至80 ℃，再以3.5 ℃/min线性升温至240 ℃，保持4 min。
MS条件：离子源为电子电离（electronic ionization，EI）源；离子阱温度220 ℃，传输线温度28 ℃；扫描范围为50～1 000 amu；电子能量为70 eV；溶剂延迟时间5 min。
定性、定量：通过美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）17谱库进行定性；采用内标法进行定量[13]。
1.3.2 香气活度值计算
OAV计算公式如下[14]：
式中：Ci为某挥发性风味物质的质量浓度，μg/kg；OTi为某挥发性风味物质的气味阈值，μg/kg。
1.3.3 数据处理
每组样品进行3次重复；采用SPSS 22.0统计软件对数据进行方差分析；采用Microsoft Excel 2016进行数据归类、作图；采用Origin 9.1绘制聚类分析热图；在数据分析网站（https：//bioincloud.tech）上进行多元统计分析。
2 结果与分析
2.1 华容芥菜发酵过程中挥发性风味物质种类及含量变化分析
采用HS-SPME-GC-MS测定发酵过程中华容芥菜的挥发性风味物质，结果见表1。
表1 华容芥菜发酵过程中挥发性风味物质GC-MS检测结果
Table 1 Determination results of volatile flavor substances in Huarong mustard during fermentation process analyzed by GC-MS
序号 种类 化合物n1 n2 n3 n4 n5 n6 n7 n8 n9 n10 n11 n12异硫氰酸酯类n13 n14 n15 n16 n17 n18 n19 n20 n21 n22 n23 n24 n25 n26 n27 n28 n29 n30 n31 n32 n33 n34 n35 n36 n37 n38 n39酯类n40 n41 n42醛类异硫氰酸烯丙酯异硫氰酸异丙酯异硫氰酸丁酯异硫氰酸异丁酯3-丁烯基异硫氰酸酯异硫氰酸异戊酯异硫氰酸戊酯4-甲基戊基异硫氰酸酯3-（甲硫基）丙基异硫氰酸酯异硫氰酸苯乙酯异硫氰酸3-甲基己酯硫氰酸2-丙烯酯小计亚硫酸丁基己酯2-甲基丁酸乙酯二氢猕猴桃内酯3-苯丙酸乙酯邻苯二甲酸二异丁酯n-戊酸cis-3-己烯-1-基酯9-十六碳烯酸乙酯三氟乙酸1-辛酯Z-3-甲基丁酸-3-己烯酯丁氧基乙酸丁酯乙酸叶醇酯癸酸甲酯癸酸乙酯月桂酸甲酯月桂酸乙酯十一酸乙酯丁酸乙酯辛酸甲酯辛酸乙酯壬酸乙酯己酸乙酯亚麻酸甲酯棕榈酸甲酯亚麻酸乙酯棕榈酸乙酯肉豆蔻酸甲酯肉豆蔻酸乙酯小计己醛庚醛辛醛含量/（μg·kg-1）D0 D30 D90 D180 D270 D360 21 197.01±2 532.15a 67.88±3.56a 496.54±21.21a 161.24±21.21a 699.11±19.80a 321.83±21.50a 54.046±2.41a 45.04±2.28a 1 813.79±24.00a 2 891.32±21.21a 2 197.87±13.70b-35.26±0.45b 7.83±0.74b 58.33±2.54b 986.52±34.46b-20.70±0.71bc 8.77±0.56b 282.93±46.71b-0.83±0.04c-3.59±0.21c 89.91±15.34b 50.32±9.11b-5.26±1.07c-- - --- - - --- - - - - ——- - - - - --- - - - - - - - - -27 747.81 95.14±8.02b 36.66±0.29a 31.14±1.00a 2 462.19 287.34 89.91 7.12±00.32c-62.67-- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - --- - -35.59±0.28c 14.38±1.74b-1 065.96 18.55±00.35a 9.78±00.55a 12.08±0.66a 196.70±9.52a-- --- --- -5.83±0.51b 6.81±0.98b 24.53±0.50a 17.70±3.17a--4.36±0.54b-3.50±0.85b-- - - -20.21±0.35a-- --- - --- - -1.96±0.07a-- -1.78±0.20a 1.63±0.14b-1.37±0.08a 5.18±0.62a 26.52±1.50b-1.62±0.28b--14.02±0.86a 23.24±1.02a—— - - - -10.30±0.76bc 65.00±2.15a 746.66±19.84a 17.81±0.20a 43.52±4.10a 6.02±0.02b 42.51±10.45a 2.76±0.15a 74.20±3.60a 1.46±0.20a 20.92±1.47a 19.17±8.54a 26.79±1.97a 65.00±6.24a 151.79±38.40a 12.12±0.92a 57.89±1.50a 1 610.96 25.11±5.36b-- -5.76±0.42a 22.37±3.95b-3.92±0.14b 7.00±0.01a-- ——-4.35±1.59cd 4.08±0.14d-8.22±0.56b 19.62±1.38b-14.77±1.39b 1.72±0.16b 14.58±0.97b 3.76±0.14bc 11.66±2.49b——12.51 65.60±3.75a 4.27±0.63a 3.94±0.85b 131.57 68.19±0.78a 2.37±0.10b 8.84±1.44a 22.46±2.02b-4.20±0.53d-3.63±0.93d 3.23±0.11b 7.59±0.73c 7.84±0.16b 21.412±0.88b-2.39±0.59c 104.93--2.25±0.40b 5.68±1.01cd 7.08±0.70b 20.25±0.76b 0.90±0.33c 3.64±1.56bc 88.09 8.38±0.78c-3.06±0.14b 8.41±0.23c-8.81±0.17c 4.59±0.34b 5.33±0.18cd 8.37±0.83b 21.72±0.13b 2.42±0.11b 4.90±0.19b 112.36-1.28±0.27c--- -
续表
序号 种类 化合物n43 n44 n45 n46 n47 n48 n49 n50 n51 n52 n53 n54 n55 n56 n57 n58 n59 n60 n61 n62 n63 n64 n65 n66 n67 n68 n69醇类n70 n71 n72 n73 n74 n75 n76酮类n77 n78 n79 n80 n81硫醚类n82 n83烯类壬醛癸醛苯甲醛苯乙醛4-乙基-2-己炔醛（E）-2-庚烯醛反式-2-癸烯醛（E,E）-2,4-庚二烯醛反式-2-己烯醛β-环柠檬醛2-苯基巴豆醛十一醛2-十一烯醛月桂醛13-十八烯醛2,6,6-三甲基-1-环己烯基乙醛小计桉叶油醇4-萜烯醇月桂醇1-辛烯-3-醇反-3-己烯醇3-甲基-2-戊醇异辛醇芳樟醇苯乙醇2,3-二甲基环己醇2-十二烯醛醇小计4-哌啶酮香叶基丙酮β-紫罗兰酮甲基庚烯酮六氢假紫罗酮2-莰酮植酮小计烯丙基甲基二硫醚二甲基三硫二甲基四硫醚甲基烯丙基三硫醚乙二醇二烯丙基醚小计3-蒈烯茴香脑含量/（μg·kg-1）D0 D30 D90 D180 D270 D360 107.56±4.95a 23.51±0.76b--33.68±3.92c 36.30±2.81a 24.60±0.44a 5.46±0.63d 1.90±0.28e 14.19±1.04b 5.38±0.15b 10.82±0.79d 7.30±0.35d 26.18±0.81a 8.65±0.49a 11.63±0.32d 5.46±0.21d 23.99±1.63a 3.41±0.54c 3.71±0.24a-- --- - ——- -122.09±2.5a 24.24±2.26a 29.25±1.86a 5.62±0.86b 9.66±0.07b-17.49±1.18b 26.72±0.35b 9.43±0.28a 1.03±0.05a 10.39±0.36b-3.07±0.22d 2.62±0.28c-5.23±1.32d-1.42±0.58c-- - - -5.08±0.74d-- - --- - --- - - - --- - --- - - - -389.80 15.31±1.50a 16.02±1.26a 41.20±1.92b 14.52±1.34c 9.27±1.67c 9.06±0.71a-2.85±0.50a-22.70±4.44a-12.61±3.05c 23.31±0.52c-4.71±0.20a 2.79±0.20a 1.74±0.05a 6.81±0.15a 230.97 182.98 52.88 63.51 49.56—— - - - - - - -4.54±1.00a 4.37±0.18a 21.61±1.50a 17.59±0.50a-- - - - --- --- -3.34±0.16b 3.20±0.28b-- - - --- - --- -1.62±0.32b 24.26±1.07b--31.33 216.39±6.00a 4.06±1.13c 99.42±4.89a 17.74±1.41c-2.44±0.36a 23.53-2.24±1.51c 5.89±0.31d-- - - - - - - - - - -3.67±0.71c 8.41±0.73d-- - -48.11-9.72±2.17b 30.04±0.43c 7.48±0.14a 2.80±0.05a 29.08-5.30±1.68c 6.59±0.79d 4.51±0.80c—— - ——- - -319.87 2.66±0.42c 36.96±1.58a 8.03±0.42a 8.13-4.36±0.59c 2.79±0.84b 19.19-7.89±0.90c—— ---47.66 5.53±0.68a 17.56±0.92a 50.06 3.21±1.10c 33.90±1.70a 4.10±1.14b 12.19±1.90a-53.40 16.16±0.24a 21.78±1.25a 41.75±0.56a 5.77±0.27a-85.46-16.58±1.97a 44.30±0.90b 6.39±0.28b-4.36±0.07a 0.87±0.03a 72.50 7.45±0.21a 14.94±3.74b-11.08±1.57a-33.47 4.36 7.89 12.08 5.44±1.06b 18.93±1.48b 2.93±0.92b 3.27±0.64b 54.32±1.00a 84.89————--
续表
注：同行不同字母表示差异显著（P＜0.05），“-”表示未检出。
序号 种类 化合物n84 n85 n86 n87 n88 n89 n90 n91 n92 n93 n94腈类n95 n96 n97酚类n98 n99酸类n100 n101 n102 n103 n104 n105 n106杂环类石竹烯-（I1）3,5,5-三甲基-2-己烯正癸烯4-乙基-3-壬烯-5-炔1,3,7,7-四甲基-9-氧代-2-氧杂双环[4.4.0]癸-5-烯α-蒎烯月桂烯右旋萜二烯桧烯小计苯代丙腈4-（甲硫基）丁腈总量4-乙基愈创木酚对乙烯基愈疮木酚5-乙烯基-2-甲氧基苯酚小计亚麻酸2-甲基丙烯酸小计5-甲基噻唑2-甲氧基-3-仲丁基吡嗪2-正戊基呋喃2-异丙基-3-甲氧基吡嗪均四甲苯1-甲氧基1H吲哚1,2,3,4-四氢-1,1,6-三甲基萘小计总含量含量/（μg·kg-1）D0 D30 D90 D180 D270 D360-- - - - - - - -9.72±0.25a 3.88±0.42b 7.44±0.20a-- ---3.17±0.28b 5.46±0.77a-- - - - -50.39±1.00a 11.98±0.85a-- --- - --- - - --- - - - - -23.09 98.96±2.08bc-98.96 62.36 165.73±10.52a-165.73 1.15±0.42a 3.97±0.65a 3.70±2.33ab-14.27 71.76±3.85ab 4.05±1.39a 5.64±0.70a 9.70 25.24±0.44d-- - - - - -21.05 132.76±4.13b-132.76 18.58±1.65a 219.50±1.41a 39.67±0.50a 277.75 1.04±0.07bc-4.21 103.00±10.83bc 11.66±0.32a 114.66 5.55±2.02b--5.55 6.09±0.25a-6.09 25.24 23.86±2.58a 14.85±2.50b-38.71 557.04±4.72a 7.12±0.28a-- - - --- - - - - - --- - --- - - -13.87±0.78a-- - -6.87±1.64a-1.22±0.28b-- -564.16 29 235.18 13.87 3 421.73 8.09 3 287.51-- - - - - - -594.84 71.76 6.27±0.79b 7.63±0.44c-13.90-13.63±1.65a 13.63-0.98±0.58c-3.91±0.21a 0.59±0.15a 2.85±0.00b-8.32 443.82 4.42±0.15b-4.30±0.49a-8.38±2.13a 3.23±0.65a 20.32 408.11
由表1可知，从6个发酵阶段的华容芥菜样品中共检测出106种挥发性风味物质，包括酯类39种，醛类19，醇类11种，酮类7种，硫醚类5种，烯烃类11种，腈类2种，酚类3种，酸类2种以及杂环类7种。从种类上来看，随着发酵的进行，挥发性风味物质的种类呈先增加后减少的趋势，其中异硫氰酸酯类物质的种类明显减少，酯类、醛类、醇类物质的种类先增加后减少。从含量上来看，挥发性风味物质的含量随着发酵时间的增加而减少，特别是发酵90～180 d明显降低，这与异硫氰酸酯类物质的减少有关。EWA C等[15]研究发现，异硫氰酸酯类物质随着发酵的进行而减少，这与微生物特别是乳酸菌有关[16]。综上，异硫氰酸酯类、酯类、醛类物质都是华容芥菜发酵过程中的主要挥发性风味物质。
从新鲜芥菜（D0）中共检测出35种挥发性风味物质，总含量为29 235.18 μg/kg，主要的物质为异硫氰酸酯类化合物，占总量的94.91%。此外，含量较高的物质有异硫氰酸烯丙酯（21 197.01 μg/kg）、异硫氰酸苯乙酯（2 891.32 μg/kg）以及3-（甲硫基）丙基异硫氰酸酯（1 813.79 μg/kg）等，这些物质由新鲜芥菜中黑芥子酶水解硫代葡萄糖苷产生，具有强烈的刺激性气味，是新鲜芥菜主要的气味来源[17]。
从发酵30 d的华容芥菜样品（D30）中共检测出51种挥发性风味物质，总含量为3 421.73 μg/kg。与新鲜芥菜相比，D30样品的挥发性风味物质含量降低，但种类增多，表明发酵产生了新的挥发性风味物质。芥菜开始发酵后，体系中的微生物和酶能分解异硫氰酸酯类化合物[18]，导致含量显著下降，但其仍是D30样品中相对含量最高的物质（70.85%）。酯类物质增加了7种，包括癸酸甲酯、辛酸乙酯、己酸乙酯等，除了原料中自带的酯类，这些物质可能由酶或微生物作用以及代谢产物的相互作用产生[19]。在整个发酵阶段，D30样品中醛类物质的数量最多，苯甲醛和苯乙醛第一次在D30样品中检测出。醛类物质是不饱和脂肪酸的氧化产物，它们的活度值较低，对产品的风味贡献较大[20]。
从D90样品中共检测出51种挥发性风味物质，总含量为3 287.51 μg/kg，与D30样品相比，挥发性风味物质的数量和含量变化不大。发酵90 d的华容芥菜中，酯类物质的相对含量（49.00%）最高，酯类物质的种类（21种）和含量（1 610.96 μg/kg）在这个阶段达到了峰值，其中，3-苯丙酸乙酯（196.70 μg/kg）、癸酸乙酯（746.66 μg/kg）等的含量较高。在这个阶段酸和醇的酯化反应持续进行，生成更多的酯类，使得发酵芥菜的香气更加丰富。
从D180、D270和D360样品中分别检测出38、43和36种挥发性风味物质，含量分别为594.84 μg/kg、443.82 μg/kg、408.11 μg/kg。与D90样品相比，D180样品发酵芥菜的挥发性风味物质含量明显下降，主要是由于异硫氰酸酯类和酯类物质含量的减少。有研究表明，发酵过程中乳酸菌相关属与异硫氰酸酯类物质的含量变化有关，随着发酵的进行乳酸菌属的丰度增加，会导致异硫氰酸酯类物质含量的降低[21-22]。盐的添加也能降低发酵过程中异硫氰酸酯类物质的含量[23]。异硫氰酸酯类刺激的辛辣味减少，使得发酵芥菜产品的风味变得更加柔和，发酵的香味更浓郁[24]。酯类物质在发酵过程中主要由酯化反应产生，在发酵后期被微生物转化或分解成其他产物[25]。高级酯类物质稳定性差[26]，随着发酵时间的增加，贮藏容器中溶出的金属离子使介电常数增加从而导致酯类物质水解[27]。D270和D360样品中酯类物质的相对含量最高，且各种挥发性物质含量所占的比例相差不大。D360样品中的硫醚类物质含量的增加，可能是由于发酵时间长引起的[28]。值得注意的是，发酵时间过长会引起某些挥发性风味物质的挥发并且产生一些不良的气味。
2.2 华容芥菜发酵过程中特征香气成分分析
为研究华容芥菜不同发酵过程中的特征香气成分，采用GC-MS技术结合正交偏最小二乘判别分析法（OPLS-DA）以及香气活度值（OAV）对不同发酵阶段的挥发性风味物质进行差异性分析，筛选出特征性的呈香物质。
2.2.1 OPLS-DA
OPLS-DA是一种有监督的判别分析统计方法[29]，可以通过建立样品类别和目标对象之间的关系模型，有效地筛选出标志性差异物质[30]。因此，对不同发酵阶段的华容芥菜样品构建OPLS-DA模型，结果见图1。
图1 基于挥发性风味物质含量不同发酵阶段华容芥菜样品的正交偏最小二乘判别分析结果
Fig.1 Results of orthogonal partial least squares discriminant analysis of Huarong mustard samples at different fermentation stages based on volatile flavor componets
由图1可知，该模型的拟合参数模型解释X的百分比（R2X）、模型解释Y的百分比（R2Y）、预测优度Q2分别为0.459、0.993、0.962，通常认为拟合优度R2和Q2高于0.4即可接受[31]，表明该判别模型解释能力较好，不存在过拟合现象。6个发酵阶段的芥菜样品分别分布在不同的区域，表明芥菜发酵过程中挥发性风味物质存在差异。
OPLS-DA模型变量投影重要性（variable important in the projection，VIP）值可以量化每个变量的贡献，通常认为VIP值越大变量在样本中的差异越显著，VIP值＞1常作为筛选标准[32]。华容芥菜发酵过程中部分挥发性风味物质的VIP值得分图见图2。由图2可知，根据VIP值＞1从华容芥菜各个发酵阶段样品中共筛选出44种差异性挥发性物质，包括异硫氰酸酯类10种，酯类8种，醛类9种，醇类1种，酮类3种，硫醚类3种，烯烃类6种，酸类1种，杂环类3种。D0、D30样品中VIP值＞1的物质主要为异硫氰酸酯类、醛类和硫醚类；D90、D180、D270样品中VIP值＞1的物质主要为酯类、醛类；D360样品中VIP值＞1的物质主要为酯类、醛类、硫醚类。
图2 华容芥菜发酵过程中挥发性风味物质的变量投影重要性值
Fig.2 Variable importance in the projection values of volatile flavor components in Huarong mustard during fermentation process
2.2.2 OAV分析
通过多元统计学法OPLS-DA筛选出了华容芥菜发酵过程中差异性挥发性风味物质，但由于挥发性风味物质的阈值高低不同，根据其含量不能作为判定不同发酵阶段华容芥菜特征香气的依据。OAV是挥发性风味物质的含量与其气味阈值之比，可以作为评价某个香气组分对整体香气贡献的依据[33]。当某一香气组分的OAV＞1时认为其对整体有较大的贡献，OAV＞10时则认为其为重要的香气成分[34]。因此，计算106种挥发性风味物质的OAV，结果发现，共有27种挥发性风味物质的OAV＞1，结果见表2。
表2 华容芥菜发酵过程中香气活度值＞1的挥发性风味物质
Table 2 Volatile flavor components with aroma activity value＞1 of Huarong mustard during the fermentation process
序号 名称 阈值/（μg·kg-1） 文献OAV D0 D30 D90 D180 D270 D360 n1 n3 n14 n16 n25 n29 n31 n33 n35 n40 n41 n42 n43 n44 n45 n46 n50 n51 n52 n59 n62 n66 n67 n72 n78 n95 n102异硫氰酸烯丙酯异硫氰酸丁酯2-甲基丁酸乙酯3-苯丙酸乙酯癸酸乙酯丁酸乙酯辛酸乙酯己酸乙酯棕榈酸甲酯己醛庚醛辛醛壬醛癸醛苯甲醛苯乙醛（E,E）-2,4-庚二烯醛反式-2-己烯醛β-环柠檬醛桉叶油醇1-辛烯-3-醇芳樟醇苯乙醇β-紫罗兰酮二甲基三硫4-乙基愈创木酚2-正戊基呋喃46.00 17.00 0.06 16.00 5.00 1.00 19.40 2.30 2.00 4.50 3.00 0.70 1.00 0.10 3.50 1.10 15.40 17.00 3.00 11.00 1.00 6.00 0.75 4.50 0.01 4.40 5.90 460.80 29.21 47.78 2.07 1.95-- - - - --- - ---2.04 14.58 1.42 5.63 107.56 235.14 21.45 1.22 155.18 12.29 149.33 42.51 3.82 9.10 13.40 5.58 1.09 0.31-0.27 2.06 22.46 0.22 1.58 3.79 1.01 6.42 7.29 15.15 0.79 12.63 41.20 145.21 2.65 8.24 1.47-4.20-4.37—— --- -11.63 54.56 6.85 3.10 7.18 8.08 1.39 33.68 362.98 7.03-0.63-5.83--1.69-- ——--- - -22.09 3 696.59 3.63 55.67 9.84 1 494.55--6.68 3 390.59 4.22 2.35--6.15 0.05-0.36 5.30-0.22-2.84 1.86-4.39 5.46 19.01 4.05 4.90 0.67-1.02-3.35-23.65 1.31 436.04 1.26-0.43 4.47-0.43 3.83 2.66-0.43-10.82 72.97 7.48 7.87 0.17-1.74-3.20 0.27 32.35 1.46 789.00 1.43-1.87 1 892.72 5.42-[35][35][36][37][38][39][38][40][41][42][43][42][42][39][41][41][44][39][45][46][47][42][41][41][40][48][38]
由表2可知，OAV＞1的挥发性风味物质包括异硫氰酸酯类2种，酯类7种，醛类10种，醇类4种，酮类1种，硫醚类1种，酚类1种，杂环类1种。这与陈艳等[5]的研究结果酯类、醛类和醇类是发酵芥菜的主要挥发性物质相似。OAV＞10的物质有14种，分别为异硫氰酸烯丙酯、异硫氰酸丁酯、2-甲基丁酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸乙酯、棕榈酸甲酯、己醛、辛醛、壬醛、癸醛、苯乙醇、β-紫罗兰酮、二甲基三硫。其中癸醛（新鲜油脂香、果香）[49]和二甲基三硫（洋葱蔬菜味）[50]来源于芥菜原料中，并且存在整个发酵过程中，这与王芮东等[51]对萝卜泡菜的研究结果相似。除此之外，具有强烈刺鼻气味的异硫氰酸烯丙酯和异硫氰酸丁酯[52]、己醛（青香、草香）[37]、壬醛（蜡香、柑橘香）[50]、β-紫罗兰酮（花香）[41]是D0样品中OAV＞10的重要香气成分，这与WANG D D等[9]的研究结果基本相同。除癸醛、二甲基三硫外，异硫氰酸烯丙酯、己醛、辛醛（脂香、蔬菜香）[53]、壬醛在D30样品中OAV＞10；D90样本中OAV＞10的香气组分为异硫氰酸烯丙酯、具有水果香的2-甲基丁酸乙酯、3-苯丙酸乙酯和癸酸乙酯[54]、丁酸乙酯（菠萝香）[55]、棕榈酸甲酯[18]（愉快的水果香气）、壬醛、苯乙醇（甜香、花香）[56]，随着发酵的进行，发酵产物累积，香气愈加浓郁；D180样品中OAV＞10的物质为苯乙醇；D270样品中OAV＞10的物质为壬醛、苯乙醇；D360样品中则为丁酸乙酯、壬醛。这与ZHANG C C等[57]对发酵榨菜的研究结果相似。
结合图2和表2可知，有14种挥发性风味物质的VIP值＞1且OAV＞1，这些物质被认为是不同发酵阶段华容芥菜样品的特征性挥发性风味成分，包括异硫氰酸烯丙酯、异硫氰酸丁酯、3-苯丙酸乙酯、癸酸乙酯、己醛、辛醛、壬醛、癸醛、苯甲醛、反式-2-己烯醛、β-环柠檬醛、苯乙醇、β-紫罗兰酮、二甲基三硫。
将这14种挥发性风味物质进行聚类热图分析，结果见图3。由图3可知，异硫氰酸烯丙酯、异硫氰酸丁酯、反式-2-己烯醛、壬醛、β-紫罗兰酮、β-环柠檬醛、己醛、二甲基三硫为D0样品中的特征挥发性风味成分，这些物质大多数带有辛辣刺激和生涩的气味[9]，在后续的发酵过程中会逐渐减少甚至完全消失，使得发酵产物变得更易让人接受；D30样品中的特征挥发性风味成分为辛醛、二甲基三硫、己醛，辛醛具有脂香和蔬菜香，二甲基三硫带有洋葱蔬菜的气味，己醛提供青香；苯甲醛、癸醛、苯乙醇、癸醛乙酯、3-苯丙酸乙酯、β环柠檬醛是D90样品中的特征挥发性风味成分，癸醛、苯乙醇、癸醛乙酯、3-苯丙酸乙酯、β环柠檬醛都具有甜香、果香，赋予发酵芥菜样品醇厚的果香和甜香味，使发酵芥菜呈现丰富的风味；苯甲醛是D270和D360样品中的特征挥发风味成分，苯甲醛是最常见的芳香醛，具有苦杏仁味道，可能产生于氨基酸的Strecker降解，阈值低，使得发酵芥菜的风味更加复杂[18]。
图3 不同发酵阶段基于OAV＞1的华容芥菜特征挥发性风味成分聚类分析热图
Fig.3 Heat map for clustering analysis of characteristic volatile flavor components in Huarong mustard at different fermentation stages based on OAV＞1
3 结论
本研究采用HS-SPME-GC-MS技术从不同发酵阶段华容芥菜中共检测出106种挥发性风味成分，其中异硫氰酸酯类、酯类和醛类是主要的挥发性风味物质，且挥发性风味物质的种类和数量随着发酵的进行呈现先增加后减少的趋势。通过OPLS-DA从华容芥菜发酵过程中筛选出44种VIP＞1的差异性挥发性风味物质，其中14种挥发性风味物质的OAV＞1，为特征挥发性风味物质。通过聚类热图分析发现，异硫氰酸烯丙酯、异硫氰酸丁酯、反式-2-己烯醛、壬醛、β-紫罗兰酮、β环柠檬醛、己醛、二甲基三硫为D0样品中的特征挥发性风味成分；辛醛、二甲基三硫、己醛是D30样品中的特征挥发性风味成分；苯甲醛、癸醛、苯乙醇、癸醛乙酯、3-苯丙酸乙酯、β-环柠檬醛是D90样品中的特征挥发性风味成分；苯甲醛是D270和D360样品中的特征挥发风味成分。本研究结果为深入了解发酵华容芥菜的挥发性香气成分提供了参考，也对香气调控和风味改善具有一定的理论指导意义。
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