人参是一种常见的名贵滋补中药材，在传统中药材中具有重要地位，被中医称为百草之王，最早记载于《神农本草经》，在我国已有两千多年的用药历史，2012年其被国家卫生部批准作为新资源食品和药食同源的中药材品种[1-2]。人参主要的活性成分包括皂苷[3]、多糖[4-5]、挥发油[6-7]、蛋白质[8-9]、氨基酸[10]等。已有研究表明人参中的皂苷成分在抗神经炎症[11-12]、抗氧化应激[13]、心肌保护[14-15]、免疫调节[16-17]、抗炎抗氧化[18-19]、预防骨质疏松[20-21]、改善肝损伤[22]等方面具有显著功效。目前，已经从人参中分离鉴定出了200多种皂苷，而人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd占据总皂苷的90%以上，是评价人参质量的重要指标[23-24]。《中国药典》中以人参皂苷Rg1、Re、Rb1作为人参药材的监控指标并不能完全反映出人参药材的质量好坏，因此通过对多种人参皂苷含量的监控，对提升人参药材的质量具有重要意义。
保健酒是以清香型白酒为基酒，以单味或多味中药材为原料，精制而成的一种具有某些功能性的酒[25]。随着我国经济社会的发展，以及人们生活水平的提高，具有健康理念的保健酒愈发受到消费者的青睐。胡杨等[25]从以人参、西红花、葛仙米为原料制备的复方保健酒中鉴定出了人参皂苷和西红花苷，并将此作为复方保健酒的评价指标。李先芝等[26]建立追风八珍酒中7种有效成分的检测方法。人参保健酒是以人参药材作为主要原料，通过现代提取工艺将人参中的有效成分与白酒充分融合，形成独具特色的一款保健酒。人参皂苷是人参药材中的主要活性成分，通过研究人参保健酒中的人参皂苷种类及含量可对产品的质量监控提供数据支撑。因此有必要对人参保健酒中的人参皂苷种类及含量进行检测。
由于工艺的不同，不同品牌的人参保健酒中人参皂苷的种类及含量具有差异性。为了探究彼此之间的差异性，本研究将11种人参皂苷作为人参保健酒的标志性成分，采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法对不同的市售人参保健酒中的11种人参皂苷进行检测。旨在为产品质量控制、活性成分的有效性评估、不同产品的比较以及合理使用和推荐提供科学依据和参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
6批人参保健酒：市售。
人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rb3、Rd：中国食品药品检定研究院；人参皂苷Ra2、Ra1：成都曼思特生物科技有限公司；人参皂苷Ro：上海诗丹德生物技术有限公司；人参皂苷Rc（均为分析纯）：ChemFaces公司；乙腈、磷酸（均为色谱纯）：美国赛默飞公司；甲醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；实验用水为超纯水。
1.2 仪器与设备
UltiMate 3000高效液相色谱仪：美国赛默飞公司；SK1200H数控超声波清洗仪：上海科导超声仪器有限公司；SQP电子分析天平：德国赛多利斯公司；PURELAB-超纯水仪：英国埃尔格电子科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 对照品溶液制备
分别精密称取一定量人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Ra2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ra1、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3和人参皂苷Rd，加体积分数为50%甲醇溶解，制成1 mL中含有人参皂苷Rg1 0.11 mg、人参皂苷Re 0.12 mg、人参皂苷Rf 0.10 mg、人参皂苷Ra2 0.12 mg、人参皂苷Rb1 0.27 mg、人参皂苷Rc 0.16 mg、人参皂苷Ra1 0.12 mg、人参皂苷Ro 0.10 mg、人参皂苷Rb2 0.15 mg、人参皂苷Rb3 0.09 mg和人参皂苷Rd 0.17 mg的混合溶液，为实验对照品。
1.3.2 供试品溶液制备
精密量取待测样品10 mL，置于蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用水溶解，上样于Copure HLB固相萃取小柱（规格：200 mg/6 mL，上柱前先用6 mL甲醇和12 mL水活化），20 mL水洗，然后用10 mL体积分数为40%甲醇洗脱，弃去洗脱液，最后用10 mL纯甲醇洗脱，收集洗脱液，水浴至干，残渣用体积分数为50%甲醇溶解，并定容至5 mL，摇匀，用0.22 μm针头过滤器过滤。
1.3.3 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），流速1.0 mL/min，梯度洗脱，洗脱程序见表1；柱温28 ℃；检测波长203 nm；进样量10 μL。
表1 人参皂苷含量检测梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program of ginsenoside contents detection
时间/min A 乙腈/%0 35 51 70 16 19 22 26 B 0.1磷酸/% 时间/min A 乙腈/% B 0.1磷酸/%84 81 78 74 110 115 125 32 35 35 68 65 65
1.3.4 人参皂苷含量的测定
根据人参皂苷对照品在色谱图上的保留时间对人参保健酒中的11种人参皂苷进行定性分析，并以对照品浓度与样品峰面积的比值，依据标准曲线得到各物质的含量。人参皂苷含量计算公式如下：
式中：cx为样品中人参皂苷含量，mg/L；cr为对照品人参皂苷含量，mg/L；Ax为样品中人参皂苷峰面积；Ar为对照品人参皂苷峰面积。
1.3.5 数据处理
利用仪器自带的软件Chromeleon7用于查看色谱图，Origin2022软件用于绘图，Excel 2016软件用于处理数据。
2 结果与分析
2.1 线性关系与检出限
将制备的对照品溶液稀释成5个不同质量浓度水平的对照品混合溶液，进行色谱测定，以化合物质量浓度（mg/L）（X）为横坐标，色谱峰面积（Y）为纵坐标建立标准曲线，得出线性关系及范围。将11种成分对照品溶液进行适当稀释后制得不同浓度溶液，以信噪比为3对应的质量浓度作为检出限，信噪比为10对应的质量浓度作为定量限，线性方程、线性范围、检出限和定量限结果见表2。由表2可知，各成分在各自线性范围内线性关系良好，相关系数（R2）均＞0.999，检出限在1.52～3.03 mg/L，定量限在4.59～9.18 mg/L。
表2 11种人参皂苷的标准曲线回归方程、线性范围、检测限及定量限
Table 2 Standard curve regression equation, linear range, detection limits and quantitative limits of 11 kinds of ginsenoside
成分 线性方程 相关系数（R2） 线性范围/（mg·L-1） 检出限/（mg·L-1） 定量限/（mg·L-1）人参皂苷Rg1人参皂苷Re人参皂苷Rf人参皂苷Ra2人参皂苷Rb1人参皂苷Rc Y=0.058 3X-0.059 2 Y=0.049 3X+0.064 1 Y=0.053 5X+0.026 7 Y=0.036 0X-0.013 5 Y=0.043 7X-0.006 4 Y=0.034 0X+0.075 1 0.999 6 0.999 8 0.999 9 0.999 8 0.999 9 0.999 6 11.09～116.65 10.97～129.02 7.97～103.80 9.23～120.21 11.02～279.30 11.96～167.19 1.91 1.89 2.06 2.98 1.89 2.06 5.78 5.71 6.23 9.02 5.74 6.23
续表
成分 线性方程 相关系数（R2） 线性范围/（mg·L-1） 检出限/（mg·L-1） 定量限/（mg·L-1）人参皂苷Ra1人参皂苷Ro人参皂苷Rb2人参皂苷Rb3人参皂苷Rd Y=0.033 3X-0.004 4 Y=0.043 1X+0.017 7 Y=0.042 6X+0.021 3 Y=0.038 8X+0.024 0 Y=0.049 2X-0.077 6 0.999 4 0.999 9 1.000 0 0.999 9 0.999 6 9.28～120.84 6.60～107.45 11.90～154.95 4.41～91.83 9.40～175.73 2.99 2.13 2.05 1.52 3.03 9.06 6.45 6.20 4.59 9.18
2.2 人参皂苷成分HPLC色谱图
对照品及样品的色谱图见图1。结果显示，对照品及样品在相同时间下均有色谱峰出现，且各色谱峰之间的分离度＞1.5，表明人参保健酒中含11种有人参皂苷成分。
图1 人参皂苷成分标准品（A）及样品（B）的高效液相色谱图
Fig.1 HPLC chromatograms of ginsenoside standard substance (A)and sample (B)
1-人参皂苷Rg1；2-人参皂苷Re；3-人参皂苷Rf；4-人参皂苷Ra2；5-人
参皂苷Rb；6-人参皂苷Rc；7-人参皂苷Ra1；8-人参皂苷Ro；9-人参皂
苷Rb2；10-人参皂苷Rb3；11-人参皂苷Rd。
2.3 精密度试验
取同一酒样，按照“1.3.2”供试品溶液制备方法制备供试品，按“1.3.3”项下人参皂苷含量检测色谱条件进行连续进样6次，记录峰面积，检测结果见表3。由表3可知，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Ra2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ra1、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd峰面积测定结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为0.81%、0.92%、0.96%、0.39%、0.34%、0.80%、0.87%、0.59%、0.84%、0.79%、0.40%，均＜5%，表明该仪器精密度良好。
表3 11种人参皂苷分析精密度试验结果
Table 3 Precision test results of 11 kinds of ginsenosides
成分 RSD/%峰面积/（mAU·s）1 2 3 4 5 6人参皂苷Rg1人参皂苷Re人参皂苷Rf人参皂苷Ra2人参皂苷Rb1人参皂苷Rc人参皂苷Ra1人参皂苷Ro人参皂苷Rb2人参皂苷Rb3人参皂苷Rd 3.269 5 2.040 5 0.885 3 0.856 5 6.307 1 2.507 7 1.163 6 1.752 9 2.593 0 0.417 5 2.490 1 3.249 4 2.034 3 0.895 6 0.853 6 6.251 7 2.521 6 1.145 4 1.736 0 2.557 2 0.413 7 2.484 9 3.204 2 2.043 9 0.910 3 0.855 8 6.274 7 2.501 3 1.145 2 1.731 7 2.564 3 0.410 3 2.479 8 3.236 5 2.074 0 0.895 3 0.854 8 6.267 9 2.531 7 1.161 0 1.755 1 2.590 4 0.417 5 2.499 8 3.226 2 2.064 6 0.894 2 0.847 9 6.302 3 2.513 2 1.165 1 1.735 9 2.603 9 0.415 0 2.498 3 3.202 4 2.023 8 0.888 4 0.850 6 6.287 7 2.557 3 1.167 4 1.751 4 2.611 7 0.419 4 2.506 2 0.81 0.92 0.96 0.39 0.34 0.80 0.87 0.59 0.84 0.79 0.40
2.4 稳定性试验
取同一供试品溶液，考察了不同进样时间对检测结果的影响，结果见表4。由表4可知，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Ra2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ra1、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd峰面积测定结果的RSD值分别为1.08%、0.96%、1.21%、0.64%、0.52%、0.88%、1.18%、1.19%、0.78%、1.38%、0.70%，RSD值均＜5%，表明供试品溶液中人参皂苷成分在室温下放置40 h内稳定性良好。
表4 11种人参皂苷分析稳定性试验结果
Table 4 Stability test results of 11 ginsenosides
成分 RSD/%峰面积/（mAU·s）0 h 12 h 21 h 30 h 35 h 40 h人参皂苷Rg1人参皂苷Re人参皂苷Rf人参皂苷Ra2人参皂苷Rb1人参皂苷Rc人参皂苷Ra1人参皂苷Ro人参皂苷Rb2人参皂苷Rb3人参皂苷Rd 3.250 3 2.155 3 0.899 5 0.826 0 6.238 6 2.505 0 1.160 5 1.742 8 2.569 7 0.412 5 2.471 5 3.273 9 2.141 7 0.915 4 0.816 9 6.194 1 2.495 4 1.194 0 1.736 0 2.553 6 0.408 2 2.507 5 3.284 5 2.162 5 0.914 4 0.823 9 6.258 8 2.510 6 1.162 9 1.736 4 2.571 3 0.405 3 2.503 3 3.236 5 2.174 0 0.895 3 0.814 8 6.267 9 2.531 7 1.161 0 1.755 1 2.590 4 0.417 5 2.499 8 3.202 4 2.123 8 0.888 4 0.820 6 6.287 7 2.557 3 1.167 4 1.751 4 2.611 7 0.419 4 2.506 2 3.298 8 2.124 5 0.908 5 0.828 3 6.267 4 2.516 2 1.155 7 1.697 5 2.583 4 0.407 8 2.525 8 1.08 0.96 1.21 0.64 0.52 0.88 1.18 1.19 0.78 1.38 0.70
2.5 重复性试验
取同一酒样，按照1.3.2下供试品溶液制备方法制备供试品6份，分别按“1.3.3”项下色谱条件进行进样，记录含量数据，结果见表5。由表5可知，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Ra2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ra1、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd含量测定结果的RSD值分别为1.58%、1.87%、1.13%、1.55%、0.65%、0.88%、0.67%、0.55%、0.92%、1.73%、0.75%，RSD值均＜5%，表明该方法重复性良好。
表5 11种人参皂苷分析重复性试验结果
Table 5 Reproducibility test results of 11 kinds of ginsenosides
成分 RSD/%含量/（mg·L-1）1 2 3 4 5 6平均值人参皂苷Rg1人参皂苷Re人参皂苷Rf人参皂苷Ra2人参皂苷Rb1人参皂苷Rc人参皂苷Ra1人参皂苷Ro人参皂苷Rb2人参皂苷Rb3人参皂苷Rd 28.034 8 22.012 5 8.112 7 10.597 7 71.099 6 35.557 8 17.720 9 19.976 0 29.738 8 5.206 4 26.562 5 28.477 7 22.364 4 7.892 2 10.469 8 70.680 7 35.402 7 17.475 8 19.843 0 29.385 8 5.060 4 26.122 9 28.666 8 22.819 8 7.976 4 10.307 9 70.720 2 36.168 0 17.742 1 19.779 7 29.517 1 5.028 8 26.214 6 28.771 6 23.043 0 8.118 8 10.687 9 71.730 2 35.795 5 17.481 6 19.993 1 29.926 4 5.224 1 26.082 5 29.343 0 22.303 6 7.961 6 10.423 8 70.756 2 35.591 5 17.680 2 19.872 2 30.025 8 5.028 1 26.007 5 29.058 7 22.994 9 8.055 3 10.730 5 71.597 9 36.125 9 17.649 5 20.070 7 30.034 2 5.075 8 26.269 0 28.725 4 22.589 7 8.019 5 10.586 2 71.097 5 35.773 5 17.625 0 19.922 4 29.771 3 5.103 9 26.209 8 1.58 1.87 1.13 1.55 0.65 0.88 0.67 0.55 0.92 1.73 0.75
2.6 加标回收率试验
精密量取已知含量的同一酒样5 mL，共3份，分别按照酒样中各成分含量的低、中、高三个水平加入对照品适量，按照“1.3.2”项下供试品溶液制备方法制备供试品，按“1.3.3”项下色谱条件进行测定，计算各成分加标回收率，结果见表6。由表6可知，各成分平均加标回收率分别为人参皂苷Rg1 101.86%、人参皂苷Re 96.65%、人参皂苷Rf 100.08%、人参皂苷Ra2 95.39%、人参皂苷Rb1 101.24%、人参皂苷Rc 97.47%、人参皂苷Ra1 98.53%、人参皂苷Ro 96.18%、人参皂苷Rb2 101.33%、人参皂苷Rb3 99.35%、人参皂苷Rd 95.75%。加标回收率结果的RSD值分别为1.34%、2.46%、2.31%、2.37%、0.60%、1.06%、0.77%、1.79%、0.07%、2.10%、1.49%，RSD值均＜5%，表明该方法准确度高。
表6 11种人参皂苷分析加标回收率试验结果
Table 6 Adding standard recovery results of 11 kinds of ginsenosides
成分 回收率/%含量/（mg·L-1）本底值 加标量 测定值平均回收率/%RSD/%人参皂苷Rg1 0.147 2 101.86 1.34人参皂苷Re 0.115 2 96.65 2.46人参皂苷Rf 0.040 5 0.121 4 0.151 7 0.182 0 0.096 3 0.120 4 0.144 5 0.033 2 0.041 5 0.049 8 0.268 9 0.302 7 0.334 3 0.205 7 0.232 9 0.257 2 0.074 6 0.081 8 0.089 3 100.30 102.52 102.77 93.92 97.74 98.29 102.61 99.54 98.09 100.08 2.31
续表
成分 回收率/%含量/（mg·L-1）本底值 加标量 测定值平均回收率/%RSD/%人参皂苷Ra2 0.050 0 95.39 2.37人参皂苷Rb1 0.355 5 101.24 0.60人参皂苷Rc 0.178 9 97.47 1.06人参皂苷Ra1 0.090 0 98.53 0.77人参皂苷Ro 0.099 6 96.18 1.79人参皂苷Rb2 0.152 2 101.33 0.07人参皂苷Rb3 0.026 1 99.35 2.10人参皂苷Rd 0.131 0 0.043 3 0.054 1 0.064 9 0.297 9 0.372 4 0.446 9 0.147 1 0.183 9 0.220 7 0.070 1 0.087 6 0.105 1 0.080 8 0.101 0 0.121 2 0.124 0 0.154 9 0.185 9 0.020 2 0.025 3 0.030 3 0.102 8 0.128 5 0.154 2 0.090 4 0.101 6 0.113 5 0.655 5 0.732 1 0.810 9 0.320 5 0.359 3 0.395 2 0.158 4 0.176 7 0.194 1 0.175 7 0.197 7 0.217 4 0.277 7 0.309 2 0.340 7 0.046 6 0.051 3 0.055 5 0.228 9 0.256 2 0.277 1 93.19 95.29 97.70 100.71 101.12 101.90 96.28 98.13 98.01 97.65 98.93 99.01 94.19 97.13 97.21 101.26 101.32 101.40 101.15 99.83 97.07 95.14 97.38 94.73 95.75 1.49
2.7 样品含量测定
从市场中购买了6款人参保健酒，标记为样品1-6。经按照1.3.2制备方法制备供试品，按1.3.3下色谱条件分析，计算不同人参保健酒样品中各人参皂苷成分的含量，测定结果见表7。
表7 样品中11种人参皂苷含量测定结果
Table 7 Determination results of 11 kinds of ginsenosides in samples mg/L
注：n.a表示未检出。
成分 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6人参皂苷Rg1人参皂苷Re人参皂苷Rf人参皂苷Ra2人参皂苷Rb1人参皂苷Rc人参皂苷Ra1人参皂苷Ro人参皂苷Rb2人参皂苷Rb3人参皂苷Rd总含量28.73 22.59 8.02 10.59 71.10 35.77 17.63 19.92 29.77 5.10 26.21 275.42 36.62 89.27 11.15 13.40 79.98 89.80 14.49 22.27 31.37 55.06 17.38 460.80 33.92 25.06 40.87 13.31 53.79 31.54 7.42 40.80 24.08 36.22 12.50 319.51 20.24 20.74 5.55 18.22 44.25 30.38 7.66 18.40 33.43 15.51 32.65 247.03 4.15 5.94 1.33 1.34 12.21 9.66 3.38 3.53 8.08 2.83 6.71 59.14 4.20 3.88 0.37 n.a 4.74 2.75 1.36 1.22 1.45 0.71 3.89 24.57
由表7可知，6种人参保健酒中，人参皂苷总含量最高的是样品2，高达460.80 mg/L，主要为人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb3成分含量明显高于其他产品；人参皂苷总含量最低的是样品6，仅为24.57 mg/L，该样品中的人参皂苷成分相比于其他产品均不占优势，这可能和人参保健酒的生产工艺及人参药材的年限有关。
3 结论
本研究建立了HPLC法测定人参保健酒中人参皂苷Rg1、Re、Rf、Ra2、Rb1、Rc、Ra1、Ro、Rb2、Rb3、Rd 11种人参皂苷的含量，11种人参皂苷在各自浓度范围内线性关系良好（R2≥0.999 9），检出限在1.52～3.03 mg/L，定量限在4.59～9.18 mg/L，该方法精密度试验、稳定性试验、重复率试验结果相对标准偏差（RSD）均小于5%，平均加标回收率95.39%～101.96%，RSD为0.07%～2.46%。该方法操作简单，准确度高，重复性好，可为市面上的人参保健酒中的人参皂苷含量检测及评价提供参考依据。
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