高粱是我国酿造产业最主要的原料，随着白酒产业的持续发展，各大酒企对高粱的需求也不断增加[1-2]。“好酒离不开红粮”，高粱的理化性质和代谢物成分对白酒品质至关重要[3-5]。根据高粱淀粉含量和组分的不同，可以将其分为糯高粱和粳高粱，支链淀粉含量占比80%以上为糯高粱，反之则为粳高粱[6-7]。单宁是一类植物酚类化合物，赋予白酒特有口感、风味与功能[8-11]。有研究表明，高粱籽粒中单宁主要富集在籽粒的果皮中，且其含量与籽粒颜色深度、果皮厚度呈正相关性[12-14]。淀粉含量和类型是决定高粱出酒率和白酒品质的关键因素，有研究表明，糯高粱酿酒性能较好，其酿造的白酒品质也更佳[10，15-16]。较为理想的酿酒高粱具有支链淀粉含量高，单宁含量在1.5%～2.0%之间，蛋白质含量适中，脂肪含量较少等特点[2，11]。然而，不同类型高粱的果皮厚度和淀粉颗粒在结构上究竟有何不同以及如何影响酿造性能的仍不清楚。
代谢组学技术已经被广泛应用于白酒风味物质的鉴定[17-21]，且在高粱籽粒中也有少量研究，LIU H J等[22-23]借助代谢组学技术鉴定到高粱籽粒萌发过程中不同阶段的标志代谢物。还有研究通过分析3种甜高粱品种的代谢谱，筛选到与种子颜色相关的显著差异代谢物，并结合转录组技术得到造成果皮色差的六种黄烷酮[24-25]。研究表明籽粒中小分子代谢物籽粒性状与品质密切相关，不同高粱品种籽粒中小分子代谢物的差异可能是酿造品质差异的原因之一。
目前，关于酒粮关系的研究主要聚焦在高粱籽粒中淀粉、蛋白质、脂肪、单宁和矿物质含量及其对出酒率和白酒品质的影响。高粱果皮厚度（果皮层和种皮层）和淀粉结构影响其酿造性能，果皮中的小分子代谢物对白酒风味物质的形成密不可分。然而，关于这方面的研究还相对较少。因此，本研究主要通过比较不同品种高粱的果皮厚度、淀粉结构与小分子代谢物差异，研究不同高粱品种的标志性代谢物，以期为不同酒企专用高粱的品质标准制定提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
糯高粱国窖红1号（GJH1）和佳酿红19（JNH19）：由四川省农科院水稻高粱所分别于2003和2022年选育而成；粳高粱Tx430和BTx623为近代改良品种。样品籽粒完整、无杂质、无坏粒、无杂味，牛皮纸袋密封，种子晾干后储存柜保藏备用。
1.1.2 试剂
甲醇、乙腈、乙酸（均为色谱纯）、N,O-双（三甲基硅基）三氟乙酸酐（分析纯）：赛默飞世尔科技公司；乙酸铵（色谱纯）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；超纯水：屈臣氏集团（香港）有限公司；氯仿、吡啶（均为色谱纯）、饱和脂肪酸甲酯（分析纯）：上海泰坦科技股份有限公司；甲氧胺盐（分析纯）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；L-2-氯苯丙氨酸（纯度≥98%）：上海恒柏生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Gemini SEM300扫描电镜：卡尔蔡司（上海）管理有限公司；Vanquish超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）仪、Orbitrap Exploris 120高分辨质谱、Heraeus Fresco17离心机、Forma 900 series超低温冰箱：赛默飞世尔科技有限公司；BSA124S-CW分析天平：德国赛多利斯公司；YM-080S超声仪：深圳市方奥微电子有限公司；7890A气相色谱-飞行时间质谱联用（gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC-TOF-MS）仪、DB-5MS色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）：美国安捷伦科技公司；ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）：沃特世科技（上海）有限公司；PEGASUS HT质谱仪：美国力可公司；JXFSTPRP-24研磨仪：上海净信科技有限公司；DHG-9023A烘箱：上海一恒科学仪器有限公司；LNG-T98真空干燥仪：太仓市华美生化仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 高粱籽粒理化性质分析
首先选取适量高粱籽粒于散射光下观察其外观颜色。然后选取饱满、完整的籽粒样品，对其进行横切和纵切，各3个生物学重复，在扫描电镜下观察各样品果皮厚度、淀粉颗粒形态。
1.3.2 高粱籽粒小分子代谢物测定
选取饱满、完整的籽粒样品保存在-80 ℃低温冰箱中，直至实验检测进行。每个高粱品系分别做4次生物学重复。参照LI M H等[18]的方法提取样品的代谢物，采用GC-MS及LC-MS检测小分子代谢物。
GC-MS条件：DB-5MS毛细管色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm），不分流，进样量1 μL，载气为氦气（He），流速1 mL/min，升温程序为初始温度50 ℃保持1 min，以10 ℃/min的速率升至310 ℃保持8 min。进样、传输线路和离子源的温度分别为280 ℃、280 ℃和250 ℃；电子能量为70 eV。溶剂延迟6.4 min，全扫描模式，质量扫描范围50～500 m/z。GC-MS检测到的原始数据使用ChromaTOF软件（V4.3x）进行峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析[23-24]，然后根据质谱数据及保留时间与LECO-Fiehn Rtx5数据库匹配，对原始代谢物进行注释，最后通过峰面积归一法计算各组分的相对含量。
LC-MS条件：ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），样品盘温度4 ℃，进样体积2 μL。采样参数为鞘气50 Arb，气帘气15 Arb，毛细管温度320 ℃，全MS分辨率60 000，MS/MS分辨率15 000，NCE模式下碰撞能量10/30/60，喷雾电压3.8 kV（正）和-3.4 kV（负）。原始数据经ProteoWizard软件转成mzXML格式后，使用自主编写的R程序包进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与BiotreeDB（V2.1）自建二级质谱数据库匹配进行物质注释，最后通过峰面积归一法计算各组分的相对含量。
1.3.3 数据处理
采用SPSS 25.0软件进行数据统计和分析，使用R语言进行绘图。
2 结果与分析
2.1 糯粳高粱籽粒颜色差异
4种高粱籽粒的外观颜色见图1。由图1可知，糯高粱GJH1和JNH19的籽粒外观颜色均为红色，且糯高粱JNH19颜色偏深；粳高粱Tx430和BTx623的籽粒外观颜色呈白色或浅黄色。GJH1和JNH19是川南地区的两个主栽品种，根据其品种介绍，其单宁含量分别为1.42%和1.73%；而BTx623和Tx430为美国改良种，单宁含量非常低[4，14]。该结果进一步印证了单宁与高粱籽粒颜色存在一定相关性的说法[11]。说明高粱籽粒颜色可以作为筛选酿酒原材料的第一特征。
图1 4种高粱籽粒外观颜色
Fig.1 Appearance color of 4 sorghum grains
2.2 糯粳高粱籽粒果皮厚度差异
通过扫描电镜观察4种高粱籽粒的果皮厚度，结果见图2。
图2 4种高粱籽粒的果皮厚度
Fig.2 Pericarp thickness of 4 sorghum grains
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图2可知，2种糯高粱籽粒的果皮厚度显著高于2种粳高粱（P＜0.05）。其中，糯高粱JNH19籽粒的果皮最厚，为72.18 μm；其次是糯高粱GJH1，为51.38 μm；粳高粱Tx430籽粒的果皮厚度最小，为36.12 μm。这与闫松显等[11]的研究结果基本一致，糯高粱果皮普遍比粳高粱厚。果皮赋予高粱耐蒸煮和耐翻糙性能，使其在复杂发酵过程中保持籽粒完整，从而有利于白酒酿造过程中多轮次的蒸煮发酵[26-27]，这也是越来越多酒企选择粒小皮厚的高粱品种的原因。此外，果皮还是除了淀粉、蛋白和脂肪等大分子以外的物质载体，尤其是与白酒风味物质的密切相关的小分子代谢物，选用较厚果皮的高粱作为原材料很可能是中国白酒富有特殊风味物质的关键。
2.3 糯粳高粱籽粒淀粉颗粒结构差异
进一步对4种高粱籽粒的淀粉颗粒结构进行观察，结果见图3。由图3可知，高粱籽粒的外层淀粉颗粒与蛋白质和脂质等结合紧密，但糯高粱相比粳高粱明显存在更多空隙。就内层淀粉颗粒而言，糯高粱籽粒内层淀粉多为大小不一的卵圆形颗粒，这就导致其淀粉颗粒间存在较多空隙；而粳高粱籽粒内层淀粉颗粒多为不规则或者表面存在较多凹陷，这可能是淀粉颗粒间相互挤压引起的，使淀粉颗粒排列更为紧凑。这样的淀粉结构特征可能正是糯高粱酿造性能优于粳高粱的原因，糯高粱淀粉结构比粳高粱疏松，更有利于发酵时菌群的进入和水分吸收[10，28-29]。解析不同品种高粱的淀粉颗粒特征，有助于不同酒企制定原料标准并完善其酿造工艺。
图3 4种高粱籽粒外层淀粉（A）和内层淀粉（B）形态结构
Fig.3 Morphological structure of outer starch (A) and inner starch (B)in 4 sorghum grains
2.4 糯粳高粱籽粒小分子代谢物差异
从4种高粱样品中共提取得到40 324个原始峰，经偏离值过滤、缺失值过滤、缺失值填补和数据标准化处理，保留25 112个峰值。对质控后的25 112个小分子物质相对含量进行主成分分析（principal component analysis，PCA），结果见图4。由图4可知，前三个主成分的累计方差贡献率为67.8%，且不同品种高粱能够被区分，说明4种高粱在小分子代谢物组成与含量上存在明显差异。
图4 基于小分子物质相对含量4种高粱品种的主成分分析结果
Fig.4 Principal component analysis results of 4 sorghum varieties based on the relative content of small molecule metabolites
将25 112种小分子代谢物与BiotreeDB（V2.1）自建的二级质谱数据库进行匹配，共鉴定到824个信息明确的小分子化合物，对其进行分类整理，结果见图5。
图5 824种小分子代谢物分类及占比
Fig.5 Classification and proportion of 824 small molecule metabolites
由图5可知，这些小分子化合物主要包括有机酸及其衍生物（4.70%）、有机氧化合物（3.42%）、脂类和类脂分子（2.03%）、有机杂环化合物（1.07%）、苯丙烷和聚酮类（1.07%）、均相非金属化合物（0.43%）、苯环型化合物（0.43%）、核苷及核苷酸（0.21%）以及其他类别化合物。有研究表明，高粱籽粒中的有机酸、酚类等小分子代谢物也是会影响白酒的风味成分及其前体[30-32]。因此，明确不同类型高粱籽粒中的小分子代谢物种类及其差异，有助于进一步探究高粱中小分子代谢物与白酒中风味物质的对应关系。
为了明确824个小分子代谢物在4种高粱间的相对含量变化趋势，将其相对含量标准化后（Z-score）进行K均值（K-Means）聚类分析，结果分为9组，具体见图6A。由图6A可知，糯高粱中含量相对较高的小分子代谢物主要在第5组，包括儿茶素、油酸、棕榈酸、乳果糖和葡庚糖酸等101个。由图6A亦可知，粳高粱中含量相对较高的小分子代谢物主要聚集在第7组，包括5-羟基吲哚-3-乙酸、甘草苷、海藻糖和D-阿拉伯醇等75个。此外，在第3组中鉴定到糯高粱JNH19中高含量的小分子代谢物44个；在第1组中鉴定到糯高粱GJH1中高含量的小分子代谢物115个。VARGAS-SOLÓRZANO J W等[9]在酱香型白酒轮次基酒中也鉴定到油酸等5种酸类非挥发性风味物质，本研究结果显示糯高粱籽粒中儿茶素、油酸等有机酸及其衍生物占比较高，说明高粱籽粒中有机酸很可能会影响基酒中风味物质的产生。
图6 4种高粱品种差异代谢物的筛选结果
Fig.6 Screening results of differential metabolites in 4 sorghum varieties
A：824种小分子代谢物在4种高粱中的K-Means聚类分析；B：糯高粱标志代谢物儿茶素在4种高粱中的含量；
C～D：高粱GJH1和BTx623中儿茶素的GC-MS图，红色箭头标注为儿茶素的峰。
选取糯粳高粱间相对含量相差100倍以上，且P值＜0.01的小分子代谢物作为标志性代谢物。结果表明，糯高粱的标志性代谢物只有儿茶素，粳高粱的标志性代谢物为5-羟基吲哚-3-乙酸。由图6B可知，儿茶素在糯高粱JNH19和GJH1中的相对含量分别达到0.26%和0.38%，是粳高粱的2 604倍（图6B）。由图6C和6D可知，从糯高粱的质谱图上也能明显观察到儿茶素的峰（保留时间26.31 min），而在粳高粱的质谱图上几乎观察不到与之对应的峰。有研究表明，儿茶素是红酒中的重要生物活性成分，具有抗氧化、清除自由基以及加强新陈代谢的功能[33]。因此，儿茶素可以作为糯高粱潜在的标志性代谢物，作为酒企评估高粱品质的一个指标。5-羟基吲哚-3-乙酸在粳高粱BTx623和Tx430中的相对含量分别为0.009%和0.0026%，是糯高粱的67 088倍，可以作为粳高粱潜在的标志性代谢物。
3 结论
本研究通过分析4种具有代表性的高粱品种的理化性质，揭示了糯粳高粱在籽粒颜色、果皮厚度、淀粉结构上存在明显差异。2种糯高粱籽粒呈红色，2种粳高粱籽粒呈白色；糯高粱的果皮（果皮层和种皮层）厚度（49.35～78.16 μm）显著高于粳高粱（33.39～49.03 μm）（P＜0.05）；糯高粱的淀粉颗粒主要呈卵圆形且排列疏松，而粳高粱的淀粉颗粒多为不规则且排列紧密；这些均是糯高粱酿造性能优于粳高粱的物质基础。不同高粱品种之间的小分子代谢物组分存在显著差异，糯高粱的标志性代谢为物儿茶素，粳高粱的标志性代谢物为5-羟基吲哚-3-乙酸，结果为不同酒企酿造原料的合理选用及验收标准的建立提供了参考。
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