香气是影响葡萄酒质量的主要因素之一，在葡萄酒品鉴过程中发挥重要作用[1-2]。葡萄酒的香气成分复杂多样，受到多方面因素影响，包括葡萄品种、产地的土壤及气候、酿造工艺等[3-4]。因此即便对于同一品种的葡萄，在不同地区的表现也大不相同。宁夏地区位于中国西北部黄河上游，气候干燥，昼夜温差大，土质疏松，具有得天独厚的风土条件，适宜葡萄种植，是国内较为成熟的酿酒葡萄产区[5-6]。湖北属亚热带季风气候，雨热同期，年平均降水量800～1 600 mm，是我国南方主要的葡萄产区。近年来，湖北葡萄产区由鄂西北逐渐向江汉平原转移，其中武汉地区葡萄种植面积迅速扩大，产量超过2.65万t，且呈现稳步增长趋势[7-10]。但武汉酿酒葡萄产业起步晚，葡萄酒风格尚不明确。挥发性风味化合物的含量、类别以及气味决定酿造出的葡萄酒的质量及特点[11-13]。因此研究同一品种葡萄酒在不同地区的特征挥发性风味成分对于研究不同产区内葡萄酒差异化的表现、提升葡萄品质具有重要意义。
‘威代尔’（Vidal）葡萄原产于加拿大，是加拿大酿造冰酒的主要品种，2000年首次引入中国[14-16]。‘威代尔’是白玉霓（Ugni blanc）和白赛比尔（Sebel blanc）杂交的白色品种，研究发现其抗寒性明显优于一般欧亚种葡萄[17-20]。目前关于‘威代尔’葡萄酒的研究主要集中在冰酒特征香气成分的研究[21-24]，陈方圆等[21]对贺兰山东麓威代尔冰酒挥发性风味物质及香气特征分析，该研究指出，威代尔冰酒中主要呈香物质为含量较高的酯类及有机酸类物质；张旺[22]通过对冰酒发酵过程中微生物与香气的相关性进行分析，揭示了冰酒发酵过程中菌群结构及其对冰酒香气的影响；曲昆生等[23-24]进一步探讨了酿造工艺及发酵过程对于威代尔冰酒香气的影响。然而，对于不同产区‘威代尔’干白葡萄酒香气风味差异性来源的分析报道较少，进一步揭示其挥发性风味物质差异，有利于加强对不同产区葡萄酒的风味认知和控制。
本研究以宁夏及武汉两个产区‘威代尔’葡萄为研究材料，通过顶空-固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）与气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）联用的方法[25-26]，对‘威代尔’干白葡萄酒的挥发性风味成分进行检测研究。本研究对‘威代尔’干白葡萄酒的挥发性风味成分进行分析，并比较两个产区葡萄酒挥发性风味物质含量的差异，并分析差异物质风味。并通过正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）确定两个产区‘威代尔’干白葡萄酒的主要特征标志物，为研究和实现不同产区干白葡萄酒挥发性风味物质的定量鉴定提供了理论依据，对我国不同产区干白葡萄酒发酵产品的质量提升具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酒样：本研究试验用酒由2022年9月宁夏森淼酒庄提供的‘威代尔’葡萄和武汉植物园中葡萄园采集的‘威代尔’葡萄采用相同工艺酿造。酵母D254：上海杰兔工贸有限公司。
C8～C40正构烷烃：西力生物技术有限公司；无水乙醇（色谱纯）、氯化钠（分析纯）：中国国药集团药业股份有限公司；正己烷（色谱纯）：德国默克公司。
1.2 仪器与设备
Agilent 8890-7000D气相色谱-质谱联用仪、DB-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、120 μm DVB/CWR/PDMS固相微萃取头：美国安捷伦公司；CTC SPME Arrow固相微萃取装置、CTC Conditioning Station Fiber老化装置、CTC Agitator样品加热箱：瑞士思特斯分析仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 干白葡萄酒酿造工艺与操作要点
宁夏/武汉‘威代尔’葡萄采收→人工分选→去梗破碎→压榨出汁→添加焦亚硫酸钾和果胶酶→入罐降温→下胶澄清→分离上清→酵母活化、接种→酒精发酵→糖度监测→发酵结束，分离酒液→添加焦亚硫酸钾→‘威代尔’干白葡萄酒
操作要点：根据小容器酿造法进行酿造[27]，取成熟度良好的宁夏（含糖量210 g/L）及武汉（含糖量170 g/L）威代尔葡萄品种，去除病虫、坏果、生青果后去梗破碎；取汁过程中添加60 mg/L焦亚硫酸钾和30 mg/L果胶酶，将葡萄汁温度降低至5 ℃；在葡萄汁中按照1 g/L加入已活化的皂土，4 ℃条件下澄清24 h；待澄清后取出上清葡萄汁，按照250 mg/L添加量加入已培养好的酵母D254，控制发酵温度为（16±2）℃，发酵过程监测糖度变化。发酵结束后分离酒液，加入焦亚硫酸钾（90 mg/L），温度降至0～3 ℃，去除酒泥后储存。
1.3.2 理化指标测定
依据国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》规定的方法对葡萄酒理化指标（总糖、总酸、酒精度）进行分析测定。
1.3.3 挥发性风味成分的测定
样品前处理：取1 mL葡萄酒样品于样品顶空瓶，加入饱和氯化钠溶液和10 μL（50 μg/mL）3-己酮内标溶液，在60 ℃恒温下振荡5 min后将插入萃取头保持15 min，升温至250 ℃解吸5 min。
气相色谱条件：安捷伦DB-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。载气为高纯氦气（He），气体流速1.2 mL/min，进样口温度为250 ℃，进样时不分流。温度按程序升高：40 ℃保持3.5 min，然后以10 ℃/min升温至100 ℃，再以7 ℃/min升温至180 ℃，最后以25 ℃/min升温至280 ℃，并保持5 min。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，质谱接口温度280 ℃，电子能量70 eV，扫描方式为选择离子监测模式（selected ions monitoring，SIM），定性定量离子精准扫描。
定性定量分析：基于多物种、文献、部分标品以及保留指数建立数据库，包含确定的保留时间以及定性定量离子。测试分析过程中，对比样品与标准参考相的保留时间及特征离子进行定性分析[28]；根据内标法（3-己酮50 μg/mL）定量分析。
1.3.4 数据分析
通过MassHunter软件处理质谱分析后的下机原始数据，基于武汉迈特维尔生物科技有限公司自建数据库，对样本的代谢物进行了质谱定性定量分析；用MassHunter软件打开样本质谱文件并进行积分和校正。
2 结果与分析
2.1 不同产区‘威代尔’干白葡萄酒理化指标测定结果
对武汉和宁夏产区的‘威代尔’干白葡萄酒的理化指标进行测试，测定的总糖、总酸及酒精度见表1。
表1 武汉与宁夏产区‘威代尔’干白葡萄酒理化指标测定结果
Table 1 Determination results of physicochemical indexes of 'Vidal'dry wines from Wuhan and Ningxia regions
产区 总糖（以葡萄糖计）/（g·L-1）酒精度/%vol武汉宁夏总酸（以酒石酸计）/（g·L-1）2.23 3.57 5.06 6.94 11.0 13.6
由表1可知，宁夏和武汉产区‘威代尔’干白葡萄酒中，总糖（以葡萄糖计）分别为3.57 g/L和2.23 g/L，含糖量较低，表明两款干白葡萄酒均已充分发酵；宁夏‘威代尔’的总酸值（6.94 g/L）高于武汉威代尔（5.06 g/L），这在一定程度上有利于生成更多的酯类香气物质，从而赋予干白葡萄酒更浓郁的果香；此外，两款酒的酒精度分别为13.6%vol及11.0%vol。
2.2 不同产区‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味成分特征分析
2.2.1 干白葡萄酒离子色谱分析
通过对宁夏和武汉产区‘威代尔’干白葡萄酒的挥发性风味物质成分进行检测分析，其总离子色谱图见图1。由图1可知，每个产区的数据具有良好的可重复性，且两个产区的‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味成分峰形具有差异。共分离出713个色谱峰，相较于武汉‘威代尔’干白葡萄酒，宁夏‘威代尔’干白葡萄酒在保留时间为9.6 min、16.7 min、16.8 min的丰度明显衰减。需要进一步对于两种产区的干白葡萄酒挥发性风味成分进行检测鉴定。
图1 武汉与宁夏产区‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味成分GC-MS分析总离子色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of volatile flavor substances of 'Vidal'dry white wines from Wuhan and Ningxia regions analysis by GC-MS
2.2.2 挥发性风味成分种类及数量鉴定
葡萄酒香气风格特征主要与其挥发性风味成分密切相关，通过MassHunter软件处理质谱分析后的下机原始数据，两个产区‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味成分种类及数量见图2。由图2可知，共定性了713种挥发性风味成分[28]，其中包括萜类150种，酯类123种，杂环化合物113种，酮类61种，醇类58种，烃类53种，醛类38种，芳烃类31种，胺类23种，酸类22种，酚类20种，含氮化合物8种，含硫化合物6种，其他类3种，醚类2种，卤代烃2种。这些挥发性风味成分具有不同的风味特征并且彼此互相影响，共同组成了葡萄酒风味的复杂多样性。
图2 武汉与宁夏产区‘威代尔’干白葡萄酒挥发性化合物种类及数量
Fig.2 Types and number of volatile flavor substances in‘Vidal’dry white wines from Wuhan and Ningxia regions
2.3 不同产区‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味成分差异分析
2.3.1 挥发性风味成分含量测定及比较
武汉与宁夏产区‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味成分含量测定结果见图3。
图3 武汉与宁夏产区‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味成分含量
Fig.3 Volatile flavor substances contents in 'Vidal' dry white wines from Wuhan and Ningxia regions
由图3可知，宁夏和武汉产区‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味成分含量较高的主要是杂环化合物类、萜类、烃类、酯类物质。其中宁夏‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味成分总含量最高，其中烃类、酯类和酮类物质的含量高于武汉‘威代尔’干白葡萄酒。在武汉‘威代尔’干白葡萄酒中则是杂环化合物含量较高。
2.3.2 差异性挥发化合物风味分析
基于两产区‘威代尔’干白葡萄酒整体挥发性风味成分的类目定性鉴定，进而对两款葡萄酒主要差异性的挥发性风味成分含量进行定量分析，以期系统分析两产区‘威代尔’干白葡萄酒风味差异来源。713种挥发性风味成分中，以任一产区的物质含量高于1 μg/mL（以排除含量极低物质）及差异显著（P＜0.01）为标准进行鉴定，得到36种影响两款葡萄酒风味的主要差异性挥发物质，其中宁夏产区含量高于武汉产区的主要挥发性风味成分9种，低于武汉产区的主要挥发性风味成分27种，其含量测定结果及香气描述分别见表2和表3。
表2 ‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味成分含量（宁夏产区含量高于武汉产区的主要成分）
Table 2 Volatile flavor substances contents in 'Vidal' dry white wines (compositions in Ningxia regions with higher contents than Wuhan regions)
含量/（μg·mL-1）武汉威代尔 宁夏威代尔数量 分类 化合物 CAS 香气描述[29-31]1 2 3 4 5 6 7 8 9酯类酯类酯类杂环化合物酮类烃类萜类含氮化合物醇类β-苯乙酸乙酯苯甲酸烯丙酯邻苯二甲酸二甲酯3-（2-呋喃基）-2-丙醛5-丙烷-2-基双环[3.1.0]己-3-烯-2-酮2-甲基-7-外乙烯基双环[4.2.0]辛-1(2)-烯（1α,2β,5α）-2,6,6-三甲基-双环[3.1.1]庚-3-3酮3,7-二甲基-2,6-辛二烯腈反-2,顺6-壬二烯醇103-45-7 583-04-0 131-11-3 623-30-3 36262-12-1 107914-89-6 15358-88-0 31983-27-4 28069-72-9 3.40 0.40 0.62 2.84 1.70 33.70 2.81 0.44 1.97 31.17 3.75 15.76 12.13 6.90 131.21 3.49 1.36 2.47花香，玫瑰，甜香甜香，花香，樱桃-生青味，青草香，果香-- -柠檬香，醛香，金属生青味，黄瓜，油香
表3 ‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味成分含量（宁夏产区含量低于武汉产区的主要成分）
Table 3 Volatile flavor substances contents in 'Vidal' dry white wines (compositions in Ningxia regions with lower contents than Wuhan regions)
数量 分类 化合物 CAS 香气描述[29-31]含量/（μg·mL-1）武汉威代尔 宁夏威代尔1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0花香，玫瑰，肥皂香甜香，果香，生青味蜡香，果香，奶油-烘烤味，咖啡，鱼腥味--药草香，薄荷香榛子，坚果香金属11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27酯类酯类酯类杂环化合物杂环化合物杂环化合物杂环化合物酮类酮类酮类烃类烃类烃类烃类萜类萜类萜类萜类酸类酸类醛类醛类醛类含氮化合物醇类醇类醇类橙花乙酸酯乙酸异戊酯十六烷酸乙酯3-丁基噻吩2-噻吩甲基硫醇3-乙酰基-2-氧代-1,3-恶唑烷3,5-二甲基吡唑-1-羧胺1-甲基-4-丙-2-亚基-7-氧杂双环[4.1.0]庚烷-5-酮5-甲基-2-庚-4-酮3-庚酮4,7-二甲基-十一烷3,5-二甲基-十一烷1,10-十一碳二烯1-十二碳烯松香醇(S)-(-)-2-甲基-6-次甲基-7-辛烯-4-醇1,3,3-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-酮-- - -紫苏烯2-辛烯酸己酸（E）-2-十一烯醛1,2-二甲酰肼反-4-癸烯醛2,2'-亚氨基二-乙腈2-环戊基乙醇1,2-辛二醇1-庚醇141-12-8 123-92-2 628-97-7 34722-01-5 6258-63-5 1432-43-5 22906-75-8 35178-55-3 102322-83-8 2918-13-0 17301-32-5 17312-81-1 13688-67-0 112-41-4 6712-79-4 35628-05-8 1195-79-5 539-52-6 1470-50-4 142-62-1 53448-07-0 628-36-4 65405-70-1 628-87-5 766-00-7 1117-86-8 111-70-6 2.88 3.68 4.40 8.08 41.13 2.35 6.90 1.55 1.27 1.83 5.75 4.19 3.75 2.03 3.06 2.48 1.26 2.95 21.48 1.65 1.16 6.96 1.49 2.63 2.23 2.73 2.39 0.00 1.20 1.89 0.03 0.71 0.54 4.40 0.11 0.19 0.61 0.00 0.42 0.72 0.91 0.00 0.31 0.46 1.43 0.00 0.15 0.00 0.61 0.17 1.10 0.00 0.29 0.38木香，温暖，香膏香-药草香，雪松叶，苦味木香-玫瑰，天竺葵，奶酪香清新，果香，柑橘香-清新，醛香，柑橘香-- -青草香
由表2可知，宁夏产区‘威代尔’干白葡萄酒中β-苯乙酸乙酯（含量为31.17 μg/mL）等9种挥发性风味成分含量显著高于武汉产区（3.40 μg/mL），β-苯乙酸乙酯赋予了宁夏威代尔葡萄酒花香，玫瑰，甜香等风味特征；宁夏产区‘威代尔’干白葡萄酒的苯甲酸烯丙酯含量（3.75 μg/mL）、邻苯二甲酸二甲酯（15.76 μg/mL）和3-（2-呋喃基）-2-丙醛（12.13 μg/mL）风味物质也都明显高于武汉产区（分别为0.40 μg/mL、0.62 μg/mL、2.84 μg/mL）。苯甲酸烯丙酯特征性的甜香，花香，樱桃风味及3-（2-呋喃基）-2-丙醛的生青味，青草香，果香为宁夏威代尔葡萄酒带来了独特风味和丰富层次的口感，更多的邻苯二甲酸二甲酯等酯类物质也有利于提供更加浓郁的酒香。
由表3可知，宁夏产区‘威代尔’干白葡萄酒有27种挥发性风味成分含量则显著低于武汉产区，这些低含量的挥发性风味成分主要集中于杂环化合物（4种）、烃类（4种）和萜类（4种），这些挥发性风味成分普遍较臭或有塑料口感[32]，预期会降低威代尔干白葡萄酒风味和口感。具体而言，宁夏产区‘威代尔’干白葡萄酒的3-丁基噻吩含量（0.03 μg/mL）和2-噻吩甲基硫醇含量（0.71 μg/mL）远低于武汉产区这些物质含量（分别为8.08 μg/mL和41.13 μg/mL）。噻吩和硫醇类物质的引入会导致葡萄酒风味发苦，特别是2-噻吩甲基硫醇存在烘烤味，咖啡，鱼腥味，会降低酿造葡萄酒的口感。此外，尽管武汉产区‘威代尔’干白葡萄酒中橙花乙酸酯（2.88 μg/mL，花香，玫瑰，肥皂香）、乙酸异戊酯（3.68 μg/mL，甜香，果香，生青味）、十六烷酸乙酯（4.40 μg/mL，蜡香，果香，奶油）三种酯类含量高于宁夏产区对应物质含量（分别为0 μg/mL，1.20 μg/mL和1.89 μg/mL），这些酯类物质有望提高葡萄酒香气及风味，然而，这些有利的挥发性风味成分含量并不高，无法明显提高武汉产区‘威代尔’干白葡萄酒香气风味。
武汉与宁夏产区‘威代尔’干白葡萄酒差异物质风味组学桑基图对两产区香气特征及挥发性风味成分进行关联，结果见图4。
图4 武汉与宁夏产区‘威代尔’干白葡萄酒差异物质风味组学桑基图
Fig.4 Sankey diagram of flavor omics of different substance flavors of 'Vidal' dry white wines from Wuhan and Ningxia regions
红色线条宁夏威代尔高于武汉威代尔的风味物质；紫色表示宁夏威代尔低于武汉威代尔的风味物质。
由图4可知，两个产区‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味成分差异物质的风味主要是果香，生青味，甜香，蜡香，药草香，木香，花香，柑橘香等风味。这些化合物构成了两个产区酿造的葡萄酒挥发性风味成分的差异，可能解释其风味区别的原因。综合表2和表3及图4结果说明，同一葡萄品种，由于其生长产区的风土，气候等因素的影响，其酿造的葡萄酒风味也会有很大差别，这主要是由于其中挥发性风味成分差异导致的，宁夏产区‘威代尔’干白葡萄酒中酯类等物质含量优于武汉产区，杂环化合物、烃类及萜类物质含量低于武汉产区。
2.3.3 特征香气物质聚类分析
（1）主成分分析
鉴定两个产区的葡萄酒的重要贡献香气特征物是区分两个产区‘威代尔’干白葡萄酒香气特征的重要指标，能够为探究多产区葡萄酒风味差异来源提供见解。首先，对检测出的挥发性风味成分进行主成分分析（principalcomponent analysis，PCA），两个产区‘威代尔’干白葡萄酒在主成分1（PC1）和2（PC2）的得分图见图5。由图5可知，葡萄酒挥发性风味成分第一主成分（PC1）解释方差为66.69%，第二主成分（PC2）解释方差为19.49%，累计方差贡献率为86.18%，说明模型可以反映样品大部分信息。武汉及宁夏地区‘威代尔’干白葡萄酒分别分为一类，两个产区‘威代尔’葡萄酒挥发性风味成分的确存在显著差异。
图5 武汉与宁夏产区‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味物质主成分分析
Fig.5 Principal component analysis of volatile flavor substances of'Vidal' dry white wines from Wuhan and Ningxia regions
（2）偏最小二乘法判别分析
偏最小二乘法判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）是一种多变量统计分析方法，具体做法是分别提取自变量X与因变量Y中的成分，然后计算成分间的相关性。相较于PCA分析，PLS-DA能更好的鉴定差异物质。正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）通过融合正交信号矫正和PLS-DA方法，可以弥补PCA分析的缺陷，更好的分析组间差异。基于OPLS-DA模型得到的变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值，可以初步筛选不同产区‘威代尔’干白葡萄酒的挥发性风味成分的重要的特征物质。两个产区‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味物质VIP值结果见图6。
图6 宁夏和武汉地区‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味物质变量投影重要性值
Fig.6 Variable importance in projection values of volatile flavor substances of 'Vidal' dry white wines from Wuhan and Ningxia regions
VIP值越大，物质在两个产区的含量差异越大。为了筛选宁夏和武汉产区‘威代尔’干白葡萄酒差异挥发性风味成分，由图6可知，以VIP≥1.22，以任一产区的物质含量高于1 μg/mL及P＜0.01为指标，确定区分两个产区的‘威代尔’干白葡萄酒的重要贡献香气物质共有8种，包括1-庚醇，5-甲基-2-庚-4-酮，β-苯乙酸乙酯，松香醇，2-环戊基乙醇，4,7-二甲基-十一烷，2-辛烯酸和苯甲酸烯丙酯。这8种物质可以作为2个产地之间相互区分的主要标志物。其中，1-庚醇具有青草香味；5-甲基-2-庚-4-酮具有榛子、坚果香等气味；β-苯乙酸乙酯具有花香、玫瑰香、甜香味；松香醇具有木香、暖香、香膏香等气味；苯甲酸烯丙酯具有甜香、花香、樱桃味。这些挥发性风味成分对葡萄酒香气具有重要贡献，是区分两个产区‘威代尔’干白葡萄酒香气特征的重要指标，决定着两个产区‘威代尔’干白葡萄酒香气风格走向。
为了进一步验证宁夏和武汉两个产区主要标志物对‘威代尔’干白葡萄酒的区分，对选出的8种特征香气物质进行聚类分析，结果见图7。
图7 基于8种特征香气物质不同产区‘威代尔’葡萄酒层次聚类分析结果
Fig.7 Hierarchical cluster analysis results of'Vidal'wines from different regions based on 8 characteristic flavor components
由图7可知，宁夏和武汉两个产区的‘威代尔’干白葡萄酒能显著区分，8种特征香气物质对两个产区的区分进一步降低了不同产地葡萄酒来源的识别成本。
3 结论
本研究通过对武汉及宁夏两个产区‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味成分进行测定分析，共检出713种挥发性风味成分。不同产区的‘威代尔’干白葡萄酒挥发性风味成分种类相同，但是其相对含量有明显差别。通过对武汉及宁夏两个产区葡萄酒挥发性风味成分进行OPLS-DA，鉴定出区分两个产区的葡萄酒的重要贡献物质共有8种。这8种特征香气成分可以作为武汉及宁夏两个产区的‘威代尔’干白葡萄酒之间区分的主要标志物。通过OPLS-DA与主要标志物的聚类分析能全面、客观的对武汉及宁夏两个产区‘威代尔’干白葡萄酒进行区分和评价。本工作从挥发性风味成分差异的角度出发，揭示了不同产区葡萄酒香气风味差异的来源，有效实现了对差异化挥发性风味成分进行鉴定和区分，对这些葡萄酒风味化合物的形成机制进行深入研究，能为我国不同产区干白葡萄酒发酵产品的质量提升提供一定的指导。
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