柚子（Citrus maxima）是芸香科的一种柑橘类果实，盛产于我国福建、广西、四川等地，因果实香甜可口，又可在常温下久置，因此被称为“天然水果罐头”[1]。柚子富含维生素C（vitamin C，VC）、酚类化合物等，具有清除自由基的抗氧化活性，有利于人体健康[2]。此外，柚子还含有生物活性物质生物苷，具有降血糖、抗菌、抗肿瘤等药用价值[3]。
中国是世界上主要的柚子生产国，产量在不断增长，但销售仍以鲜果为主，市场饱和已成为制约柚子产业发展的瓶颈。因此，开发柚子多样化的增值利用和先进的加工技术有助于其在食品工业上的发展。目前，柚子产品以果酱、果脯、果汁类制品居多[4]，关于柚子果酒的研究主要为发酵条件及工艺过程的优化[5-7]，利用特殊菌种来提高柚子果酒的品质及风味的研究还相对较少。酵母的选择会对酿造果酒的品质和风味产生较大影响[8-9]。酿酒酵母在果酒酿造中使用较为广泛，具有良好的发酵能力，但其物质代谢不具有特异性，还会造成果酒中一些关键香气成分的丢失[10]，而一些非酿酒酵母可以改善这一情况。巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）和酿酒酵母混合发酵在增加葡萄酒色稳定性的同时还能增加酚类物质含量[11]；葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、耐热克鲁维酵母（Kluyveromyces thermotolerans）等非酿酒酵母的混合发酵能增加黄桃酒的风味并提高其品质[12]。粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）具有降酸、提高香气复杂性等作用，现已被用于朗姆酒、苹果酒、葡萄酒等酒类产品的发酵[13]，但粟酒裂殖酵母应用于柚子果酒酿造还鲜见报道。
本研究以真龙柚为原料，采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC 31084、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）CICC 1760单独发酵以及混合发酵柚子果汁制备柚子果酒，考察不同菌种对柚子果酒感官品质、理化性质和香气成分的影响，为柚子果酒的开发及工艺优化提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
真龙柚：四川省泸州市合江县。
酿酒酵母（S. cerevisiae）CICC 31084、粟酒裂殖酵母（S.pombe）CICC 1760：中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2 试剂
草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸标准品（纯度均＞98%）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；3-辛醇（纯度＞98%）：东京化成工业株式会社；甲醇、甲酸（均为色谱纯）：成都市科隆化学品有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、葡萄糖20 g/L。121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
TD-45显式糖度计：北京金科利达电子科技有限公司；LH-J80手持折光仪：宁波赛吉生物科技有限公司；PHS-3E pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；Ultimate 3000高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：赛默飞世尔科技公司；Agilent 7890B气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪、DBWAX气相色谱柱（60 m×250 μm×0.25 μm）：美国安捷伦科技有限公司；Amethyst C18-H液相色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）：苏州赛分科技有限公司；50 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷固相微萃取头（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）：美国Supelco公司；HZ-9210K恒温摇床：太仓市华利达实验设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 柚子果酒制备工艺流程及操作要点[1]
柚子去皮→破碎→酶解→添加SO2→调糖、调酸→巴氏杀菌→接种发酵→过滤→柚子果酒
操作要点：挑选未受感染和物理损坏的真龙柚，分离果皮和果肉，果肉搅打成果汁，搅拌均匀并过滤备用。柚子果汁中加入20 mg/L果胶酶，于40 ℃水浴锅中酶解2 h。再与60 mg/L SO2充分混合，搅拌均匀。加入蔗糖调节糖度为20°Bx。使用柠檬酸将果汁的pH控制在4.0左右（原始柚子果汁和调整糖度及pH后的果汁分别记为PJ、PJ0），然后80 ℃水浴10 min灭菌。将S.pombe和S.cerevisiae分别接种于YPD液体培养基中，于28 ℃、150 r/min条件下连续培养24～48 h，相同条件活化2次，按每株菌107 CFU/mL的接种量接种于150 mL果汁中，分别记为酿酒酵母单发酵组（SC）、粟酒裂殖酵母（SP）、酿酒酵母和粟酒裂殖酵母混合发酵组（1∶1）（CF），在28 ℃、150 r/min条件下封闭发酵158 h。每天使用折光仪和糖度计测定一次酒精度和糖度，采用质量损失法测定CO2产量，所测数据趋于稳定后再发酵3 d，停止发酵。将发酵液离心取上清液，用0.22 μm滤膜过滤除菌，得到柚子果酒。
1.3.2 柚子果酒基本理化指标的测定
pH值、糖度、酒精度和还原糖含量测定参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[14]。
1.3.3 柚子果酒的感官评价
由15名相关专业的老师和同学组成品评小组，从色泽、透明度、香味、滋味、典型性5个方面对柚子果酒进行感官评分，满分100分。总分80分及以上为优秀，60分及以上为合格，60分以下为较差，具体评分标准见表1[15]。
表1 柚子果酒的感官评分标准
Table 1 Sensory score standards of pomelo wine
项目 评分标准 评分/分色泽（20分）透明度（20分）香味（20分）具有柚子果酒应有的色泽，无褐变具有一定柚子果酒应有的色泽，轻度褐变缺乏柚子酒应有色泽，中度褐变缺乏柚子酒应有色泽，严重褐变澄清透亮，无沉淀物及悬浮物澄清透亮，光泽略差轻微沉淀或悬浮物，光泽差大量沉淀及悬浮物，光泽暗哑柚子果香和酒香浓郁，诸香和谐纯正柚子果香和酒香和谐纯正，但不浓郁柚子果香和酒香较淡，感觉一般柚子果香和酒香不足，有异香16～20 11～15 6～10＜5 16～20 11～15 6～10＜5 16～20 11～15 6～10＜5
续表
项目 评分标准 评分/分滋味（20分）典型性（20分）酒体丰满，口味甘甜醇厚，柔和爽口，回味悠长酒体平衡，柔细轻快，纯正无杂，回味较好酒质略酸或略甜，欠浓郁，口感粗糙，回味单一口感平淡，柔和性差，有异味风格独特，酒体组分协调风格明显，酒体组分较协调风格不明显，酒体组分尚协调无风格，酒体组分不协调16～20 11～15 6～10＜5 16～20 11～15 6～10＜5
1.3.4 有机酸含量的测定
采用HPLC法测定有机酸含量[16]。
1.3.5 挥发性风味成分含量的测定
采用顶空固相微萃取法（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）结合GC-MS法测定柚子果汁和果酒中挥发性风味成分[17]。
样品前处理：取5 mL待测柚子果酒于18 mL顶空瓶中，加入20 mg/L的3-辛醇（内标），充分振荡溶解。40 ℃水浴恒温预热20 min，将50 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶的顶空部分，在40 ℃吸附萃取30 min，萃取后直接进样进行GC-MS分析，气相进样口250 ℃解吸5 min。
气相色谱条件：DB-Wax毛细管色谱柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；进样口温度250 ℃，不分流进样；载气为高纯氦气（He），流速1.0 mL/min；升温程序为起始温度40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至240 ℃，保持10 min。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV；传输线温度240 ℃；离子源温度230 ℃。全扫描模式，质量扫描范围为65～300 m/z，扫描时间为0.2 s。
定性定量：采用美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）20数据库检索确定初步结果，再根据挥发性成分的保留指数与文献报道的数据对挥发性风味成分进行定性。通过峰面积归一化法进行定量。
香气活性值（odor activity value，OAV）的计算：查阅挥发性香气物质在体积分数46%乙醇水溶液中的阈值，通过阈值和含量计算香气物质的OAV，以此评价该香气物质对样品整体风味的贡献程度[18]。OAV计算公式如下：
式中：Ci为香气物质的质量浓度，μg/mL，OTi为香气物质在体积分数46%乙醇水溶液中的阈值，μg/L。
1.3.6 数据处理
样品平行测3次，结果用“平均值±标准差”表示。使用SPSS 25.0、SIMCA 14.1软件对数据进行分析，使用Origin 2023、GraphPad Prism 8.0.1软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 发酵时间的确定
发酵过程中各组酒精度、糖度、二氧化碳产量的变化见图1。由图1A可知，随着发酵的进行，各组柚子果酒的酒精度均先快速上升，然后缓速增加，最终趋于平稳，SP组和CF组在发酵第3天后不再变化，SC组在发酵第4天后基本不再变化，这可能与果汁中糖被消耗以及酵母菌活力逐渐下降有关。由图1B和1C可知，各组柚子果酒糖度均在发酵第4天趋于平稳，各组二氧化碳的产量也在发酵第4天趋于0，这与酒精度变化规律基本一致。YU W Y等[16]对苹果酒的研究表明，糖度和二氧化碳产量稳定3 d后即可判断为发酵终点，故将柚子果酒的发酵时间定为6 d。此外，由图1可知，3种发酵方式的酒精度、糖度和二氧化碳产量变化规律基本一致，表明3种发酵方式的发酵动力无明显差异。
图1 柚子果酒发酵过程中酒精度（A）、糖度（B）及二氧化碳产量（C）的变化
Fig.1 Changes of alcohol content (A), sugar content (B), and carbon dioxide yield (C) of pomelo wine during fermentation process
2.2 柚子果酒的理化指标
各组柚子果汁和果酒的理化指标见表2。由表2可知，柚子果汁发酵后，果酒的pH值降至3.91～3.96，与PJ0组相比无明显差异（P＞0.05），而糖度和残糖量显著降低（P＜0.05），3组果酒的糖度均降至7.80°Bx，酒精度均为10%vol，残糖量为5.26～5.53 g/L。3种发酵方式对柚子果酒pH、糖度、酒精度和残糖量的影响均无显著差异（P＞0.05），结果表明，粟酒裂殖酵母CICC 1760具有较强的发酵能力，与之前文献[13]报道的一致。
表2 柚子果汁与不同柚子果酒理化指标的测定结果
Table 2 Determination results of physicochemical indexes of pomelo juice and different pomelo wines
注：同行肩不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
理化指标 PJ组 PJ0组 SP组 SC组 CF组pH糖度/°Bx酒精度/%vol残糖量/（g·L-1）5.03±0.02a 13.90±0.00b-65.24±1.06a 4.01±0.01b 20.00±0.00a-65.50±1.10a 3.96±0.04b 7.80±0.00c 10.00a 5.53±0.22b 3.91±0.01b 7.80±0.00c 10.00a 5.37±0.06b 3.95±0.00b 7.80±0.00c 10.00a 5.26±0.50b
2.3 柚子果酒的感官评价结果
柚子果酒的感官评价结果见图2。
图2 柚子果酒的感官评价结果
Fig.2 Sensory evaluation results of pomelo wines
由图2可知，在色泽和透明度方面，3组柚子果酒无明显差异。在香味方面，CF组和SC组优于SP组。在滋味和典型性方面，CF组明显优于其他两组。其中SP组香味较淡但果味更浓郁，SC组的酒味最重，CF组果味与酒味协调，不仅有柚子的独特果味，还有烘焙的甜香，香气和谐纯正，口感回味绵长，风格典型。
2.4 柚子果酒有机酸含量测定结果
果酒中有机酸的组成及含量有助于形成果酒的特征风格[19]，因此，对柚子果酒的有机酸含量进行检测，结果见表3。由表3可知，柚子果汁发酵后有机酸总含量均显著降低（P＜0.05），说明发酵具有较好的降酸效果，这与于玲等[20]在发酵石榴汁中有机酸的变化情况一致。对比3种柚子果酒有机酸含量发现，SP组中酒石酸和苹果酸含量显著低于SC组和CF组（P＜0.05），而SC组中乳酸、柠檬酸和琥珀酸含量显著低于SP组（P＜0.05），3个果酒中草酸和乙酸含量无显著差异（P＞0.05），说明非酿酒酵母有利于酒石酸和苹果酸的转化，酿酒酵母有利于乳酸、柠檬酸和琥珀酸的转化，混合酵母发酵可结合二者的特点。其中柠檬酸和苹果酸可产生令人愉悦的、兼有清凉感的酸味，但过多可能产生不愉快的味道和苦涩的口感；乳酸可提供柔和的口感；草酸和乙酸有较强刺激性气味；而酒石酸具有强烈的葡萄和柠檬风味，酸感比柠檬酸强且有较弱涩味；琥珀酸兼有海扇和豆酱类风味[19]。发酵导致的有机酸变化使果酒具有复杂而协调的口感与风味。
表3 柚子果汁与不同柚子果酒中有机酸含量的测定结果
Table 3 Determination results of organic acids contents of pomelo juice and different pomelo wines mg/L
有机酸 PJ组 SP组 SC组 CF组草酸酒石酸苹果酸乳酸乙酸柠檬酸琥珀酸总量328.45±20.99a 28.79±1.70d 539.01±16.50a 910.09±73.18a 90.62±5.37a 3 228.56±127.95a 888.76±31.64a 6 014.27±174.00a 236.01±8.40b 140.16±14.63c 159.20±34.04c 277.98±44.74b 58.39±7.29b 1 746.18±272.72b 550.58±67.89b 3 168.50±312.09b 238.03±12.31b 186.66±14.01a 262.98±27.23b 199.09±11.95c 53.74±3.84b 760.77±35.64c 320.18±39.79c 2 021.44±83.58c 240.27±5.17b 163.94±8.84b 294.96±59.50b 253.58±34.18b 51.22±5.08b 804.41±89.44c 486.09±9.28b 2 294.47±158.04c
2.5 柚子果酒中挥发性风味成分测定结果及分析
2.5.1 挥发性风味成分测定结果
采用HS-SPME-GC-MS联用技术对柚子果汁及3组果酒的香气成分进行检测与分析，结果见表4。由表4可知，从PJ、SP、SC和CF组分别检测出35种、33种、44种、44种挥发性风味成分，包括酯类、醇类、醛类、酮类、酸类、烯类以及其他类，其中酯类、醇类和醛类是柚子果酒中的主要香气成分。SC和CF组酯类物质种类最多，分别为18种、20种，PJ组和SP组醇类物质种类最多，分别为16种、9种。3组果酒的酯类化合物种类均多于柚子果汁，酯类物质能赋予果酒果香、花香和烘烤香[21]。结果表明，酵母菌发酵有利于果酒酯类化合物的生成，而共同发酵对该过程的促进作用更强。
表4 柚子果汁与柚子果酒中挥发性风味成分GC-MS分析结果
Table 4 Results of volatile flavor components in pomelo juice and wines analyzed by GC-MS
编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34化合物香气描述[25] 阈值/（μg·L-1）含量/（μg·L-1）PJ组 SP组 SC组 CF组OAV PJ组 SP组 SC组 CF组酯类乙酸异戊酯丁酸异丁酯丁酸丁酯己酸乙酯辛酸乙酯2-糠酸乙酯癸酸乙酯丁二酸二乙酯9-癸烯酸乙酯十一酸乙酯山俞酸乙酯乙酸苯乙酯月桂酸乙酯十三酸乙酯十四酸乙酯（Z）-十七碳-9-烯酸乙酯13-甲基十四酸乙酯9-十五烯酸乙酯棕榈酸乙酯9-十六烯酸乙酯丁内酯丁酸-2-戊酯L-乳酸乙酯对苯二甲酸二丁酯己酸-2-羟乙酯2,4-己二烯酸乙酯3-羟基己酸乙酯乙酸叶醇酯总量醇类3-甲基丁醇1-丁醇3-戊烯醇1-戊醇2-壬醇2-戊烯醇-- - - - - - - - - - - - --- -2[26]--- -9.10±2.83c 14.60±2.83c 20[27]670[27]580[28]-- - - - - - - - - - - - -0.01 0.03 118.05-4.97 0.21 0.33-0.10 0.06 0.62--2.50±0.82c香蕉、梨杏、香蕉、菠萝香蕉、菠萝、樱桃苹果、香蕉、菠萝杏、香蕉、梨烧焦油脂、坚果果味果味、油脂奶油、轻微果味-玫瑰、蜂蜜果味、花香-紫罗兰200[27]200[27]100[29]100[30]-1 800[28]500[31]-1 000[32]＜0.01 0.05 0.07-0.08 212.31-6.11 0.49 1.04-0.67 0.20 1.82 0.37-0.14 0.04-0.59-- - - - - - - - - --- - - - - - - - - - - - - - -236.11±61.58b-99.38±28.99b 137.66±61.82b 194.05±50.99b-19.60±4.26b 11.08±1.98b 61.97±12.04b-8.38±0.56b 94.32±13.74b 33.17±6.74a 10.20±3.19b 77.21±19.37b 20.56±9.21b 7.60±2.49b 8.80±1.59b 35.22±14.23b 23.73±9.46b 19.67±6.09 424.61±103.54a 72.28±29.78 122.17±36.88a 329.29±87.47a 604.11±134.09a 29.60±6.91 133.19±27.57a 39.18±5.93a 182.49±20.53a 36.89±9.15 33.78±4.90a 248.20±88.58a 22.15±2.78b 35.55±5.43a 592.64±106.67a 90.49±10.13a 280.09±61.15a 91.29±13.86a 189.24±23.10a 184.45±16.11a-- --- --- --- -0.02 1 500[27]0.13 4.30±3.10 6.89±2.94 55.85±7.49 23.87±4.19 13.39±3.52-- --- - - - - - - - - - - - - - - -＜0.01-- - - - - -2.05±1.58 1.72±0.88 6.27±2.21d—— - - - - - -奶油、香草-油脂、焦糖杏、香蕉、菠萝果味、黄油-果味菠萝葡萄、柑橘橙子、黄瓜、玫瑰14 000[32]128.00±9.70c 1 098.71±48.52b 3 741.67±325.53a 4.64±2.99b 38.33±8.02 10.29±2.32a 3.88±1.13b 8.66±1.27 23.73±2.44b 447.39±93.48a-5.17±2.41b-- --- --- - - - --- - - - - - - - - - - - --- - - - - - - - - - --- - - - - - - - - - --- -2 177.15±93.42a-43.77±5.24a 2 300.80±252.91a ＜0.01＜0.01--香蕉、蜂蜜香蕉、威士忌绿色蔬菜果味黄瓜绿色150 000[26]-306 000[27]58[27]-＜0.01-＜0.01 0.15--- - - - - - - - - ——-
续表
编号化合物含量/（μg·L-1）PJ组 SP组 SC组 CF组香气描述[25] 阈值/（μg·L-1）OAV PJ组 SP组 SC组 CF组35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 78.38±12.61a 129.30±12.41a 54.32±14.13 24.13±3.19a-1.25±0.12 2.82±0.07b 2.19±0.21c 4.51±0.45-7.74±0.72 10.44±1.42d 404.61±23.29d 29.17±3.68c 9.51±3.16c-26.84±3.97a 52.54±13.35b-66.53±18.49a 8.03±2.69b 17.93±4.50d 6.55±1.04d 1-己醇反式-3-己烯醇2-己烯醇2-乙基己醇2,3-丁二醇环庚醇芳樟醇1-辛醇2-十四醇香茅醇马利醇苯乙醇总量酮类2,2-二甲基-3-庚酮3-羟基-2-丁酮二氢-2-甲基-3（2H）-噻吩酮2-辛烯-4-酮1-（2-呋喃基）乙酮异佛尔酮苯乙酮圆柚酮8-羟基泽兰酮总量醛类己醛2-己烯醛壬醛糠醛癸醛安息香醛5-甲基-2-糠醛2,4-二甲基苯甲醛总量酸类A-氧-2-呋喃乙酸醋酸己酸辛酸3-甲基丁酸总量烯类D-柠檬烯苯乙烯总量63.76±8.46b 27.70±0.61b＜0.01 0.02＜0.01 0.07————22.10±5.35c ＜0.01--＜0.01 0.02-＜0.01＜0.01-2.66＜0.01—— -苹果皮苹果、草莓草药、蔬菜柑橘、花香、油脂果味、油脂-柑橘、花香、木质苔藓、坚果、蘑菇椰子玫瑰、柑橘-- -37.98±5.83c 683.15±103.15c 9.62±0.60b-16.28±0.62b-1 463.53±28.85b 3 756.94±55.03b 306.34±9.42a-304.16±15.78c 42.60±3.34a-118.74±0.53a-3 234.94±750.06a 6 399.05±708.21a玫瑰、蜂蜜8 000[29]400[30]400[31]5 000[29]50 000[27]-25[27]900[29]-100[31]-1 000[31]0.01 0.32 0.14＜0.01＜0.01-0.11＜0.01-＜0.01-0.01 0.04 0.01-0.16-1.46＜0.01-12.17 0.05-1.19-3.23 47 48 49 50 51 52 53 54 55-- -7.31±2.13————- -23.16±5.83b 37.87±3.69 58.86±8.95a 1.65 2.51 4.20 5.42±0.95-4.42±1.12b-- --- - -14[31]15.1[28]-1.77[28]-- - - -8.82±1.93 21.89±4.82a-936.43±61.51a 44.78±12.79 1 019.22±47.91a坚果、烘焙奶油浆果蔬菜、蘑菇坚果、烘焙绿色、木质、柑橘苦杏仁3[31]＜0.01＜0.01-＜0.01 1.47 4.98 7.30-- -11.61±3.67b——-- --- --- - - - - -9.85±1.14d 72.64±5.20c 50.50±0.57a 458.74±169.33b-568.11±160.25b 56 57 58 59 60 61 62 63 11.14±2.74b 10.22±0.19 25.32±4.25b 74.57±25.58b 15.46±1.21d 7.81±1.72b 1.46±0.02c 21.93±7.79c 167.93±22.98b——-- - - --- - - - - - -18.09±2.95c 19.63±6.83c 22.00±3.00c 20.40±3.42a 67.31±11.64a-180.66±17.72b 29.36±10.53b 15.62±7.40c 41.78±9.73b-11.39±1.19b 113.74±32.21b 211.89±35.62b 88.43±2.29a-98.75±0.71a 111.50±9.48a 112.04±2.93a-11.24±4.17b 304.89±63.38a 726.86±53.57a木质、绿色、果味杏仁、果味、蔬菜柑橘、蔬菜、椰子焦糖、木质、坚果油脂、柑橘焦糖、谷物樱桃、杏仁、香草柑橘、蔬菜、椰子4.5[28]-15[29]14 100[32]1[31]1.96＜0.01 41.78 19.65-6.58＜0.01 112.04 2 000[28]2.48-1.69 0.01 15.46＜0.01 1.31＜0.01 20.40 0.03 64 65 66 67 68—— --- --- --- -8.93±1.73b 4.19±0.53c 78.85±5.71a-47.37±2.44a-- - - -0.11——过熟的水果奶酪、果味奶酪、面包奶酪、发酵、浆果200 000[31]420[30]500[27]350[28]＜0.01 0.01＜0.01＜0.01＜0.01 0.06 0.09 0.28＜0.01 0.07 0.09 0.06 13.12±2.23d 23.62±7.10b 3.11±0.82c 27.27±6.64b 44.61±6.05a 98.61±6.05a 197.22±12.11b 18.78±3.88b 237.14±14.35a 29.77±2.94b 44.00±10.61a 19.63±4.56b 349.31±17.70a 126.22±6.81c 69 70 28.30±5.11b 11.24±0.70b 39.54±5.35b 79.72±16.18a-79.72±16.18a 27.71±6.28b-27.71±6.28c-38.59±1.34a 38.59±1.34b柠檬、橙子花香15[31]-1.89-5.31-1.85--- - -
续表
编号化合物含量/（μg·L-1）PJ组 SP组 SC组 CF组香气描述[25] 阈值/（μg·L-1）OAV PJ组 SP组 SC组 CF组71 72 73 74其他类2-甲氧基-4-乙烯基苯酚2,4-二叔丁基苯酚2-乙酰基呋喃萘总量7.59±1.04c 61.51±8.87c--69.10±7.84c-36.21±6.82d--36.21±6.82d 34.62±1.59b 134.57±23.34b 19.04±2.21b 10.64±3.15b 198.87±22.18b 70.04±10.23a 507.80±28.72a 70.04±10.23a 47.17±11.70a 695.06±9.00a丁香-坚果、烘焙-380[27]200[27]-0.02 0.31---0.18--0.09 0.67--0.18 2.54--
OAV被广泛用于评估挥发性风味成分对酒品香气的影响，其值越大，表明香气成分对酒体香味的贡献越大[22]。OAV≥1的香气物质可以被人类嗅觉感知，而0.1≤OAV＜1的香气物质也可以对果酒风味有辅助性增香作用[16]。在SP组中有6种物质的OAV≥1，分别为芳樟醇、1-（2-呋喃基）乙酮、异佛尔酮、壬醛、癸醛、D-柠檬烯。在SC组中有8种物质的OAV≥1，分别为乙酸异戊酯、丁酸丁酯、苯乙醇、3-羟基-2-丁酮、二氢-2-甲基-3（2H）-噻吩酮、壬醛、癸醛、D-柠檬烯。而在CF组中有12种物质的OAV≥1，分别为乙酸异戊酯、丁酸丁酯、辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、芳樟醇、香茅醇、苯乙醇、3-羟基-2-丁酮、己醛、壬醛、癸醛、2,4-二叔丁基苯酚。CF组有更为丰富的香气成分，这可能是其在感官评分中得分更高的原因。3种果酒中共有的OAV≥1的芳香物质有壬醛和癸醛，表明这2种物质在柚子果酒酿造过程中处于相对稳定状态。混合发酵后，乙酸异戊酯、丁酸丁酯、辛酸乙酯、苯乙醇、3-羟基-2-丁酮等物质的含量增多，酯类物质由氨基酸代谢产生，可以为果酒提供成熟水果的果香和花香[23]。苯乙醇具有香甜的玫瑰花气味，在柚子果酒中较为常见[24]。3-羟基-2-丁酮有较重的奶香味，可以起到辅助增香的作用。结果表明，虽然粟酒裂殖酵母单独发酵时产生风味物质的能力稍弱，但在混菌体系中能发挥较强的协同作用。此外，SP组中含有较高含量[（936.43±61.51）μg/L]的圆柚酮，移兰丽等[6]研究发现，圆柚酮是体现沙田柚蒸馏酒的特征性物质，该物质在混合发酵果酒得到较大程度的保留，为柚子果酒提供了独特的柚香风味。
2.5.2 偏最小二乘法-判别分析
基于挥发性风味成分含量对不同样品进行偏最小二乘法-判别分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA），结果见图3。由图3A可知，该模型的主成分1（principal component 1，PC1）的方差贡献率为58.5%，PC2的方差贡献率为22.2%，累计方差贡献率为80.7%，说明该模型可解释所有原始数据中80.7%的变量。基于香气成分含量，柚子果汁与3组柚子果酒的样本点可以很好的区分开，说明不同果酒与果汁的挥发性物质存在明显差异。由图3B可知，PC1主要体现了己酸-2-羟乙酯、1-己醇、反式-3-己烯醇、柠檬烯等具有果香风味的物质的重要信息，与检测到的大多数酯类物质呈负相关。而PC2与一些具有热带水果香的酯类和浓郁花香的醇类（如丁酸异丁酯、丁酸丁酯、月桂酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇等）以及某些具有消极气味的酸类（如醋酸）呈高度正相关，与3-戊烯醇等呈负相关。PJ组在PC1中得分较高，主体香气为清淡果香；SP组在PC1和PC2中得分均较高，表明辛酸乙酯、1-己醇、柠檬烯和圆柚酮等为SP组的风味做出了贡献。CF组和SC组较为接近，风味主要来源为丁酸异丁酯、丁酸丁酯、月桂酸乙酯等酯类物质。
图3 基于挥发性风味物质含量柚子果汁与柚子果酒的偏最小二乘法-判别分析散点图（A）和载荷图（B）
Fig.3 Scatter plot (A) and load plot (B) of partial least squaresdiscriminant analysis of pomelo juice and wine based on volatile flavor substances contents
2.6 3种果酒中主要挥发性风味物质OAV与感官评分的相关性分析
为探究感官评分与挥发性风味物质的关联性，对3种果酒中主要挥发性风味成分（OAV≥0.1）的OAV与感官评分进行相关性分析，结果见图4。由图4可知，色泽和透明度与挥发性风味成分含量均无显著相关性（P＞0.05）；滋味、典型性得分和总分均与乙酸异戊酯、丁酸丁酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、香茅醇、3-羟基-2-丁酮、壬醛、癸醛、2,4-二叔丁基苯酚呈极显著正相关（P＜0.01），与乙酸苯乙酯、芳樟醇等物质呈显著正相关（P＜0.05）；香味得分与乙酸异戊酯、丁酸丁酯、己酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、癸醛及2,4-二叔丁基苯酚呈显著正相关（P＜0.05），这些物质赋予了果酒苹果、香蕉、菠萝、梨等果香、花香和烘焙香，使得果酒具有丰富饱满且令人愉悦的香气[33]。
图4 柚子果酒中主要挥发性风味成分香气活度值与感官评分的相关性分析结果
Fig.4 Correlation analysis results between aroma activity value of the main volatile flavor compounds in pomelo wine and sensory score
“*”表示相关性显著（P＜0.05），“**”表示相关性极显著（P＜0.01）。
3 结论
本研究对柚子果汁和酿酒酵母单发酵、粟酒裂殖酵母单发酵、酿酒酵母与粟酒裂殖酵母混合发酵制备的3种柚子果酒的理化性质、感官评分、有机酸含量和挥发性风味成分进行对比分析。结果表明，3种发酵方式的发酵动力和3种柚子果酒的理化指标均无显著差异（P＞0.05）。感官评价结果显示，混合发酵果酒的滋味和典型性明显优于其他两种果酒。与柚子果汁相比，发酵后果酒有机酸总含量均有所降低，表明发酵具有较好的降酸效果，且混合发酵果酒的有机酸代谢结合了两株菌的特点，具有复杂而协调的口感与风味。此外，不同发酵酒挥发性风味物质的种类和含量存在明显差异，混合发酵柚子果酒中香气成分的种类（44种）和含量（12 295.56 μg/L）均最多。由PLS-DA结果表明，辛酸乙酯、1-己醇、柠檬烯和圆柚酮为粟酒裂殖酵母单发酵柚子果酒的风味做出了贡献；而酿酒酵母单发酵和混合发酵果酒风味主要来源为丁酸异丁酯、丁酸丁酯、月桂酸乙酯等酯类物质。柚子果酒中主要挥发性风味物质OAV与感官评分的相关性分析结果表明，挥发性风味物质含量与果酒的色泽和透明度无显著相关性（P＞0.05），而乙酸异戊酯、丁酸丁酯、己酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、癸醛等物质与果酒的香味、滋味和典型性均呈正相关，这些物质的高丰度赋予混合发酵果酒柑橘、香蕉、菠萝等热带水果香、花香和烘焙香。综上，粟酒裂殖酵母具有较强的发酵能力，且与酿酒酵母混合发酵能增加柚子果酒挥发性风味成分的生成，赋予柚子果酒独特饱满的柚香风味，使其兼具外观、香味、口感等多方面的优点，为柚子酒产品的工艺开发提供方法借鉴。
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