国公酒也称史国公浸酒，该酒作为一种中药酒，是明、清朝代的宫廷秘方，由数十种中药经科学浸泡配制而成，其气味浓郁芳香，酒味醇厚甘美，常饮有益健康，实为中国知名之良酒[1]。国公酒为骨伤科腰腿痛内科痹证类非处方药药品，主要用来散风祛湿，舒筋活络。用于经络不和、风寒湿痹引起的手足麻木、半身不遂、口眼歪斜、腰腿酸痛、下肢痿软、行步无力[2]。由于国公酒中添加有多种药材，一些药材成分闻起来具有较强的刺激性气味，喝起来也不会太有食欲，让人产生一种厌恶感，因此，一些不法生产厂家在实际生产过程中可能会掺入一些香精成分用于改善药酒的口感和气味，从而提高患者的服药率。
一般来说，药酒辅料中添加香精为可食用香精，使用时必须符合《食品用香料、香精使用原则》相关规定，确保香精不会超过安全限量。尽管香精在医药领域中广泛使用，但如果滥用，一些香精（如香兰素、乙基香兰素等）可能会对人体健康带来一定风险。由于香精的味道比较浓郁，如果长时间接触或误食后，容易对肝脏部位造成刺激，也会增加肝脏负担，当肝脏超负荷工作时，会出现肝脏损伤引起呕吐[3-7]。如果人体自身属于易过敏体质，盲目接触香精后，有可能会使局部的毛细血管通透性改变，引起皮肤红肿，部分人群会伴有疼痛感和瘙痒感。掺伪香精成分多为人体难以消化的化学物质，长期过量食用，势必会对人体造成伤害。同时，一些研究表明，某些香精可能会对脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）产生影响，导致细胞突变，甚至致癌[8]。此外，某些香精可能会对神经系统、肝脏和肾脏等产生影响[9-14]。目前对于酒中香精成分研究主要集中在酒本身香气成分，而对于掺伪香精检测研究甚少。因此，为了更好地保障药酒的质量安全，对药酒中添加香精含量进行检测是有必要的。
目前，对于香精的报道较多，如食品中香精检测以及香精中污染物检测[15-17]；化妆品中香精香料的应用及含量测定[18-19]；香精在香烟中的应用[20-22]，而针对药酒中香精成分检测方法较为鲜见。本研究拟建立一种气相色谱（gas chromatography，GC）法同时测定国公酒中香兰素、乙基香兰素、2-乙酰基吡啶、2-丙酰基吡啶、2-乙酰基吡嗪、2-乙酰基-1-吡咯啉、5,6,7,8-四氢喹喔啉共7种掺伪香精成分的分析方法，通过所建方法对市面上出售的国公酒中7种掺伪香精成分进行测定，从而为保障国公酒的用药安全性以及防止香精在药酒中的滥用提供一定技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
国公酒（酒精度42%vol）：市售，均为同一厂家；香兰素标准品、乙基香兰素标准品、2-乙酰基吡啶标准品：上海安谱实验科技股份有限公司；2-丙酰基吡啶标准品2-乙酰基吡嗪标准品、2-乙酰基-1-吡咯啉标准品、5,6,7,8-四氢喹喔啉：坛墨质检标准物质中心；乙酸乙酯、丙酮、氯化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；实验用水均为二级纯水。
1.2 仪器与设备
7890A气相色谱仪[配备氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）]：美国Agilent公司；BS224S电子分析天平：德国Sartorius公司；TGL-20M台式高速冷冻离心机：杭州川一实验仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 混合标准溶液的配制
分别准确移取香兰素、乙基香兰素、2-乙酰基吡啶、2-丙酰基吡啶、2-乙酰基吡嗪、2-乙酰基-1-吡咯啉、5,6,7,8-四氢喹喔啉标准品各1.0 mL于10 mL容量瓶中，丙酮溶解并定容，得到100 μg/mL混合标准储备溶液，涡旋混匀，再分别移取混合标准储备溶液于10 mL容量瓶中，丙酮溶解并定容，涡旋混匀，得到质量浓度分别为0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L的系列混合标准工作溶液。
1.3.2 样品前处理
称取试样5.0 g于50 mL塑料离心管中，加入5 mL蒸馏水，加入3 g氯化钠固体，再加入10 mL乙酸乙酯提取30 min，4 ℃低温离心（8 000 r/min、5 min），取上层乙酸乙酯层，残渣重复提取一次，合并上清液，40 ℃条件下氮吹至近干，加1.0 mL丙酮溶解，过0.45 μm滤膜，装进样小瓶，待GC分析[23-25]。
1.3.3 色谱条件
气相色谱条件：InertCap 624毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度250 ℃，分流比5∶1，进样体积1.0 μL。升温程序为初始温度60 ℃，保持1 min；以20 ℃/min升温至180 ℃，保持2 min；以20 ℃/min升温至260 ℃，保持8 min；FID温度280 ℃。
定性定量方法：在上述色谱条件下，根据目标物标准品色谱图保留时间定性，以各目标物质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，分别绘制标准工作曲线，按照标准曲线回归方程计算样品中各目标物含量。
1.3.4 提取条件优化[26-27]
设置基础条件为称样量5.0 g，加入5.0 mL蒸馏水，考察不同提取溶剂（乙醚、乙酸乙酯、乙腈、正己烷、石油醚）、不同提取溶剂体积（5 mL、10 mL、20 mL）、不同氯化钠加入量（1.0 g、2.0 g、3.0 g、4.0 g、5.0 g）对香精成分加标回收率的影响。
1.3.5 色谱柱优化
比较DB-5毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、HP-1701毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、InertCap 624毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、HP-INNOWAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）4种常见色谱柱分离效果。
1.3.6 数据分析
数据处理及绘图采用Excel 2010软件完成。
2 结果与分析
2.1 提取条件优化
2.1.1 提取溶剂的选择
7种香精成分（香兰素、乙基香兰素、2-乙酰基吡啶、2-丙酰基吡啶、2-乙酰基吡嗪、2-乙酰基-1-吡咯啉、5,6,7,8-四氢喹喔啉）均属于有机化合物，因此，根据相似相容原理，这些掺伪香精成分在有机试剂中均具有一定溶解性，实验室常见可供选择的提取试剂有乙醚、乙酸乙酯、乙腈、正己烷、石油醚等。在相同加标水平（1.0 mg/kg）下，考察5种提取溶剂对7种香精成分加标回收率的影响，结果见图1。
图1 不同提取溶剂对7种掺伪香精成分加标回收率的影响
Fig.1 Effect of different extraction solvents on the adding standard recovery rates of 7 adulterated essence components
由图1可知，在相同加标水平下，采用乙酸乙酯作为提取溶剂，7种香精成分的加标回收率均处于90%以上，采用正己烷、石油醚作为提取溶剂，7种香精成分的加标回收率基本处于80%以下，采用乙腈与乙醚作为提取溶剂，7种香精成分的回收率处于80%～90%范围内，故选择乙酸乙酯作为本试验样品的提取溶剂。
2.1.2 提取溶剂体积
提取溶剂体积的选择需同时考虑到实验的取样量及检测灵敏度。当提取溶剂体积较小时，可增加组分在其中的浓度，从而提高检测灵敏度，然而，当提取溶剂体积过小，样品很难被提取完全，回收率难以达到要求，影响结果的准确性。本实验以2.1.1中优化的结果作为提取溶剂，考察不同体积提取溶剂对7种香精成分检测灵敏度以及加标回收率的影响，结果见图2。
图2 提取溶剂体积对7种掺伪香精成分加标回收率的影响
Fig.2 Effect of extraction solvent volume on the adding standard recovery rates of 7 adulterated essence components
由图2可知，当提取溶剂体积为5 mL时，2-乙酰基-1-吡咯啉、5,6,7,8-四氢喹喔啉这两种香精成分的加标回收率均低于80%。当提取溶剂体积为10 mL与20 mL时，7种香精成分的回收率均在90%以上。同时考虑到取样量对检测灵敏度的影响以及经济成本等，综合上述因素，最终设定提取溶剂的体积为10 mL。
2.1.3 氯化钠添加量的影响
氯化钠的加入可减少7种香精成分在试样中的溶解程度。在其他条件最优情况下，考察氯化钠加入量对7种香精成分加标回收率的影响，结果见图3。
图3 氯化钠添加量对7种掺伪香精成分加标回收率的影响
Fig.3 Effect of sodium chloride addition on the adding standard recovery rates of 7 adulterated essence components
由图3可知，当氯化钠添加量为1.0～5.0 g时，不同目标物响应强度随氯化钠添加量的增加而增大。这是由于盐析效应增加了溶液的离子强度及在有机相中的分配系数，降低了目标物在水溶液中的溶解度，导致响应强度及检测灵敏度提高。当氯化钠添加量达到3.0 g时，继续增加氯化钠，则试样溶液中会析出氯化钠固体，同时7种香精成分的回收率基本不再上升，因此，选择加入3g氯化钠较为适宜。
2.2 色谱柱的选择
选用4种常见的色谱柱DB-5毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、HP-1701毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、InertCap 624毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、HP-INNOWAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）进行试验，考察不同色谱柱对7种掺伪香精成分分离效果的影响。结果表明，DB-5色谱柱与HP-INNOWAX色谱柱分离对于2-乙酰基吡嗪与2-丙酰基吡啶色谱峰分离效果较差，而HP-1701色谱柱则整体色谱峰拖尾现象较严重，使用InertCap 624色谱柱依据1.3.2色谱条件下的混合标准溶液色谱图见图4。由图4可知，使用InertCap 624色谱柱条件下7种掺伪香精成分分离效果佳，7种成分可以完全分开，因此，选择InertCap 624色谱柱进行测定。
图4 7种香精成分混合标准溶液气相色谱图（InertCap 624色谱柱）
Fig.4 Gas chromatogram of 7 kinds of essence components mixed standards (InertCap 624 chromatogram column)
1为2-乙酰基吡啶；2为2-丙酰基吡啶；3为2-乙酰基吡嗪；4为香兰素；5为乙基香兰素；6为2-乙酰基-1-吡咯啉；7为5,6,7,8-四氢喹喔啉。
2.3 线性关系及检出限
取已配制好的7种香精成分混合标准溶液置于进样小瓶中，供GC分析，分别以7种香精成分标准溶液质量浓度（X）为横坐标，其峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，依据1.3.2方法处理后进行GC分析，将3倍信噪比（S/N）作为检出限，选择一定合适浓度的7种香精成分混合标准溶液加入到样品中，经计算得7种香精成分混合标准溶液的检出限，7种香精成分的标准曲线线性方程、线性范围、检出限及定量限结果见表1。
表1 7种香精成分标准曲线回归方程、线性关系、检出限及定量限
Table 1 Standard curve regression equation, linear range, correlation coefficient, detection limit and quantitative limit of 7 essence components
组分 标准曲线线性方程 线性范围/（mg·L-1） 相关系数（R2） 检出限/（mg·L-1） 定量限/（mg·L-1）香兰素乙基香兰素2-乙酰基吡啶2-丙酰基吡啶2-乙酰基吡嗪2-乙酰基-1-吡咯啉5,6,7,8-四氢喹喔啉Y=1567.1X+0.800 9 Y=1678.9X+1.213 1 Y=1745.4X+1.148 9 Y=2401.1X+0.897 9 Y=2311.1X+1.911 8 Y=3012.5X+1.027 8 Y=3028.3X+1.990 8 0.5～10 0.5～10 0.5～10 0.5～10 0.5～10 0.5～10 0.5～10 0.999 4 0.999 5 0.999 8 0.999 1 0.999 4 0.999 2 0.999 8 0.9 0.8 0.6 0.6 0.6 0.5 0.5 2.0 1.6 1.5 1.5 1.5 1.0 1.0
由表1可知，7种香精组分在质量浓度0.5～10 mg/L范围内线性关系良好，相关系数R2均高于0.999。方法检出限为0.5～0.9 mg/L，定量限为1.0～2.0 mg/L。
2.4 精密度与加标回收试验
取未检出7种香精成分的试样，分别加入一定量混合标准溶液，设置低、中、高三种不同水平的加标量进行试验，按照1.3.3步骤处理，进行方法的精密度及加标回收率实验，经6次平行测定，计算方法的加标回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表2。由表2可知，7种掺伪香精成分加标回收率在82.0%～98.1%范围内，精密度试验结果RSD均低于10%，结果表明该方法具有准确性较好，重现性好等特点。
表2 精密度和加标回收试验结果（n=6）
Table 2 Results of precision and adding standard recovery tests (n=6)
组分 加标量/（mg·L-1）平均测定值/（mg·L-1）回收率/%RSD/%香兰素乙基香兰素2-乙酰基吡啶2-丙酰基吡啶2-乙酰基吡嗪2-乙酰基-1-吡咯啉5,6,7,8-四氢喹喔啉1.0 2.0 10 1.0 2.0 10 1.0 2.0 10 1.0 2.0 10 1.0 2.0 10 1.0 2.0 10 1.0 2.0 10 0.89 1.87 9.03 0.90 1.82 8.94 0.96 1.93 9.81 0.95 1.92 9.50 0.82 1.89 9.10 0.84 1.81 8.94 0.83 1.80 8.83 89.0 93.5 90.3 90.0 91.0 89.4 96.0 96.5 98.1 95.0 96.0 95.0 82.0 94.5 91.0 84.0 90.5 89.4 83.0 90.0 88.3 8.34 4.56 8.55 8.22 2.63 6.39 5.84 4.32 2.06 5.43 2.43 4.35 9.35 4.68 4.69 6.82 4.32 4.46 7.88 3.82 3.87
2.5 样品测定
按照上文所述步骤随机网购10批次不同生产日期同一生产厂家的国公酒，依据1.3.2方法处理后进行试样检测，结果见表3。由表3可知，共有4批次产品中检出了掺伪香精成分，其中3批次产品中检出了香兰素，1批次产品检出乙基香兰素，但含量均较低，处于检出限附近，其他5种香精成分在国公酒中均未检出。
表3 市售国公酒样品7种香精检测结果
Table 3 Determination results of 7 essence components in commercial Guogong liquor samples mg/L
注：“-”表示未检出。
样品编号 香兰素 乙基香兰素2-乙酰基吡啶2-丙酰基吡啶2-乙酰基吡嗪2-乙酰基-1-吡咯啉5,6,7,8-四氢喹喔啉1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1.2-- - --- -1.5 1.2 1.4-- --- - - - --- - - - - - - - --- - - - - - - - --- - - - - - - - --- - - - - - - - --- - - - - - - - -
3 结论
本研究通过考察提取溶剂、氯化钠固体加入量、色谱柱型号、以及分流比等参数条件，建立了气相色谱法同时测定国公酒中7种掺伪香精成分的分析方法。采用10 mL乙酸乙酯作为提取溶剂，氯化钠添加量为3.0 g，通过InertCap 624毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）分离，分流比设为5∶1，7种掺伪香精成分可以实现完全分离。通过方法学考察，结果表明标准系列溶液曲线线性关系良好，相关系数R2均大于0.999。在1.0～10 mg/L范围内，加标回收率为82.0%～98.1%，精密度实验结果的相对标准偏差（n=6）均低于10%。同时对网购国公酒样品进行了检测。结果表明，该方法具有简单、快速及重现性好等特点，可应用于国公酒中香精成分的快速定量检测，为保障国公酒的质量安全提供一定的技术支持。
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