沃柑是由以色列太高将“坦普尔”橘橙与“丹西红橘”杂交得到的新品种柑橘，属于柑橘中的一种[1]。2012年，广西武鸣双桥镇引进沃柑种植，与引进的茂谷柑相比，广西沃柑具有个头大、产量高、口感脆甜、破碎度高、含糖量高、酸度低等优良特性，深受消费者青睐。广西沃柑种植面积已超过11.33万hm2，产值高达100亿元。但国内尚未形成深加工综合利用沃柑皮的产业链，在加工过程中会产生大量的废弃果皮通常被丢弃或填埋，给生态环境造成极大压力[2]。研究发现，商业柑橘皮中果胶含量为30%～35%，可通过利用沃柑皮提取果胶增加沃柑整体资源利用价值，减少环境污染，同时为果胶生产提供新的原料基础。尽管沃柑皮果胶具有很高的潜力，但对其提取工艺和理化特性的研究仍然相对较少。
果胶作为一种含有半乳糖醛酸的天然多糖聚合物，以原果胶、果胶、果胶酸的形式大量分布在植物的根、茎、叶及果实中，是高等植物细胞壁结构组成的重要成分[3-4]。不同植物组织利用常规提取方法提取的果胶含量由高到低依次为柑橘、甜菜、香蕉、仙人果、山楂、苹果和猕猴桃[5]。杨宇华等[3]采用超声法辅助乙醇提取沃柑皮果胶，但并没有对果胶的理化特性进行进一步的研究。而就加工性能而言，果胶在食品工业中广泛用作乳化剂、增稠剂和稳定剂在果酱和果冻等食品中，添加果胶可以增加其保水能力，增加黏度，提高凝胶强度[6-7]。
高温和酸性环境促进不溶性原果胶的溶解，提高果胶得率，可以通过硝酸、盐酸或硫酸等无机酸提取等方法提取[8]。不同种类酸提取的柑橘果胶得率差异显著，其中磷酸的得率（10.82%）最低，硫酸的得率（11.97%）次之，硝酸的得率（12.65%）稍大，但其果胶颜色较暗黄[9]。张军等[10]采用盐酸法和磷酸氢二钠法比较甘薯渣果胶提取效果，结果发现采用盐酸提取果胶得率高达22.80%，而采用磷酸氢二钠提取果胶得率为21.10%，盐酸的提取效果更好。从实际制造的成本和效率的角度来看，酸提取果胶的主要优点是果胶产量高，提取时间短，因此酸提取和醇沉淀通常用于在商业基础上提取果胶[11]。提取过程中，果胶产量和质量易受提取pH值、提取温度、提取时间和比等因素的影响。本研究采用酸法提取沃柑果胶，并以果胶得率为指标，使用单因素响应面法进一步优化提取参数，随后探讨从沃柑皮中提取的果胶的理化性质的影响。旨在为沃柑副产物的高值化综合利用提供理论依据，拓展酸法在果胶高效提取中的应用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜沃柑（七八分熟）：南宁市武鸣区双桥镇市售；体积分数95%乙醇、盐酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；D-半乳糖醛酸标准品（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
S220型pH计：梅勒特-托利多（中国）有限公司；SUB Aqua Pro型数显恒温水浴锅：德国海蒂诗科学仪器公司；DHG-9240型电热恒温鼓风干燥箱：上海鸿都电子科技有限公司；SHZ-11型循环水真空泵：上海贤德实验仪器有限公司；FD1007N型分析天平：上海精密科学仪器厂；TG16-WS高速离心机：湖南湘立科学仪器仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 沃柑皮果胶提取
沃柑预处理：取新鲜沃柑剥皮放入清水漂洗3次，沥干水分后浸没于沸水中漂烫灭酶10 min，随后取出清水冲洗后放入烘箱干燥至质量恒定。取出干燥后的沃柑果皮用粉碎机粉碎，再过60目筛得到沃柑皮粉末，备用。
果胶的提取：参考MOORTHY I G等[12-13]的试验略微修改。称取1.000 g预处理样品（沃柑皮粉末）加入一定体积的蒸馏水和稀盐酸，将pH值调至酸性，水浴加热使之充分发生水解反应。随后置于12 000 r/min离心机中离心20 min，取上清液，加入2倍体积的体积分数95%乙醇来沉淀充分混匀，静置1 h。用水循环真空泵抽滤，收集滤纸上的粗果胶并置于55 ℃恒温干燥箱中烘干至质量恒定获得干果胶。
1.3.2 果胶得率的计算
果胶得率的计算公式如下：
1.3.3 单因素试验设计
精确称取3份沃柑皮粉末，每份1.000 0 g，按照1.3.1中的果胶提取方法分别考察液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）（mL∶g）、提取pH值（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0）、提取温度（60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃）、提取时间（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min）对沃柑皮果胶得率的影响。
1.3.4 响应面试验设计
基于单因素试验的结果，以果胶得率（Y）为响应值，以液料比（A）、提取pH（B）、提取温度（C）和提取时间（D）为主要影响因素，使用Design-Expert 13软件进行4因素3水平的Box-Behnken试验，并优化了通过酸提取法从沃柑皮中提取果胶的传统工艺。Box-Behnken试验因素与水平见表1。
表1 果胶提取条件优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for extraction conditions optimization of pectin
水平 A 液料比（mL∶g） B 提取pH C 提取温度/℃ D 提取时间/min-1 0 1 30∶1 40∶1 50∶1 1.0 1.5 2.0 70 80 90 60 90 120
1.3.5 沃柑果胶理化性质指标的测定
果胶水分含量：根据GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中的直接干燥法来测定；果胶酸不溶灰分：根据GB 25533—2010《食品安全国家标准食品添加剂果胶》[15]的方法进行测定。
1.3.6 沃柑果胶酯化度的测定
在李晓娇等[16]的方法上稍加改进。精确称取0.10 g果胶溶解于100 mL纯净蒸馏水中。加入2滴酚酞指示剂，使用0.10 mol/LNaOH溶液进行标定。当溶液变成粉色，并且颜色保持1 min不变时，记录NaOH溶液的消耗量（V1，mL），作为初始滴定度。然后添加2.5 mL浓度为3.00 mol/L的NaOH溶液，混合均匀，并在5 min后加入2.5 mL浓度为3.00 mol/L的HCl溶液，振荡直到溶液不再呈现粉色。最后，再加入2滴酚酞指示剂，用0.10 mol/L的NaOH溶液滴定至溶液再次变成粉色，并保持1 min不变色，记录NaOH溶液的消耗量（V2，mL）。沃柑果胶的酯化度计算公式如下：
1.3.7 沃柑果胶半乳糖醛酸含量的测定
D-半乳糖醛酸标准曲线制备：参考让凤菊等[17]的方法并稍加改进，将D-半乳糖醛酸溶液稀释为10～90 μg/mL的9个不同梯度质量浓度的标准溶液。随后依次取2 mL不同梯度浓度的半乳糖醛酸的标准溶液加入50 mL试管中，再加入12 mL浓硫酸，100 ℃加热10 min后降至室温，分别加入1 mL 0.15%咔唑溶液，室温下避光静置30 min，以蒸馏水做空白试验。在波长530 nm处测定其吸光度值。以吸光度值作为纵坐标（y），半乳糖醛酸含量（x）为横坐标绘制标准曲线，所得回归方程为：y=0.059x+0.004 3，相关系数R2=0.993 7。根据标准曲线回归方程计算样品中果胶半乳糖醛酸的含量。
1.3.8 数据处理
所有的试验都做3次平行，结果用“平均值±标准偏差”来表示。试验得到的数据其响应面分析和试验数据图表的绘制用Origin 2021和Design-Expert 13软件来进行。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果分析
2.1.1 液料比对果胶得率的影响
液料比对沃柑皮果胶得率的影响结果见图1。
图1 液料比对沃柑皮果胶得率的影响
Fig.1 Effect of liquid-material ratio on pectin yield of Orah peel
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1可知，液料比在10∶1～40∶1（mL∶g）之间，沃柑果胶得率随着液料比的增大呈显著上升趋势（P＜0.05），液料比在40∶1（mL∶g）时，果胶得率最高，为21.53%，这主要是沃柑粉末与酸充分接触，使果胶充分的扩散出来。液料比超过40∶1（mL∶g）时，得率下降，可能是由于溶解出来的果胶量逐渐达到饱和，过量的酸将原果胶转化为水溶性果胶而分解[18]；料液比过小时，果胶没有完全溶解于提取液中，物料粘性较大、在抽掉滤液取果胶时较困难，残留增加，使果胶提取不完全，就会导致得率低[19]。因此，确定最佳提取液料比为40∶1（mL∶g）。
2.1.2 提取液pH对果胶得率的影响
液料比对沃柑皮果胶得率的影响结果见图2。
图2 提取pH对沃柑皮果胶得率的影响
Fig.2 Effect of extraction pH on pectin yield of Orah peel
由图2可知，提取pH值在1.0～1.5之间果胶得率呈现上升趋势，提取pH值为1.5时，果胶提取效果最好，最大得率为22.17%，pH＞1.5时，果胶得率显著下降（P＜0.05）。在酸性水解过程中，果胶通过消除水分子从纤维素中分离出来[20]。因此，当加入酸时，萃取系统中会产生更多的H+。H+越多越能将果胶从原果胶中分离出来并溶于水，可能是强酸的使用有利于沃柑皮中不可溶性原果胶转化成可溶性果胶。pH值为1.0酸性过强时会导致水溶性果胶进一步脱酯裂解，从而使得率降低[21]；当提取pH值＞1.5时，果胶得率呈现明显下降趋势，特别是提取pH值为1.5～2.0时，得率呈现下降趋势特别明显，pH值较高时，一方面酸度减小，不能使原果胶完全转化为水溶性果胶，果胶不稳定、开始降解，另一方面果胶物质水解不完全而且容易转变为果胶酯酸，进而影响到果胶的得率[22]。因此，确定最佳提取pH为1.5。
2.1.3 提取温度对果胶得率的影响
温度在果胶的提取中起主要作用，提取温度对沃柑皮果胶得率的影响见图3。由图3可知，提取温度在60～80 ℃之间果胶得率随温度的升高呈上升趋势，提取温度为70～80 ℃之间，果胶得率随温度提高而显著上升（P＜0.05），这是因为温度升高通常会增加目标化合物的扩散系数，同时降低溶剂黏度。因此，温度升高会增加传质速率和溶剂向植物基质中的渗透[23-25]。提取温度＞80 ℃时果胶得率从22.00%缓慢下降至19.03%。当提取温度过低时，水解速度会比较慢并且水解不完全，果胶得率会比较低；温度还会增加溶解度并加速植物组织的软化，并削弱目标化合物与植物基质中其他化合物之间的相互作用，这使得更多的目标化合物能够转移到溶剂中。然而，提取温度过高也可能导致果胶的降解、分解或解聚，果胶产品的均匀性差和果胶微观结构的破坏，尤其是中性侧链[26-28]。综合考虑，选择提取温度80 ℃进行后续试验。
图3 提取温度对沃柑皮果胶得率的影响
Fig.3 Effect of extraction temperature on pectin yield of Orah peel
2.1.4 提取时间对果胶得率的影响
提取时间对沃柑果胶得率的影响结果见图4。由图4可知，随着提取时间从30～90 min范围内的增加，果胶的得率呈现出显著上升的趋势（P＜0.05），当提取时间为30～60 min时，由于提取时间较短，果胶可能未能被完全提取，导致得率较低。提取时间为90 min时，果胶得率最高，为20.13%，可能是沃柑皮粉与提取溶液接触时间很合适，得到充分的反应，促使原果胶溶解。提取时间＞90 min时果胶得率呈下降趋势，可能是由于酸对溶液中果胶作用的时间较长，部分果胶在酸作用下分解，促使部分杂质溶出，从而降低了果胶质量，以至果胶得率降低[28]。综合考虑，选择提取时间90 min进行后续试验。
图4 提取时间对沃柑果胶得率的影响
Fig.4 Effect of extraction time on pectin yield of Orah peel
2.2 响应面试验结果分析
2.2.1 响应面试验结果
基于单因素试验结果的分析，选择对果胶得率影响较大的因素：液料比（A）、提取pH（B）、提取温度（C）、提取时间（D）为考察因子，以沃柑果皮果胶得率（Y）为响应值进行4因素3水平的Box-Behnken响应面试验，试验设计和结果见表2。
表2 果胶提取条件优化Box-Behnken试验设计结果与分析
Table 2 Results and analysis of Box-Behnken experiments for extraction conditions optimization of pectin
试验号 A B C D Y 果胶得率/%1234567891 0 000101-1 11-0 0-1 10000001010000-10-1-1 0-1-1 1-1-1 0-1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 00010010-000111-10101000-10-10 1000 110010 110000 5.4 4.8 18.2 16.3 16.7 16.0 17.9 16.3 18.6 2.5 20.3 4.8 20.7 20.4 15.2 21.6 18.3 21.5 19.2 22.0
续表
试验号 A B C D Y 果胶得率/%21 22 23 24 25 26 27 00100-1-1-1-1 11-010-0001--1 10-1 1000 10 20.5 21.6 6.9 4.6 21.8 15.5 19.6
利用Design-Expert 13软件，对表2响应面试验得到的数据结果进行多元回归拟合，以优化主要影响因素，对拟合条件进行精细的分析，得到提取沃柑皮果胶的回归方程如下：
2.2.2 回归模型方差分析
沃柑皮果胶得率的响应面拟合回归方程的方差分析结果见表3。由表3可知，模型F检验结果为64.52（P＜0.01），表明回归模型达到极显著水平。失拟项P=0.445 9＞0.05，不显著。模型的变异系数（coefficient of variation，CV）为6.75%，决定系数R2=0.986 9，调整决定系数R2adj=0.971 6，表明拟合度很好，具有较好的可信度。R2adj与R2相近，说明回归模型对从沃柑皮中提取果胶的实际值和预测值之间具有良好的总体一致性，因此，该模型可用于分析和预测沃柑皮果胶的最佳提取条件。
表3 回归模型的方差分析
Table 3 Variance analysis of the regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著
（P＜0.05）。
方差来源 均方 自由度 离差平方和 F 值 P 值 显著性回归模型14**ABCDA B******AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项绝对误差总离差1 031.76 2.52 690.08 37.81 6.75 8.12 0.562 5 0.002 5 2.56 0.122 5 0.090 0 29.14 272.65 9.90 10.45 13.71 12.18 1.53 1 045.47 111111111111111 2 64.52 2.21 604.20 33.10 5.91 7.11 0.492 5 0.002 2 2.24 0.107 3 0.078 8 25.51 238.72 8.67 9.15＜0.000 1 0.163 2＜0.000 1＜0.000 1 0.031 7 0.020 5 0.496 2 0.963 5 0.160 2 0.748 9 0.783 7 0.000 3＜0.000 1 0.012 3 0.010 6********10 2 26 73.70 2.52 690.08 37.81 6.75 8.12 0.562 5 0.002 5 2.56 0.122 5 0.090 0 29.14 272.65 9.90 10.45 1.14 1.22 0.763 3 1.60 0.445 9
由P值可知，提取pH值和提取温度对果胶得率有极显著影响（P＜0.01），提取时间对果胶得率有显著影响（P＜0.05）。液料比和提取pH值的相互作用对果胶得率有显著影响（P＜0.05），而液料比和提取温度、液料比和提取时间、提取pH值和提取温度、提取pH值和提取时间、提取温度与提取时间的交互作用对果胶得率的影响不显著（P＞0.05）。A2、B2、C2、D2对果胶得率有极显著影响（P＜0.01）。
2.2.3 响应面分析
经过Design-Expert 13软件对响应面的试验数据进行处理，进一步分析影响沃柑皮果胶提取中每个因素的复杂性和作用。等高线图和三维响应曲面图提供了自变量之间相互作用强度的变化趋势，并考察了液料比（A）、提取pH值（B）、提取温度（C）、提取时间（D）各因素交互作用影响，结果见图5。
图5 各因素间交互作用对沃柑皮果胶得率影响的响应面图
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on pectin yields of Orah peel
由图5可知，提取pH与液料比交互作用对果胶得率影响的3D响应曲面越陡峭，等高线图为椭圆形，说明交互作用对果胶得率影响显著，但影响不显著。提取pH与提取温度交互作用对果胶得率的等高线图为扁平椭圆形，说明交互作用对果胶得率有一定影响，但影响不显著。液料比与提取温度、液料比与提取时间、提取pH值与提取时间以及提取温度与提取时间两两交互作用的等高线图均接近圆形；当一个变量固定时，果胶得率随另一个变量的增加先升高后降低，3D曲面图变化平缓，表明对果胶得率影响不显著。各因素交互作用对沃柑皮果胶提取的影响程度，由大到小的顺序为：AB＞BC＞AC＞BD＞CD＞AD。
2.2.4 验证试验
根据Design-Expert 13软件处理沃柑果胶的数据得出其最佳的提取条件：液料比为50∶1（mL∶g）、提取pH为1.26、提取温度为89.19 ℃、提取时间为97.18 min。在此条件下，沃柑果胶得率理论上可以达到21.96%。考虑到试验实际操作可行性，将提取工艺参数调整为液料比为50∶1（mL∶g）、提取pH值为1.3、提取温度89 ℃、提取时间为97 min，将调整好的工艺参数进行3组平行验证试验，果胶得率分别为：21.4%、21.2%、21.5%，取其平均值为21.36%，与预测值接近，误差为0.595。结果表明，使用响应面法对沃柑果皮果胶酸提取法提取的各因素进行优化研究是合理可行的，该模型对优化沃柑果皮果胶的提取工艺可行。
2.3 果胶理化性质结果分析
将优化的沃柑果皮理化指标进行测定，结果发现，沃柑果胶水分含量为10.5%、酸不溶灰分含量0.48%、总半乳糖醛酸含量为72.6%，均符合GB 25533—2010《食品安全国家标准食品添加剂果胶》对果胶的要求。酯化度为89.9%，所提取的果胶纯度相对较高，属于高酯果胶（DE＞50%）。酯化度越高的果胶其凝胶速度越快，高酯果胶可以用于奶制品，在加热的时候，pH为3.5～4.2之间的条件下可以防止酪蛋白的聚集，适合用于已经被巴氏杀菌或超高温杀菌过的酸乳、酸豆乳和牛乳跟果汁混合物里面。根据测定的沃柑皮果胶的理化数据来看，通过酸法提取得到的沃柑皮果胶是一种纯度相对较高的优质高酯果胶。
3 结论
本研究通过优化酸法提取沃柑皮果胶的提取工艺，并测定其理化性质，探索了沃柑果皮中果胶的提取可能性和应用价值。研究结果表明，最佳提取工艺条件为液料比50∶1（mL∶g）、提取pH值为1.3、提取温度为89 ℃、提取时间为97 min。在此条件下，沃柑果胶得率为21.36%，其水分含量为10.5%、酸不溶灰分含量为0.48%、半乳糖醛酸含量为72.6%、酯化度为89.9%。这些理化指标均满足果胶的国家标准要求。酸法能够有效地提取沃柑皮果胶，并且所得果胶质量优良、适用性好，具有广阔的应用前景。
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