柘树又名黄金木，桑科植物，是素有“南檀北柘”之称的名贵树种，其树根和树皮可入药[1]。近期研究发现，柘树的树根有抗炎[2]、抗肿瘤[3]、抑制α-葡萄糖苷酶活性[4]和降血压[5]的作用。柘树的树茎被当作原料制作糖浆和颗粒制剂，治疗消化道肿瘤。柘树的树茎中含有一种黄色的着色剂，是古代皇家龙袍的染料[6]。在很长的一段时间里，柘树的树叶一直被制成功能性茶饮，同时也是养蚕行业完美的食物来源[7]。柘果是柘树的果实，糖类成分含量为1.801～2.402 g/L[11]，含有黄酮[12]、氧化蒽酮[13]、生物碱[14]和有机酸[15]等具有药用价值的化合物[8-14]。在韩国，柘果的开发利用起步较早，柘果被制成果汁、果酱、果酒和其他保健食品[15]。柘木在我国栽培时间较早但对柘果的开发起步较晚，由于柘果不耐储存，冷藏条件下可以保鲜一周左右，冷藏温度较低或者时间较长都会直接影响柘果的品质和口感。因此对柘果的开发利用是一项值得研究的课题。
白兰地起源于法国，狭义上讲，是以葡萄为原料发酵后经蒸馏得到的高度酒，再经橡木桶贮存而成。未经蒸馏的白兰酒精度较低，经二次蒸馏后成品酒的酒精含量约为40%vol。白兰地大多是以葡萄为原料，也有一些以其他水果为原料酿造的，这种白兰地会添加水果的名称，如蓝莓白兰地、山楂白兰地等[16]。本试验以柘果为原料酿造白兰地，对其发酵条件进行优化，以期为柘果在中国的开发利用提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
柘果：山东省平阴县东阿镇鑫合种植农民专业合作社；柠檬酸（食品级）：北京盒子生工科技有限公司；液体果胶酶（酶活力8万U/mL）：河北润步生物科技有限公司；白砂糖：市售；葡萄酒活性干酵母SY：安琪酵母股份有限公司；焦亚硫酸钠（食品级）：陕西源优生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
HH-2 水浴锅：常州天瑞仪器有限公司；PHSJ-5T pH 计：上海仪电科学仪器有限公司；ZWYRD2403 恒温培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；UV3000分光光度计：上海精科实业有限公司；WAY-32 糖度折光仪：上海光学仪器五厂有限公司；L18-Y915S破壁机：九阳股份有限公司；CJM-549酒精计（0%vol～100%vol）：衡水创纪仪器仪表有限公司；QP2010气相色谱-质谱联用仪（gas chromatographymassspectrometry，GC-MS）：岛津（上海）实验器材有限公司。
1.3 方法
1.3.1 柘果白兰地发酵工艺流程及操作要点
柘果→带皮破碎→柠檬酸调酸→加果胶酶解→调节糖度→加焦亚硫酸钠→灭菌→加酵母菌粉→发酵→一次蒸馏→二次蒸馏→加入中度烘焙橡木片→过滤→柘果白兰地
原料处理：挑选表皮无破损、无腐烂的完整柘果，自来水流动冲洗后晾干。
破碎：使用破壁机破碎20 s，粒度为60目。
调节酸度：使用柠檬酸调节pH至3.5。
酶解：将柘果汁与纯净水按1∶1.5（V/V）的比例混合，加入0.1%果胶酶，在50 ℃条件下酶解2 h。
调节糖度：加入白砂糖将初始糖度调整为24°Bx。
灭菌：加入0.01%焦亚硫酸钠，灭菌2 h。
酵母菌接种：按照1 L果汁加2 g果酒酿造专用酵母菌粉的比例接种酵母，使用前用30 ℃无菌水将酵母粉活化30 min。
发酵：发酵容器上安装s型单向排气阀，排气阀中加入少量无菌水（发酵过程中注意及时添加无菌水，使容器一直处于密闭状态），既能使发酵容器密闭，又能达到将发酵过程中的气体排出的目的。将发酵容器置于28 ℃恒温恒湿培养箱中发酵9 d，期间定时搅拌。
蒸馏：采用蒸馏装置进行一次蒸馏和二次蒸馏。一次蒸馏时温度80 ℃，流出酒酒精度降低至5%vol时停止接酒；二次蒸馏时温度65 ℃，流出酒酒精度降低至5%vol时停止接酒，并去掉酒头和酒尾。
添加橡木片：按照1 L白兰地添加5 g中度烘焙橡木片的比例添加橡木片，浸泡4周。
过滤：用三层纱布进行过滤，即得柘果白兰地。
1.3.2 柘果果酒发酵条件优化单因素试验
初始糖度：在发酵时间为7 d、发酵温度为28 ℃、酵母菌添加量为0.2%的条件下，分别考察不同初始糖度（16°Bx、20°Bx、24°Bx、28°Bx、32°Bx）对柘果白兰地感官评分的影响。
发酵时间：在发酵温度为28 ℃、酵母菌添加量为0.2%、初始糖度为24°Bx的条件下，分别考察不同发酵时间（7 d、8 d、9 d、10 d、11 d）对柘果白兰地感官评分的影响。
酵母菌添加量：在发酵时间为7 d、发酵温度为28 ℃、初始糖度为24°Bx 的条件下，分别考察不同酵母菌添加量（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）对柘果白兰地感官评分的影响。
1.3.3 柘果果酒发酵条件优化响应面试验
基于单因素试验结果，以初始糖度（A）、发酵时间（B）和酵母菌添加量（C）为考察因素，使用Design-Expert 8.0.6.1软件，以柘果白兰地感官评分（R）为响应值，设计3因素3水平响应面试验优化柘果果酒发酵条件，响应面试验因素与水平见表1。
表1 柘果果酒发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermentation process optimization of Cudrania tricuspidata wine
因素A 初始糖度/°Bx B 发酵时间/d C 酵母菌添加量/%-1水平0 1 20 8 0.15 24 9 0.2 28 10 0.25
表2 柘果白兰地感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Cudrania tricuspidata brandy
项目 评价标准 评分/分外观（15分）香气（30分）口感（35分）风格（20分）金黄色，澄清透亮，无沉淀物浅金黄色，澄清透明，无沉淀物浅金黄色，澄清半透明，有少许沉淀物暗黄色或无色，光泽较暗，可见沉淀物香气协调且平衡，无邪杂异味香气较协调，无邪杂异味香气淡薄，有明显邪杂异味酒体醇厚饱满，细腻绵柔，无辛辣味，不刺激酒体欠饱满，略有辛辣味，稍有刺激感酒体寡淡无味，辛辣味重且刺激有柘果白兰地的特殊风格略有柘果白兰地的风格没有柘果白兰地的风格13～15 10～12 5～9 0～4 20～30 10～19 0～9 25～35 15～24 0～14 15～20 10～14 0～9
1.3.4 测定方法
感官评定：由15名酿造专业的评审员组成评价小组，以GB/T 11856—2008《白兰地》的感官要求为感官评价参考标准，从外观、香气、口感和风格四个方面对样品进行打分，满分为100分，取15人的平均分。
总酸、总糖含量：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的检测方法测定[17]；甲醇含量采用GB 5009.266—2016 食品安全国家标准《食品中甲醇的测定》中的检测方法测定[18]；乙醇含量采用GB 5009.225—2016 食品安全国家标准《酒中乙醇浓度的测定》中的检测方法测定[19]；总酯含量采用GB/T 11856—2008《白兰地》中的方法[20]。
挥发性风味物质采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）法测定[19]。
（1）样品前处理：准确取3 mL样品置于30 mL固相微萃取采样瓶中，加入1 μL质量浓度为10 μL/mL乙酸戊酯为内标，加入3.0 mL去离子水和0.3 g NaCl，放入磁力转子，密封后将样品瓶置于65 ℃水浴中热平衡10 min，磁力搅拌器速度设置为800 r/min，用正己烷清洗萃取针头表面并对其进行活化，将活化后的萃取针头插入样品瓶内，推出纤维头，使之距样品液面约8 mm，顶空萃取50 min。萃取完毕迅速取出萃取针头，并将萃取针头迅速插入气相色谱质谱联用仪的进样口中热解吸6 min，进样。
（2）气相色谱条件：固相微萃取针头型号为75 μm CAR/PDMS。采用Agilent HP-5毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；载气为高纯He（99.999%），流速1 mL/min，不分流进样；进样口温度250 ℃；升温程序：起始温度40 ℃，保留10 min；以5 ℃/min升至90 ℃，保留5 min；再以2 ℃/min升至180 ℃，保留5 min；最后以20 ℃/min升至280 ℃。
（3）质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子轰击能量70 eV；离子源温度230 ℃；质量扫描范围25～450 amu；辅助温度280 ℃；扫描模式Scan。
（4）定性定量方法：检测出的物质根据相似度和保留指数，通过美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）20谱库结合人工解谱的方法进行定性（匹配度＞80%）。采用内标法对检测物进行定量分析。
1.3.5 数据处理
采用SPSS 22.0 软件进行显著性分析，P＜0.01，表示差异性极显著，P＜0.05，表示差异性显著，结果以“平均值±标准差”表示。采用Design Expert 8.0.6 软件对数据进行分析处理，采用Origin 8.5 软件作图。
2 结果与分析
2.1 柘果果酒发酵条件优化单因素试验结果
根据白兰地的酿造工艺，将发酵结束后的果酒进行二次蒸馏，得到的白兰地酒精度为40%vol，进行后续的检测以及感官评分。
2.1.1 初始糖度对柘果白兰地品质的影响
由图1可以看出，随着初始糖度的增加，总酸含量呈现下降的趋势，总糖含量呈现上升趋势，挥发性风味物质含量、感官评分呈现先上升后下降的趋势，甲醇含量呈先下降后上升再下降的趋势；初始糖度为24°Bx时，挥发性风味物质含量最高为（1.24±0.07）g/L；糖度过低时酵母菌代谢不足，糖度过高时会抑制酵母的代谢活性，都不利于挥发性风味物质的产生[21]。此时甲醇含量最低为（107±5.07）mg/L，酵母代谢途径分为糖代谢途径和其他物质代谢途径，当初始糖度过高或者过低都会引发酵母进行其他物质代谢途径，从而导致甲醇含量升高[16，22]。初始糖度为28°Bx时，感官评分值最高为（85.97±0.71）分。综合考虑，选取初始糖度20°Bx、24°Bx、28°Bx为响应面优化试验的3个水平。
图1 初始糖度对柘果白兰地品质的影响
Fig.1 Effect of initial sugar content on the quality of Cudrania tricuspidata brandy
2.1.2 发酵时间对柘果白兰地品质的影响
由图2可以看出，随着发酵时间的延长，总酸含量呈现上升的趋势[23]，总糖含量呈现下降的趋势，挥发性风味物质含量、感官评分呈现先上升后下降的趋势，甲醇含量变化不明显；发酵时间为9 d时，挥发性风味物质含量达到最高，为（1.21±0.04）g/L，这种现象可能是由于风味物质的自然挥发或者被酵母代谢消耗[24-25]；发酵时间为9 d时，感官评分为（86.11±0.67）分，发酵时间为10 d时，感官评分最高为（86.25±0.49）分。综合考虑，选取发酵时间8 d、9 d、10 d为响应面优化试验的3个水平。
图2 发酵时间对柘果白兰地品质的影响
Fig.2 Effect of fermentation time on the quality of Cudrania tricuspidata brandy
2.1.3 酵母添加量对柘果白兰地发酵品质的影响
由图3可以看出，随着酵母添加量的增加，总酸含量呈现升高的趋势[26]，总糖含量呈现下降的趋势，挥发性风味物质含量变化不大，甲醇含量呈现先下降后上升的趋势，感官评分呈现先上升后下降的趋势；酵母添加量为0.10%时，甲醇含量最低为（113.67±1.53）mg/L；酵母添加量为0.20%时，感官评分值最高为（84.26±0.35）分。综合考虑，选取酵母添加量0.15%、0.20%、0.25%为响应面优化试验的3个水平。
图3 酵母菌添加量对柘果白兰地品质的影响
Fig.3 Effect of yeast addition on the quality of Cudrania tricuspidata brandy
2.2 柘果果酒发酵条件优化响应面试验结果
在单因素试验的基础上，以初始糖度（A）、发酵时间（B）及酵母添加量（C）为3个因素，以柘果白兰地感官评分（R）为响应值，采用Design Expert 13软件设计Box-Behnken试验，对柘果果酒发酵条件进行优化。响应面试验设计及结果见表3，方差分析见表4。
表3 柘果果酒发酵条件优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface methodology for fermentation process optimization of Cudrania tricuspidata wine
试验号 A 初始糖度/°Bx B 发酵时间/d C 酵母添加量/% R 感官评分1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 10 10 9 9 1 11 12 13 14 15 24 24 28 24 20 20 24 24 28 28 28 24 24 20 24 0 9 8 9 8 9 1 0 8 9 8 9 0.15 0.25 0.15 0.20 0.20 0.15 0.25 0.20 0.20 0.25 0.20 0.15 0.20 0.20 0.20 80.4 85.5 81.9 86.1 77.8 80.9 77.4 86.5 77.9 85.6 85.9 76.5 87.1 76.9 87.4
续表
试验号 A 初始糖度/°Bx B 发酵时间/d C 酵母添加量/% R 感官评分16 17 24 20 99 0.20 0.25 87.7 80.2
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著
（P＜0.05）。
参数 偏差平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型ABCA B**********AC BC A2 B2 C2残差失拟项误差项总和275.59 30.03 54.60 10.12 12.60 4.84 4.41 27.76 95.70 21.17 4.95 3.24 1.71 280.54 91111111117341 6 30.62 30.03 54.60 10.12 12.60 4.84 4.41 27.76 95.70 21.17 0.707 1 1.08 0.428 43.31 42.47 77.22 14.32 17.82 6.85 6.24 39.25 135.35 29.95＜0.000 1 0.000 3＜0.000 1 0.006 9 0.003 9 0.034 6 0.041 1 0.000 4＜0.000 1 0.000 9********2.52 0.196 5
根据表3数据得到柘果白兰地感官评分响应值所得回归方程：
由表4可知，试验所预设的各种因素对感官评分的影响各不相同，按F值排列顺序为B＞A＞C，即对感官评分的影响为发酵时间＞初始糖度＞酵母添加量。由P值可知，交互项AC、BC对感官评分的影响显著（P＜0.05），一次项A、B、C，交互项AB，二次项A2、B2、C2对感官评分的影响极显著（P＜0.01）。失拟项P值不显著（P＞0.05），说明回归方程拟合度良好，能较好的在变量范围内反映响应值的变化情况，可以用于柘果白兰地发酵工艺的预测。
各因素交互作用对柘果白兰地感官评分影响的响应面及等高线如图4所示。由图4可知，初始糖度（A）、发酵时间（B）和酵母接种量（C）这3个因素交互作用在感官评分响应面3D图上均存在极值，AB交互作用的响应面坡度趋势陡峭，说明AB交互作用对感官评分的影响较大，与方差分析结果一致。
图4 各因素交互作用对柘果白兰地感官评分影响的响应面及等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory evaluation score of Cudrania tricuspidata brandy
预测柘果白兰地最佳发酵工艺参数为初始糖度26.59°Bx，发酵时间9.61 d，酵母添加量0.21%。在此条件下，感官评分预测值为87.99分。为方便实际操作，修改发酵条件为初始糖度26.6 °Bx，发酵时间10 d，酵母添加量0.2%，在此条件下进行3次平行验证试验，最终得到感官评分实际值为86.59分，与预测值接近，证明该模型可行。
2.3 柘果白兰地品质指标
在最佳条件下发酵得到的柘果白兰地成品感官评分为86.59分，外观呈金黄色，澄清透亮，无沉淀物，香气协调且平衡，酒体醇厚饱满，细腻绵柔，无辛辣味，具有柘果白兰地的特殊风格。酒精度为40%vol、总酸含量为2.05 g/L、总酯含量为2.96 g/L、总糖含量为3.03 g/L、甲醇含量为121 mg/L（≤2.0 g/L）、挥发性风味物质含量为1.22 g/L，理化指标符合GB/T 11856—2008《白兰地》的要求。细菌总数≤50CFU/mL，大肠杆菌≤3 MPN/mL，沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌检出。
3 结论
通过单因素试验研究初始糖度、发酵时间和酵母接种量对柘果白兰地品质的影响，进一步利用Box-Behnken响应面试验优化发酵条件。结果表明，最佳发酵条件为初始糖度26.6°Bx，发酵时间9.6 d，酵母添加量0.2%。在此发酵条件下得到的柘果果酒经蒸馏得到的柘果白兰地，外观呈金黄色，澄清透亮，无沉淀物，香气协调且平衡，酒体醇厚饱满，细腻绵柔，无辛辣味，具有柘果白兰地的特殊风格，感官评分为86.59分。酒精度为40%vol、总酸含量为2.05 g/L、总酯含量为2.96 g/L、总糖含量为3.03 g/L、甲醇含量为121 mg/L（≤2.0 g/L）、挥发性风味物质含量为1.22 g/L，品质指标符合GB/T 11856—2008《白兰地》的要求。
[1]张欣芮，李娜，卜桐，等.柘树不同药用部位本草考证，化学成分及药理作用研究进展[J].中成药，2023，45（3）：865-874.
[2]龙滕周.国内柘树种质资源及其开发利用研究进展[J].林业科技通讯，2018（9）：34-38.
[3] PARK K H, PARK Y D, HAN J M, et al.Anti-atherosclerotic and antiinflammatory activities of catecholic xanthones and flavonoids isolated from Cudrania tricuspidata[J].Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16(21):5580-5583.
[4]ZOU Y S,HOU A J,ZHU G F,et al.Cytotoxic isoprenylated xanthones from Cudrania tricuspidata[J].Bioorg Med Chem, 2004, 12(8): 1947-1953.
[5]SEO E J,CURTIS-LONG M J,LEE B W,et al.Xanthones from Cudrania tricuspidata displaying potent alpha-glucosidase inhibition[J].Bioorg Med Chem Lett,2007,17(23):6421-6424.
[6]KANG D G,HUR T Y,LEE G M,et al.Effects of Cudrania tricuspidata water extract on blood pressure and renal functions in NO-dependent hypertension[J].Life Sci,2002,70(22):2599-2609.
[7]XIN L T,YUE S J,FAN Y C,et al.Cudrania tricuspidata:an updated review on ethnomedicine,phytochemistry and pharmacology[J].RSC Adv,2017,7(51):31807-31832.
[8] LI X, YAO Z, JIANG X, et al.Bioactive compounds from Cudrania tricuspidata:A natural anticancer source[J].Crit Rev Food Sci Nutr,2020,60(3):494-514.
[9]曹春廷.柘树果实抗氧化成分分析及其异黄酮Scandenolone诱导乳腺癌细胞凋亡通路研究[D].雅安：四川农业大学，2015.
[10]王丽芳.柘树果实活性成分Warangalone诱导宫颈癌细胞凋亡的分子机制研究[D].广州：暨南大学，2017.
[11]JEONG J Y,JO Y H,LEE K Y,et al.Optimization of pancreatic lipase inhibition by Cudrania tricuspidata fruits using response surface methodology[J].Bioorg Med Chem Lett,2014,24(10):2329-2333.
[12]龚频，翟鹏涛，张梦璇，等.野葛总黄酮的提取工艺优化及抗氧化活性研究[J].中国酿造，2022，41（10）：172-176.
[13]张宇航，徐佳元，曹丹，等.肠道微生物菌群对大黄蒽醌类化合物代谢研究进展[J].中华中医药学刊，2021，49（10）：203-211.
[14]陈星月，龚道勇，郭顺星，等.石斛碱型生物碱及石斛碱合成生物学研究进展[J].重庆工商大学学报：自然科学版，2021，38（3）：8-18.
[15]胡燕.茶叶中有机酸，茶多糖的功效及其在雅安藏茶中的研究进展[J].农产品质量与安全，2022，4（4）：23-27.
[16]吴广辉，毕韬韬，陈浪，等.蓝莓果渣白兰地酿造工艺研究[J].中国酿造，2023，42（1）：197-202.
[17]徐淑飞，贺丽娜，王兰花，等.全自动葡萄酒成分分析仪测定葡萄酒中柠檬酸[J].食品安全质量检测学报，2018，9（19）：109-112.
[18]张瑶，马桂娟，高琳.气相色谱法测定葡萄酒中甲醇含量的不确定度[J].科技视界，2018（35）：75-77.
[19]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB5009.225—2016 食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[20]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 11856—2008 白兰地[S].北京：中国标准出版社，2009.
[21]李智邦.酵母菌发酵红枣饮料加工工艺及品质变化研究[D].石河子：石河子大学，2022.
[22]刘阿文.桑葚果酒发酵工艺条件及生理活性研究[D].延吉：延边大学，2019.
[23]郑升海，田树林，王宇，等.响应面优化桑葚白兰地原料酒发酵工艺[J].食品研究与开发，2022，43（14）：152-159.
[24]杨梦霞.大米无麸质啤酒工艺及原料对风味代谢物影响的研究[D].海口：海南大学，2022.
[25]吴隽松，滕飞翔，杨留才.响应面法优化白首乌发酵乳制备工艺[J].中国酿造，2020，39（12）：188-192.
[26]吉正梅，叶英，姜文，等.基于响应面设计的狭果茶藨子果酒发酵工艺优化[J].食品研究与开发，2021，42（17）：86-92.