豇豆（Vigna unguiculata（Linn.）Walp.）别名豆角，属豆科，为一年生草本植物，是我国食用豆类作物之一。其营养丰富，蛋白质含量高，含有多种维生素、膳食纤维、碳水化合物、矿物质、酚类物质等，具有理中益气、健胃补肾、调颜养身等功效[1-3]。在我国，以豇豆为主的加工食品可分为新型和传统型。新型食品主要有豇豆饮料[4]、酸奶[5]、辣条[6]等；传统型有酸豇豆和豇豆干制品。酸豇豆是中华传统发酵蔬菜，属于泡菜，深受消费者喜爱，具有解腻开胃、促消化等功效[7]。
泡菜利用乳酸菌为优势益生菌发酵而成，具有清爽可口、鲜香脆嫩等独特的风味[8]，还有抗菌、抗癌、抗衰老、抗动脉硬化和抗肥胖等作用[9-11]。目前泡菜以自然发酵和人工接种发酵为主：自然发酵是利用蔬菜表面附带的微生物及食盐的高渗透性进行发酵，发酵周期长、安全性不稳定，易发生有害微生物污染，有一定的不可控环境因素；人工接种发酵通过加入合适的发酵剂来缩短发酵周期，可保证产品质量稳定性。人工接种发酵分为纯种乳酸菌接种发酵和直投式发酵两种方式[12]。如牟琴等[13]用混合乳酸菌发酵番茄酱风味佳，发酵周期短；王海平等[14]以纯种湿法发酵芥蓝证明可缩短发酵周期；陈大鹏等[15]研究表明，人工接种发酵与自然发酵相比，可缩短泡菜发酵周期，减少亚硝酸盐含量，且风味物质接近。直投式发酵剂是在纯种乳酸菌发酵技术基础上，经高浓度菌液通过冷冻干燥制备而得的发酵剂，活菌含量高且质量稳定，能够使发酵产品实现标准化、产业化。已有研究表明，直投式乳酸菌发酵蔬菜成熟后品质优于自然发酵和老盐水发酵蔬菜，且能缩短发酵周期并有效抑制杂菌生长[16]。直投发酵黄秋葵泡菜发酵成熟周期更短，亚硝酸盐含量更低[17]。陈凤等[18]采用直投式乳酸菌剂发酵豇豆所得成品色泽好，菌剂启酵快产酸能力强。
目前，国内发酵豇豆主要采用自然发酵方式，虽然风味独特，但发酵过程极不稳定，容易受到各种环境因子的影响，无法保证产品安全、质量稳定。因此，很难实现标准化、产业化生产。本实验分别采用自然发酵、接种商业菌剂发酵、接种自筛直投式发酵菌剂3种方式制作酸豇豆，对比研究3种不同发酵方式对酸豇豆发酵过程及成品理化特性、感官特性和品质特性的影响，以期筛选出适合酸豇豆的发酵方式，提高酸豇豆品质，保证其产品安全性稳定性，为改进酸豇豆发酵工艺和品质提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
豇豆、食盐、糖（均为食品级）：市售；自筛直投式菌剂（L5、L12植物乳杆菌（活性1×1010 CFU/g））：分离自广西特色酸芥菜，保藏于本实验室；商业菌剂（乳酸菌（活性1×1010 CFU/g））：大连亚芯生物科技有限公司；氢氧化钠、乙醇、酚酞、甲醛、邻苯二甲酸氢钾、氯化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；MRS固体培养基、MC固体培养基培养：广东环凯微生物科技有限公司；亚硝酸盐含量检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
PGL精密天平：深圳市怡华新电子有限公司；CT3质构仪：博勒飞中国阿美特克商贸（上海）有限公司；SQ510C立式压力蒸汽灭菌锅：重庆雅马拓科技公司；D-37520型高速冷冻离心机：德国赛默飞世尔有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；MJ-160生化恒温培养箱：上海博迅实业有限公司；SW-CJ-2FD净化工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；CS-280分光色差仪：上海彩谱科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵工艺
（1）自然发酵（CK组）：将豇豆洗净并去除表皮杂质，沥干水分，装坛，加入含有40 g/L食用盐、10 g/L白砂糖的水，密封发酵。（2）商业菌种发酵（CS组）：将豇豆洗净并去除表皮杂质，沥干水分，装坛，加入含有40 g/L食用盐、10 g/L白砂糖的水，按豇豆质量加入0.1 g/kg商业菌剂，密封发酵。（3）自筛直投式菌剂发酵（DVS组）：将豇豆洗净并去除表皮杂质，沥干水分，装坛，加入含有40 g/L食用盐、10 g/L白砂糖的水，按豇豆质量加入0.1 g/kg自筛直投式菌剂，密封发酵。
将上述3种豇豆处理后在坛口处加入适量水密封以防止杂菌污染，室温条件下静置发酵，在发酵0～7 d每天取发酵液测定总酸、pH、菌落总数，发酵25 d后取酸豇豆成品测定盐度、亚硝酸盐、氨基酸态氮、游离氨基酸、乳酸菌总数、色度以及进行感官评价、质构特性测定。
1.3.2 理化指标测定
pH：取发酵罐上、中、下层的发酵液混匀，用pH计连续测定3次，取平均值作为最终结果；总酸：酸碱滴定法，参考GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》测定[19]；盐度：参考GB 5009.44—2016《食品安全国家标准食品中氯化物的测定》测定[20]；亚硝酸盐：采用亚硝酸盐测试盒测定，具体实验方法按照试剂盒说明书进行；氨基酸态氮：参考GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》测定[21]；游离氨基酸：参考曹建康等[22]的方法测定。
1.3.3 微生物指标
乳酸菌数：参考国标GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》测定[23]。
1.3.4 颜色参数分析
采用CS-280分光色差仪进行测定L*、a*、b*值，每组样品平行测定3次。L*值代表亮度，a*值代表红绿色度指标，b*值代表黄蓝色度指标。
1.3.5 感官评定
感官评价方法参考文献[24]并略作修改。邀请10名具有感官评定经验的食品加工相关人员组成评定小组，根据表1分别从酸豇豆的色泽、气味、滋味、脆度进行感官评定，在评分中的加权系数分别为20%、20%、30%、30%，结果取平均值，满分为9分。
表1 酸豇豆成品感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standard of sour cowpea products
项目（加权系数） 7～9评分标准/分4～6 1～3色泽（20%）气味（20%）滋味（30%）脆度（30%）颜色均匀，色泽鲜亮、饱满香味浓郁，无不良气味酸咸度适中脆嫩爽口颜色均匀，色泽较鲜亮香味淡，无不良气味酸咸味较浓或较淡较脆色泽发暗，变褐无香味或有不良气味味道寡淡或过分酸咸绵软
1.3.6 质构特性测定
参考厍晓等[25]的方法并稍作改动，质构剖面分析（texture profile analysis，TPA）参数：探头TA/39，夹具TA-RT-KI，测前速度2 mm/s，测定速度0.50 mm/s，测后速度1.0 mm/s，压缩程度30%，每个处理设8个重复，结果取平均值。
1.3.7 数据处理
指标测定数据为3次以上重复实验的平均值±标准差；使用SPSS 22.0软件进行统计分析，利用邓肯多重比较法（Duncan）对数据间进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 不同发酵方式对发酵过程中酸豇豆总酸的影响
由图1可知，在酸豇豆发酵过程中，CK组和CS组酸豇豆总酸随着发酵时间的增加逐渐升高；DVS组酸豇豆总酸增长速度最快，在5 d时达到最大值后呈下降趋势。DVS组总酸含量在1～6 d均显著高于CS组（P＜0.05），在1 d、2 d、4 d、5 d、6 d显著高于CK组（P＜0.05）。但在7 d时，CK组、CS组、DVS组总酸含量分别为4.88 g/L、3.73 g/L、3.20 g/L，其中CK组总酸含量显著高于CS组和DVS组（P＜0.05）。DVS组总酸含量下降可能是由于乳酸过量抑制了乳酸菌代谢，乳酸被其他微生物消耗以克服乳酸胁迫作用[26]，也可能由于酯化反应生成酯类芳香物质抑制乳酸菌的生命活动，导致总酸含量降低[27]。以上结果表明，DVS组发酵启动快，但CK组产酸能力更强。
图1 不同发酵方式对发酵过程中酸豇豆总酸的影响
Fig.1 Effects of different fermentation methods on total acid of sour cowpea during fermentation
组间不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），下同。
2.2 不同发酵方式对发酵过程中酸豇豆pH值的影响
pH值是泡菜发酵过程的重要理化指标，可反映出发酵过程微生物生长状况。由图2可知，在酸豇豆发酵过程中，CK组、CS组、DVS组的pH值随着发酵时间的增加均呈现下降的趋势。在0～2 d，3种发酵方式的豇豆pH值迅速下降，其中CS组、DVS组的pH值下降速率比CK组快，这是因为CS、DVS组里的乳酸菌含量丰富，生长、繁殖、代谢快，产酸速率快使pH值迅速下降，且低pH值可抑制不耐酸的杂菌繁殖，这与李俊健等[28-29]的研究结果一致；而CK组靠豇豆表面携带大量微生物进行发酵，需要较长的时间进行繁殖代谢才形成优势种菌，进行发酵。在2～7 d内，CK组pH缓慢上升，CS组pH呈现缓慢下降趋势，DVS组pH缓慢下降于4 d后并趋于平缓。7 d时，CK组、CS组、DVS组pH值分别为3.59、3.34、3.45，CS组和DVS组均显著低于CK组（P＜0.05）。说明CS组与DVS组均能提升发酵速度。
图2 不同发酵方式对发酵过程中酸豇豆pH值的影响
Fig.2 Effects of different fermentation methods on pH value of sour cowpea during fermentation
2.3 不同发酵方式对酸豇豆成品理化特性的影响
食盐是人们生活中不可缺少的营养物质，但食盐摄入过多会引发高血压、心脏病等心脑血管疾病，不利于身体健康。与高盐食品相比，低盐饮食因更加营养健康已被推荐作为现代人健康饮食的标准之一。由表2可知，发酵成熟后酸豇豆的盐度为CK组＞CS组＞DVS组，DVS组的盐度显著低于CK组、CS组（P＜0.05），因此DVS组更符合当今低盐绿色健康食品的趋势。
表2 不同发酵方式对酸豇豆成品理化特性的影响
Table 2 Effects of different fermentation methods on physicochemical properties of sour cowpea products
发酵方式盐度/（g·100 g-1）亚硝酸盐/（mg·kg-1）氨基酸态氮/（mg·100 g-1）游离氨基酸/（mg·100 g-1）CK CS DVS 2.64±0.01a 2.57±0.05a 2.41±0.04b 0.44±0.01a 0.32±0.07ab 0.18±0.09b 0.52±0.06b 0.47±0.01b 0.85±0.08a 31.60±1.11b 25.56±0.52c 38.86±0.60a
亚硝酸盐是在发酵过程中产生的一种有害的物质，摄入过量后能在人体内与仲胺类物质结合生成亚硝胺，而亚硝胺具有强致癌性，因此亚硝酸盐是评价泡菜产品食用安全的重要指标[30]。3种发酵方式得到的酸豇豆样品的亚硝酸盐含量均低于国家标准限量20 mg/kg，其中DVS组最低，为0.18 mg/kg，分别比CK组、CS组降低59.10%、43.75%。这是由于在发酵过程中，原料中硝酸盐会在细菌代谢产生的硝酸还原酶作用下还原为亚硝酸盐，而乳酸菌又可降解亚硝酸盐[31-32]。表明DVS组与其他发酵方式相比更具食用安全性。
在发酵过程中，蔬菜的蛋白质在微生物水解酶的作用下分解成各种氨基酸，从而使泡菜产生鲜味，因此氨基酸态氮的含量在一定程度上可代表泡菜的感官品质[33]。3种发酵方式得到的酸豇豆样品中DVS组的氨基酸态氮含量最高为0.85 mg/100 g，显著高于CK组、CS组63.46%、80.85%（P＜0.05）。
食物中所含氨基酸由游离氨基酸和非游离氨基酸组成，游离氨基酸是泡菜独特风味的来源之一，是酸豇豆中重要的风味物质[34]。3种发酵方式中DVS组的游离氨基酸含量最高，为38.86 mg/100 g，显著高于CK组、CS组22.97%、52.03%（P＜0.05）。
综上所述，DVS组的酸豇豆更佳，低盐健康，风险较低，品质好、风味佳。
2.4 不同发酵方式对酸豇豆成品乳酸菌数的影响
由表3可知，CK组、CS组、DVS组的酸豇豆乳酸菌数分别为5.04 lg（CFU/g）、5.18 lg（CFU/g）、5.65 lg（CFU/g）。乳酸菌具有改善人体胃肠道功能、防癌和抗癌等多种功能作用，对人体有一定保健或生物学功能[35]。所以酸豇豆乳酸菌数越高，益生价值越高。
表3 不同发酵方式对酸豇豆成品乳酸菌数的影响
Table 3 Effect of different fermentation methods on lactic acid bacteria count of sour cowpea products
发酵方式 乳酸菌数lg（CFU·g-1）CK CS DVS 5.04 5.18 5.65
2.5 不同发酵方式对酸豇豆成品色泽的影响
从表4可知，3种发酵方式得到的酸豇豆的L*值、a*值均无显著性差异（P＞0.05）；DVS组b*值显著低于其他两种发酵方式（P＜0.05）。b*值越大代表黄色越深，说明DVS组可缓解酸豇豆黄色度上升但不影响光泽度。
表4 不同发酵方式对酸豇豆成品色度的影响
Table 4 Effect of different fermentation methods on chromaticity of sour cowpea products
发酵方式 L*值 a*值 b*值CK CS DVS 42.84±2.57a 42.53±1.64a 42.05±2.30a 4.21±1.02a 4.24±0.77a 3.86±0.88a 21.52±3.34a 20.28±2.80a 17.73±2.40b
2.6 不同发酵方式对酸豇豆成品感官评分的影响
由表5可知，3种发酵方式得到的酸豇豆在色泽方面无显著差异（P＞0.05）；在气味、脆度方面，DVS组评分最高均与显著高于CK组、CS组（P＜0.05）；在滋味方面，DVS组评分最高；在加权平均分方面，DVS组评分最高为7.11分，显著高于CK组、CS组（P＜0.05）。由此可知，DVS组的酸豇豆感官品质优于CK组、CS组的酸豇豆。
表5 不同发酵方式对酸豇豆成品感官评分的影响
Table 5 Effect of different fermentation methods on sensory evaluation of sour cowpea products
发酵方式 色泽 气味 滋味 脆度 加权平均分CK CS DVS 5.80±1.22a 6.50±2.07a 7.00±1.05a 5.20±1.81b 5.30±1.25b 7.40±1.34a 5.90±2.08a 5.20±1.23b 7.20±1.48a 5.80±2.04b 5.00±1.63b 6.90±1.80a 5.71±1.60b 5.42±1.01b 7.11±1.18a
2.7 不同发酵方式对酸豇豆成品质构特性的影响
质构特性是用质构仪TPA模式对酸豇豆进行两次压缩，模拟人口腔的咀嚼运动，从中分析出样品的硬度、弹性、粘力、胶着性、咀嚼性等和人口感相关质构特性，从而避免人为因素对食物质构评价结果的主观影响[36]。硬度反映的是牙齿间压迫酸豇豆所需的力。由于在发酵过程中，酸豇豆酸度增加，细胞壁中的果胶在酸性环境中逐渐水解，酸豇豆的硬度逐步下降。硬度越小，酸豇豆越容易腐烂，且不易储存。弹性反映的是第一挤压结束后酸豇豆恢复的高度。粘力反映的是探头表面与酸豇豆表面分离时所需的力，为第一次压缩循环时最大的负向作用。胶着性反映了吞咽前破碎酸豇豆需要的能量，咀嚼性反映了咀嚼酸豇豆需要的能量，咀嚼性越小，口感越合适[37]。由表6可知，3种发酵方式中DVS组酸豇豆的硬度、粘力、胶着性、咀嚼性值均最高，显著高于CS组（P＜0.05），略高于CK组但差异不显著（P＞0.05）；CK组、CS组、DVS组弹性值显著不差异（P＞0.05）。其中CS组硬度、粘力、胶着性、咀嚼性最低，可能是CS组的微生物代谢活动及渗透作用影响了豇豆细胞间的结合力，组织变得疏松，细胞液泡中水分流失有关[38]。综合说明，CK组、DVS组酸豇豆均有良好的质地。相比CK组，DVS组具有更好的硬度、粘力、胶着性、咀嚼性。结合感官评分，DVS组酸豇豆的品质更优。
表6 不同发酵方式对酸豇豆成品质构特性的影响
Table 6 Effect of different fermentation methods on texture characteristics of sour cowpea products
发酵方式 硬度/g 弹性/mm 粘力/g 胶着性/g 咀嚼性/mJ CK CS DVS 186.74±54.09a 79.60±16.04b 194.17±69.48a 1.19±0.07a 1.18±0.17a 1.15±0.11a 2.00±0.82a 1.80±0.84b 2.88±0.41a 85.86±21.54a 45.00±11.60b 94.67±22.94a 1.00±0.16a 0.54±0.19b 1.10±0.25a
3 结论
本文对比分析了发酵方式对酸豇豆品质的影响。研究结果表明，在发酵过程中，DVS组的总酸呈现先上升再下降的趋势，其增长速度较CK组、CS组快，1～6 d时均高于CK组、CS组；3种发酵方式的pH值均呈现下降的趋势，CS组、DVS组的下降速率比CK组快，在发酵7 d时DVS组与CS组均显著低于CK组（P＜0.05）。发酵成熟后，DVS组的盐度、亚硝酸盐、b*值最低，氨基酸态氮、游离氨基酸、乳酸菌数、感官评分、硬度、粘力、胶着性、咀嚼性最高，但L*值、a*值、弹性与其他发酵方式无显著性差异（P＞0.05）。综合分析，3种发酵方式中DVS组发酵启动快，且综合品质更优于CK组、CS组发酵的酸豇豆，说明采用DVS发酵豇豆可提高产品品质。
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