曲为酒之骨，说明大曲在白酒酿造过程中的重要性[1]。大曲是富集培养有益微生物及其代谢产物的载体[2]，在酿酒发酵过程中起着重要的糖化、发酵等作用[3]，可以有效地将原料中的淀粉、蛋白质等大分子物质转化为酒精及特征风味物质，并能在发酵过程中为白酒提供大量的呈香呈味物质或香味前体物质[4-5]。大曲发酵的产量和质量与酿造过程中的微生物密切相关[6]，有好酒必有好曲，大曲的品质是白酒质量的重要影响因素[7]。
大曲是酿酒的源头，为了满足与日俱增的市场需求，提高大曲的生产质量和产量便成为泥坑酒业的迫切任务。酵母菌作为产酒的主体[8]，是产酒的主要途径[9]。传统酿酒行业使用的大曲，含有丰富多样的物系、菌系和酶系[10]，其分离出的菌株主要有霉菌、酵母菌、细菌和放线菌[11]，为传统固态酿酒发酵提供了香味成分[12]、能量营养物[13]以及催化动力[14-15]。中高温大曲的顶温60 ℃，此时绝大部分酵母菌死亡[16]，影响了白酒主体呈香及呈味物质的合成与积累，不利于保持成曲质量的稳定性。泥坑酒业所处地域夏季气温炎热潮湿，昼夜温差小，最高气温在35 ℃以上，致使曲坯入房初始温度达到30 ℃以上，难以满足酵母菌等微生物附着、繁殖最佳条件[17]。成曲在夏季贮存后，会出现糖化力较高和发酵力较低现象。
本研究为提高泥坑浓香型白酒中高温大曲综合生产性能，筛选综合性能较高的酵母菌株，采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）显色初筛，以糖液发酵液酒精度、发酵力、总酸、总酯、还原糖为检测指标复筛，并考察筛选菌株菌株之间的配比对成曲发酵特性的影响，探索复配酵母菌株强化高温大曲的生产应用价值，以进一步完善浓香型白酒酿造微生物功能菌菌种资源库，为培曲强化菌种的合理搭配、使用及大曲科学化生产提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料中高温大曲样品：河北凤来仪酒业有限公司制曲车间；高粱：辽宁阜新；大麦、小麦：来自本地。
1.1.2 试剂
淀粉酶（酶活2 000 U/g）、糖化酶（酶活50 000 U/g）：邢台新华酶制剂厂；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（分析纯）：青岛海博生物技术有限公司。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：青岛海博生物技术有限公司。
富集培养基（4°Bé麦芽汁培养基）：大麦洗净浸泡12 h，阴凉处发芽后晒干研磨成粉，取粉碎样若干，加入4倍麦芽质量的水，搅拌均匀，在55～60 ℃水浴内保温糖化4 h，取出过滤，滤液调整到4°Bé麦芽汁。0.1 MPa灭菌20 min。
分离培养基：YPD固体培养基1 000 mL，孟加拉红0.033 g，氯霉素0.1 g。121 ℃灭菌20 min。
初筛培养基：TTC下层培养基为YPD固体培养基，121 ℃灭菌20 min；TTC上层培养基，TTC 0.5 g、葡萄糖5 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL、pH 6.0，115 ℃灭菌20 min。培养基灭菌后，冷却至60 ℃时，加入TTC溶液10 mL完全覆盖下层菌落，立即倾于底层平板上。
发酵培养基：取一定质量高粱粉，加入5倍质量蒸馏水蒸煮1～2 h，按20 U/g高梁粉质量加入淀粉酶液化，液化完全后补加与高粱粉同等质量的60 ℃水[18]，加入0.5%的糖化酶，搅拌均匀，在60 ℃糖化3～4 h，用稀碘液试之不显蓝色，再加热至90 ℃，用细白布过滤，测量溶液的糖度并调整为6°Bé。121 ℃灭菌20 min[19]。
6°Bé糖液培养基：100 mL6°Bé糖液，115 ℃灭菌20 min。小麦粉培养基：取曲块压制前加水后的小麦粉加入10倍质量28 ℃温水。
1.2 仪器与设备
DNP-9052电热恒温培养箱：上海精其仪器有限公司；HH-6恒温数显水浴锅：金坛新瑞仪器厂；THZ-103B摇床：上海一恒科学仪器有限公司；BSM520.3电子分析天平：上海卓精电子天平有限公司；SW-CJ-2G净化工作台：上海精密仪器仪表有限公司；XSP-BM-10C显微镜：上光仪器有限公司；75A高压灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株富集
曲坯入曲室培养30～40 h时，选取大曲表面白色和淡黄色“突起”和片状“白斑”（酵母菌），用接种环勾取3～4环，放入富集培养基中，30 ℃、150 r/min恒温振荡培养20 h，静置，挑去菌膜附着物，去掉上清液，取沉淀酵母二环，连续富集2～3次。
1.3.2 菌株分离和纯化
将富集后的菌株按10倍梯度稀释，吸取稀释梯度为10-4、10-5、10-6的菌液0.1 mL均匀涂布于分离培养基，30 ℃恒温静置培养24 h，挑取生长良好，菌落、细胞形态不同且均符合酵母菌特性菌株，于分离培养基平板划线纯化，30 ℃恒温培养24 h。
1.3.3 TTC平板显色初筛
将分离纯化得到的酵母菌点接到TTC下层培养基上，35 ℃培养8～16 h，待长出菌落后，倒入10 mL TTC上层培养基，覆盖菌落，于30 ℃避光保温，培养16 h。TTC能使酵母菌的代谢产物产生呈色变化，鉴别酵母中呼吸酶活力的高低，即酵母产酒精效率的优劣[20]，颜色越深，效率越高[21]。因此初筛出颜色深红，生长良好的菌株。
1.3.4 发酵实验复筛
将初筛菌种接种至YPD液体培养基中活化，30 ℃、150 r/min振荡培养20 h后，接种到发酵培养基中，每瓶接种2 mL，发酵栓密封，30 ℃恒温培养10 d，测定其酒精度、发酵力、总酯、总酸及还原糖含量。
1.3.5 筛选菌株复配
将通过初筛、复筛得到的Y1、Y2、Y3 3株菌株，单独接种至6°Bé糖液培养基中，在30 ℃、150 r/min条件下振荡培养24 h后，得到种子液。分别制备Y1-Y2、Y1-Y3、Y2-Y3混合种子液（体积比1∶1）、Y1-Y2-Y3混合种子液（体积比1∶1∶1），再将混合后的种子液以2%接种量接种至6°Bé糖液培养基中，30 ℃、150 r/min振荡培养20 h，酵母菌计数。得到混合培养后的Y1-Y2、Y1-Y3、Y2-Y3、Y1-Y2-Y3菌悬液，接种至发酵培养基中进行发酵实验。
1.3.6 筛选菌株接种量优化响应面试验
根据生产实践经验，以菌株发酵液的主成分综合得分（Z综合得分）（Y）为响应值，菌株Y1接种量（A）、菌株Y2接种量（B）和菌株Y3接种量（C）为自变量，利用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验，响应面试验因素及水平见表1。
表1 菌株接种量优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for strain inoculum optimization
因素A 菌株Y1/（×108个·mL-1）B 菌株Y2/（×108个·mL-1）C 菌株Y3/（×108个·mL-1）-1水平0 1 5.4 2.2 1.3 6.4 2.6 1.5 7.4 3.0 1.7
1.3.7 酵母强化大曲生产应用
曲块入房时，将筛选酵母按最佳比例制成混合培养液，用毛刷沾培养液均匀涂抹于曲坯表面，然后将曲坯放入培养室内培养，同时以没有涂混合培养液的大曲作对照，培曲30 d后取样，检测大曲质量指标（水分、酸度、发酵力、糖化力、液化力、皮张），培曲条件同常规管理。
1.3.8 分析检测
发酵力、水分含量、酸度、糖化力、液化力的测定：参考QB/T 4257—2011《大曲通用分析方法》；皮张的测定：参照《白酒生产技术全书》[10]；酒精度的测定：采用酒精计；总酸的测定：采用氢氧化钠滴定法；还原糖的测定：采用斐林试剂滴定法；总酯的测定：参考GB/T 10345—2022《白酒分析方法》中的皂化法；酵母菌数：采用血球计数板计数。
1.3.9 主成分分析及综合得分
主成分分析（principal component analysis，PCA）用于多指标综合评价，在分析过程中经过数学变换生成相对于人为确定较少的权数，减少了工作量，有助于更客观地描述处理的效果[22]。根据林海明等[23]的方法计算2个主成分与原来5个品质指标的标准化数据的线性组合，即各主成分的表达式，其线性组合为：
第一主成分：Z1=0.284×发酵力-0.412×酸度+0.18×总酯+0.311×酒精度-0.092×还原糖，
第二主成分：Z2=-0.096×发酵力-0.305×酸度+0.565×总酯-0.029×酒精度+0.367×还原糖。
应用这一线性组合计算出各主成分值和方差贡献率（Z1为67.997、Z2为30.701），最后利用各个主成分的方差贡献率得到综合主成分函数：Z综合得分=67.997×Z1+30.701×Z2。
1.3.10 数据处理
使用Excel 2016整理，采用Design Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计，并运用SPSS 16.0统计软件对实验结果进行PCA，每组试验重复3次。
2 结果与分析
2.1 酵母菌的分离筛选
2.1.1 酵母菌的分离、初筛
共分离纯化8株菌落形态不同的菌株，菌落均为乳（洁）白色，圆润，易挑起，结合细胞形态初步鉴定8株菌株为酵母菌属。通过菌落形态观察和菌落是否带有酒酯香味为依据，选取菌落大而凸起、酒酯香味浓郁的4株菌作进一步筛选。在相同培养条件下，菌落的大小和TTC颜色的深浅可反映酵母菌的增殖能力和活力，即产酒能力越强，颜色越明显[24-25]。其中，共得到菌落颜色呈深红色的3株菌，编号分别为Y1、Y2、Y3，其菌落、细胞形态见图1。
图1 菌株Y1、Y2、Y3的菌落（a）及细胞（b）形态
Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strains Y1, Y2 and Y3
2.1.2 酵母菌的复筛
酵母菌能在无氧条件下将糖类机质转化为酒精[26]，并产生二氧化碳[27-28]。因此可根据发酵液中的酒精度、总酸、总酯、还原糖以及发酵力来判断酵母菌的生命活力及产酒产酯能力[29]。菌株Y1、Y2、Y3的发酵能力检测结果见表2。
表2 筛选菌株发酵能力检测结果
Table 2 Fermentation ability results of the screened strains
菌株 酒精度/%vol总酸/（g·L-1）总酯/（g·L-1）发酵力/[g·（g·72 h）-1]还原糖/（g·100 mL-1）Y1 Y2 Y3 2.31 1.42 3.51 7.75 6.94 6.76 16.24 21.81 6.66 3.96 3.06 4.46 2.62 3.41 1.93
由表2可知，菌株Y1发酵液的酒精度为2.31%vol，总酯为16.24 g/L，说明菌株Y1有较强的产酒能力及产酯能力，菌株Y2发酵液的酒精度为1.42%vol，总酯为21.81 g/L，说明菌株Y2产酯能力在3株菌株中最强，但产酒能力较弱，菌株Y3发酵液的酒精度为3.51%vol，总酯为6.66 g/L，说明菌株Y3产酒能力在3株菌株中最强，但产酯能力最弱。此外，菌株Y1的总酸含量最高（7.75 g/L），菌株Y2的还原糖含量最高（3.41 g/100 mL），菌株Y3的发酵力最高，为4.46 g/（g·72 h）。
2.2 复配菌株发酵性能分析
混合培养结果表明3株菌间有较好的共生能力，但在发酵性能上是否存在协同促进作用需要一步研究证明，因此本试验先对3株菌之间进行复配发酵试验，复配菌株发酵能力检测结果见表3。
表3 复配菌株发酵能力检测结果
Table 3 Fermentation ability results of the mixed strains
菌株组合酒精度/%vol总酸/（g·L-1）总酯/（g·L-1）发酵力/[g·（g·72 h）-1]还原糖/（g·100 mL-1） Z综合得分Y1-Y2 Y1-Y3 Y2-Y3 Y1-Y2-Y3 0.58 3.10 2.70 2.59 8.76 7.62 5.92 6.12 17.60 17.07 16.78 17.42 2.61 4.74 4.52 4.58 2.54 1.65 2.19 1.89 260.64 368.93 414.80 423.68
由表3可知，复配菌株综合得分由高到低的顺序为：菌株Y1-Y2-Y3、Y2-Y3、Y1-Y3、Y1-Y2，分别为423.68、414.80、368.93、260.64。Y1-Y2-Y3组合的综合得分最高，为最优试验组，表明从大曲中筛选出的这3株菌能够较好地进行菌株协同发酵。
2.3 菌株接种量优化响应面试验
2.3.1 响应面试验结果
响应面试验设计及结果见表4，方差分析见表5。采用Design Expert 8.0.6软件对表4中的数据进行多项二次拟合，并获得Z综合得分对菌株Y1接种量（A）、菌株Y2接种量（B）和菌株Y3接种量（C）的二次多项回归方程为：
表4 接种量优化响应面试验设计与结果
Table 4 Design and results of response surface experiments for strain inoculum optimization
试验号A/（×108个·mL-1）B/（×108个·mL-1）C/（×108个·mL-1） Z综合得分1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 5.4 6.4 5.4 7.4 6.4 6.4 6.4 6.4 7.4 6.4 5.4 5.4 7.4 6.4 6.4 6.4 7.4 2.6 3.0 2.2 2.6 2.6 2.6 2.2 2.6 2.2 2.6 3.0 2.6 2.6 3.0 2.6 2.2 3.0 1.7 1.3 1.5 1.7 1.5 1.5 1.7 1.5 1.5 1.5 1.5 1.3 1.3 1.7 1.5 1.3 1.5 412.192 417.746 359.385 416.246 492.571 490.619 378.984 511.417 425.087 496.362 428.116 332.944 439.625 429.650 520.943 340.273 478.679
表5 回归模型的方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。
来源 自由度 均方和 均方 F 值 P 值 显著性模型ABCA B********AC BC A2 B2 C2失拟项纯误差总和54 173.65 6 441.18 7 841.45 1 417.33 57.30 2 633.11 179.66 5 302.92 8 180.17 18 699.84 11.50 697.00 54 882.15 9111111111341 6 6 019.29 6 441.18 7 841.45 1 417.33 57.30 2 633.11 179.66 5 302.92 8 180.17 18 699.84 3.83 174.25 59.47 63.64 77.47 14.00 0.57 26.01 1.78 52.39 80.82 184.75 0.022＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.007 2 0.476 3 0.001 4 0.224 5 0.000 2＜0.000 1＜0.000 1 0.994 9********不显著
由表5可知，该模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P值=0.994 9＞0.05），说明该回归模型可靠。另外，模型的决定系数R2=0.987 1，调整决定系数R2Adj=0.970 5，说明拟合程度良好，表明该回归模型可用于综合得分值的预测。由P值可知，一次项A、B、C，交互项AC，二次项A2、B2、C2对综合评分值影响极显著（P＜0.01），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）；由F值可知，影响Z综合得分的因素顺序为：菌株Y2接种量（B）＞菌株Y1接种量（A）＞菌株Y3接种量（C）。
2.3.2 各因素间交互作用的响应面分析
响应面越陡峭、等高线图越接近椭圆，说明两因素间交互作用对响应值的影响越大[30]。各因素间交互作用对Z综合得分影响的响应曲面及等高线见图2。
图2 菌株Y1、Y3接种量间交互作用影响综合得分值的响应面及等高线
Fig.2 Response surface and contour lines of the effect of the interaction between strain Y1 and Y3 inoculum on the overall score value
由图2可知，交互项AC的响应面较陡峭，等高线形状最接近椭圆，对Z综合得分的影响极显著（P＜0.01），这与方差分析结果一致。
由Design-Expert 8.0.6软件预测出菌株Y1、Y2和Y3的接种量分别为6.9×108个/mL、2.7×108个/mL、1.5×108个/mL，在此优化条件下，Z综合得分理论值为513.107，为方便实际生产操作，将菌株接种量条件修正为：7.0×108个/mL、3.0×108个/mL、1.5×108个/mL，在此条件下进行3次平行验证试验，Z综合得分实际值为513.096，与预测值相差不大，验证了该模型具有较好的准确性。
2.4 酵母强化大曲的生产应用
对照曲与试验曲理化指标的检测结果见表6。
表6 对照曲与试验曲理化指标分析结果
Table 6 Analysis results of physicochemical indexes in control and experimental Daqu
液化力/[g·（g·h）-1]试验曲对照曲曲样 发酵力/[g·（g·72 h）-1]水分/%酸度/（mmol·10 g-1）糖化力/[mg·（g·h）-1]皮张/cm 3.46 0.66 13.36 13.58 1.17 1.08 994 932 0.22 0.66 1.12 1.06
由表6可知，经过酵母强化后，所生产的大曲发酵力、糖化力和液化力分别为3.46 g/（g·72 h）、994 mg/（g·h）、1.12 g/（g·h），与对照曲相比，分别提高了424%、6.7%和5.7%，尤其发酵力明显提升。所生产的大曲水分含量为13.36%，比对照曲降低0.22%，说明发酵能排出更多的水分，发酵比对照曲更良好；皮张为0.22 cm，比对照曲减少0.44 cm，说明残余淀粉减少，淀粉利用率提升，发酵更彻底；酸度为1.17 mmol/10 g，比对照曲增加0.09 mmol/10 g，说明复配酵母菌株活力增强，曲质更优良。
3 结论
本研究从中高温大曲中共分离纯化出8株菌株，其中，3株产酒性能良好的菌株Y1、Y2、Y3，其最佳接种量分别为7.0×108个/mL、3.0×108个/mL、1.5×108个/mL，在此优化复配条件下，主成分Z综合得分为513.096，采用该菌株生产的强化大曲发酵力、糖化力和液化力分别为3.46 g/（g·72 h）、994 mg/（g·h）、1.12 g/（g·h），比优化前提高了424%、6.7%和5.7%。
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