牦牛系川西及藏区主要特产之一，以天然优质牧草、无公害野草为主要食物，被誉为“高原之舟”[1]；牦牛肉以其“高蛋白、低脂肪、无污染”被广泛认为是绿色、健康、优质的蛋白来源[2]。其加工制品川味牦牛肉香肠是四川乃至西南地区的特色传统肉制品，常使用辣椒、花椒、胡椒等作为辅料，味重麻辣[3]，广受消费者青睐。牦牛肉自然发酵香肠主要是通过环境和原料肉中本身具有的微生物作用，这些微生物可能含有致病菌以及导致氨基酸脱羧形成生物胺，存在食用安全潜在风险，限制了川味牦牛肉香肠的产业化发展。近年来随着消费者对发酵产品品质安全的高度重视，许多性能优良、可以提高发酵产品质量、感官品质以及产品安全性的微生物发酵剂已成为发酵香肠研究的热点[4]。
微生物的种类和作用是发酵香肠品质特征形成的重要因素之一，在肉制品发酵过程中，微生物参与发挥水解蛋白质和分解脂质的作用，不仅可以改善产品的品质、提高营养价值，还可以提高产品的安全性[5]。功能性发酵剂是指能在香肠中发挥理想代谢活性的微生物制剂，其研究主要集中在乳酸菌、凝固酶阴性的葡萄球菌、酵母菌及霉菌等方面[6-7]。研究表明，人工接种乳酸菌发酵剂能够加速牦牛肉香肠的产酸速率，抑制一些不耐酸有害微生物的生长，改善香肠理化特性，同时促进挥发性风味物质的生成，更好提升香肠的口感，延长产品的保质期[8]。李木子等[9]研究表明，弯曲乳杆菌在液体培养基中具有降低亚硝胺的能力；翟钰佳[10]研究筛选出了不产生物胺且具有较强胺氧化酶活性的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。目前，发酵牦牛肉香肠仍存在亚硝酸盐含量超标、品质不稳定问题，因此，探讨有助于川味牦牛肉香肠保持风味独特、营养健康的微生物发酵剂是一项很有经济意义的工作。
本研究以具有四川传统特色的川味牦牛肉香肠为研究对象，分别接种弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）（LC）、植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）（LP）以及其复配菌（1∶1）（FP）制作川味牦牛肉香肠，以自然发酵（CK）为对照组，在3 ℃下贮藏7 d后，测定其理化及微生物指标、颜色参数、质构、挥发性香气及感官品质，以期探究微生物发酵剂对川味牦牛肉发酵香肠品质指标的影响，为其发酵工艺的优化和产品品质的提高提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜牦牛后腿肉、猪肥膘、食盐、辣椒粉、料酒、花椒粉等：市售；弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）Y15、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CM25：烹饪科学四川省高校重点实验室；菌落总数测试片：广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司；丙二醛检测试剂盒：江苏艾迪生生物科技有限公司；硼砂、盐酸、乙酸锌、亚铁氰化钾（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
FOX 4000电子鼻：法国Alpha MOS公司；TMS-PRO型食品物性分析仪：美国FTC公司；UV BlueStar A紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器有限公司；DC-P3新型全自动测色色差计：北京兴光测色仪器有限公司；S470 pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 川味牦牛肉发酵香肠的制作工艺流程及操作要点
操作要点：
预处理：将牦牛肉清洗除去筋膜、筋腱，切成大小一致的肉块（1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm），沥干表面的水分。
腌制：将牦牛肉与猪肥膘按照质量比8∶2混合，添加2%食盐、3%辣椒粉、1%花椒粉、0.1%五香粉、0.1%姜粉、1%蔗糖、0.1%味精、2%料酒（均以肉质量计），充分混匀后放置于（3±1）℃的冰箱腌制24 h。
活化、接种：准确称取10.0 g脱脂奶粉和1.50 g葡萄糖溶于100 mL蒸馏水中，加入2.0 g菌粉搅拌，在（25±1）℃活化2 h；对腌制完成的原料进行接种，接种量为107 CFU/g。实验分为4组，未添加菌自然发酵对照组（CK）、添加弯曲乳杆菌组（LC）、添加植物乳杆菌组（LP）、添加弯曲乳杆菌组与植物乳杆菌组复配菌组（质量比1∶1）（FP）。
灌肠：将肉馅灌于猪小肠衣内，使每节肠长度在10 cm左右，用线绳结扎并用排气针有规律的扎眼，排除肠体内部的空气。
发酵、干燥成熟：发酵温度为（25±1）℃，相对湿度为80%，发酵5 d，然后将香肠移至阴凉通风的环境下（15～20 ℃）继续风干发酵5 d。
成品：真空包装后的成品置于3 ℃下保藏7 d后即得川味牦牛肉发酵香肠成品。
1.3.2 分析检测
pH值的测定：参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》；亚硝酸盐含量的测定：参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中分光光度法；丙二醛的测定：参照试剂盒说明操作，结果表示为每毫克肉样所含丙二醛含量（nmol/mg）；菌落总数的测定：参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》。
1.3.3 颜色参数的测定
将香肠切成2 cm厚的切片，通过白板进行仪器校准，使用校正后的色差仪测定其L*值、a*值和b*值。
1.3.4 质构的测定
参考赵改名等[11]的方法略作修改。将川味牦牛肉发酵香肠去除肠衣后切成3 cm厚的柱状，使用P50探头对香肠质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）。测定指标为硬度、内聚性、弹性、胶粘性、咀嚼性。设定测定参数为：初始力5 N，压缩比50%，测试速度：60 mm/min，深度20 mm，最小感应力0.38 N，停顿5 s。
1.3.5 挥发性香气的测定
参照杨长平等[12]的方法稍作修改，将川味牦牛肉香肠去除肠衣并充分剁碎，准确称量1.0 g均匀的肉糜于15 mL顶空瓶中，用硅胶隔垫密封，于室温静置30 min后采用顶空吸气法进行分析。参数为：间隔时间1 s，传感器自动清洗时间80 s，归零时间10 s，进样准备时间5 s，采样测定时间100 s，进样流量300 mL/min。为确保试验数据可靠性，选取较为平稳的3组数据进行分析。电子鼻传感器性能特点见表1。
表1 电子鼻传感器性能特点
Table 1 Performance characteristics of electronic nose sensors
序号传感器名称 性能 敏感性成分1 2 LY2/LG LY2/G对氧化能力较强的气体敏感对有毒气体敏感氯、氟、氮氧化合物、硫化物氨、胺类化合物、碳氧化合物
续表
序号传感器名称 性能 敏感性成分3456 7891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 LY2/AA LY2/GH LY2/gCT1 LY2/gCT T30/1 P10/1 P10/2 P40/1 T70/2 PA/2 P30/1 P40/2 P30/2 T40/2 T40/1 TA/2对有机化合物敏感对有毒气体敏感对有毒气体敏感对易燃气体敏感对极性化合物敏感对非极性化合物敏感对非极性易燃气体敏感对氧化能力较强的气体敏感对芳香族化合物敏感对有机化合物、有毒气体敏感对可燃气体、有机化合物敏感对氧化能力较强的气体敏感对有机化合物敏感对氧化能力较强的气体敏感对氧化能力较强的气体敏感对有机化合物敏感乙醇、丙醇、氨氨、胺类化合物硫化氢丙烷、丁烷极性化合物、氯化氢碳氢化合物、氨、氯甲烷、乙烷氟、氯甲苯、二甲苯、一氧化碳乙醇、氨水、胺类化合物碳氢化合物、氨、乙醇氯、硫化氢、氟化物硫化氢、酮氯氟乙醇
1.3.6 感官评价
参考李一鸣等[13]的方法稍作修改，邀请10名（男女各5名）经感官评分学习的专业人员组成评定小组。分别从外观、滋味、质地、气味4个方面进行评价，满分80分，具体评定标准见表2。
表2 川味牦牛肉发酵香肠感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fermented sausages of Sichuan yak sausage
指标 （15～20分）感官评价（8～14分） （0～7分）外观滋味质地气味颜色亮红有光泽，肠衣干燥无破损，紧贴肉馅咸淡适中，后味饱满，余味浓烈肉馅紧实，切面坚实整齐，无裂隙浓郁发酵味，香辛料气味适度，无异味颜色呈浅红色，肠衣略湿润，轻微破损咸淡尚可，余味较强烈，轻微发酵味肉馅不紧实，切面整齐，有裂隙但不明显发酵味略淡，香辛料气味弱，有轻微异味颜色灰红发暗，肠衣湿润，与肉馅贴合度一般偏咸或偏淡，余味弱肉馅松软，切面不齐，有明显裂隙香味淡，香辛料气味不明显，有异味
1.3.7 数据处理
对以上实验测得的数据使用Excel 2019统计处理，每个样品重复测定3次，结果表示为“平均值±标准差”；应用IBM SPSS Statistics 26进行显著性分析，P＜0.05 表示差异显著；应用Origin 2021绘图分析。
2 结果与分析
2.1 发酵剂对川味牦牛肉香肠pH值的影响
在川味牦牛肉香肠发酵过程中，pH值的高低会影响发酵肉的颜色、嫩度、感官以及风味。乳酸菌作为发酵剂在适宜温度和湿度条件通过代谢作用会分解碳水化合物产生乳酸、乙酸等有机酸类物质[14]，使pH值降低。由图1可知，四组香肠的pH值均在适宜范围内（5.117～5.345），pH值过高或过低均会对香肠的风味产生不良影响[15]。CK组pH值显著高于接种发酵剂的处理组（P＜0.05）；LC、LP组pH值接近，而复配菌组（FP组）pH值最低，为5.117。两种菌在发酵阶段适宜温、湿度条件下具有快速产酸的能力，使pH值保持在较低范围内，有效防止因杂菌过度增殖造成的产品腐败变质现象，延长发酵产品的货架期[17]，这与冯美琴等[16]的研究结果一致。
图1 微生物发酵剂对川味牦牛肉香肠pH值的影响
Fig.1 Effect of microbial starter culture on pH value of Sichuan yak sausage
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.2 发酵剂对川味牦牛肉香肠亚硝酸盐含量的影响
亚硝酸盐是发酵香肠中常用的发色剂，在肉制品加工中占据“统治”地位，但其易生成具有致癌性的亚硝基化合物危害人体健康[18]。
由图2可知，4组川味牦牛肉香肠的亚硝酸盐含量均不超过食品中亚硝酸盐残留量的安全标准限值（30 mg/kg）。CK组亚硝酸盐残留量为5.55 mg/kg，显著高于其他3组（P＜0.05），LC组、LP组、FP组的亚硝酸盐残留量分别为3.86mg/kg、3.80 mg/kg、2.50 mg/kg，这可能是因为CK组没有接种发酵剂，乳酸菌数量相对较少，对形成亚硝酸盐的抑制能力较弱。而FP组接种了弯曲乳杆菌和植物乳杆菌，产酸较多，pH值较低，pH值同亚硝酸盐的降低值具有相关性，pH值越小，发酵后亚硝酸盐降低值越大[19]，因此FP组亚硝酸盐残留量处于最低水平，该结果与王德宝等[20]报道的接种清酒乳杆菌、木糖葡萄球菌及肉葡萄球菌复合发酵剂香肠的结果相似。上述结果表明，微生物发酵剂有助于抑制亚硝酸盐的形成[21]，提高川味牦牛肉发酵香肠食用的安全性，且弯曲乳杆菌和植物乳杆菌两种菌复配使用效果更理想。
图2 微生物发酵剂对川味牦牛肉香肠亚硝酸盐含量的影响
Fig.2 Effect of microbial starter culture on nitrite content of Sichuan yak sausage
2.3 发酵剂对川味牦牛肉香肠丙二醛含量的影响
丙二醛是脂肪的氧化终产物之一，它与硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）在一定条件下发生反应产生红色物质，因此TBA值是评价肉制品脂肪氧化程度最常用的指标之一，丙二醛含量越高，脂肪氧化程度越深[22]。由图3可知，CK组脂肪氧化程度始终显著高于其他3组（P＜0.05），丙二醛含量高达1.22 nmol/mg，是复配菌组含量（0.52 nmol/mg）的2.35倍，LC组、LP组丙二醛含量分别为0.79 nmol/mg、0.74 nmol/mg。通力嘎[23]利用植物乳杆菌与木糖葡萄球菌混合制作发酵香肠，混合菌种组TBA值显著下降，与本实验结果相同。可能是由于乳酸菌在肉类发酵过程中能够产生超氧化物歧化酶、过氧化氢酶分解过氧化物，从而抑制脂肪氧化酸败[24]，有利于防止发酵肉制品脂肪因过度氧化产生酸败味和哈喇味等不愉快气味。该结果说明弯曲乳杆菌和植物乳杆菌的添加降低了丙二醛的生成，减缓了香肠的脂肪氧化程度，且两种发酵剂混合使用效果更佳。
图3 微生物发酵剂对川味牦牛肉香肠丙二醛含量的影响
Fig.3 Effect of microbial starter culture on malondialdehyde content of Sichuan yak sausage
2.4 发酵剂对川味牦牛肉香肠颜色参数的影响
发酵香肠的颜色与其品质密切相关[25]。L*值代表香肠肉样的亮度，该值越高说明产品光泽度越好；a*值代表红度值，b*值代表黄度值，a*值越大说明产品色泽越好，新鲜度越高，而b*值相反[26]。4组川味牦牛肉香肠的颜色参数见表3。由表3可知，FP组L*值、a*值均最大，分别为58.52和19.93，LP组次之，这与HWANG K E等[27]的研究结果类似。各处理组的颜色参数与空白对照组差异显著（P＜0.05），LC组和LP组的b*值差异不显著（P＞0.05），但均显著低于CK组（P＜0.05）。说明在川味牦牛肉香肠中添加微生物发酵剂能够对香肠的颜色产生积极影响，延缓色泽的衰退提高稳定性，其中两种发酵剂的复配使用对香肠的色泽提升作用最明显。
表3 微生物发酵剂对川味牦牛肉香肠颜色参数的影响
Table 3 Effect of microbial starter culture on color parameter of Sichuan yak sausage
注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
组别 L*值 a*值 b*值CK LC LP FP 50.22±0.21d 52.63±0.23c 53.39±0.15b 58.52±0.06a 14.57±0.08d 15.76±0.09c 16.38±0.04b 19.93±0.04a 18.15±0.42a 17.46±0.14b 17.57±0.22b 15.06±0.01c
2.5 发酵剂对川味牦牛肉香肠质构特性的影响
品质上乘的牦牛肉香肠应具有硬度适宜，组织结构紧致，切片富有弹性等优良品质[28]。发酵剂对川味牦牛肉香肠质构特性的影响见表4。由表4可知，各组牦牛肉香肠质构特性差异显著（P＜0.05），FP组的硬度值、内聚性、弹性、胶粘性、咀嚼性均高于其他组。有文献报道，乳酸菌的蛋白分解作用会导致巯基基团减少，使产品的硬度增加，肠体更加紧密[29]。内聚性是香肠切片性的重要特征，添加发酵剂对牦牛肉香肠的内聚性提高效果显著。LC组、LP组的内聚性、弹性、胶粘性无显著差异（P＞0.05），而香肠的咀嚼性与硬度差异显著（P＜0.05），CK组咀嚼性仅为101.087 mJ，而FP组高达299.287 mJ，香肠更有嚼劲。可见发酵剂对改善牦牛肉香肠的质构具有重要作用，且FP组效果最好。
表4 微生物发酵剂对川味牦牛肉香肠质构特性的影响
Table 4 Effect of microbial starter culture on texture characteristics of Sichuan yak sausage
组别 硬度/N 内聚性 弹性/mm 胶粘性/N 咀嚼性/mJ CK LC LP FP 64.757±1.584d 69.510±0.851c 74.283±1.321b 85.833±0.102a 0.560±0.017c 0.663±0.006b 0.640±0.010b 0.700±0.020a 2.570±0.235c 3.290±0.020b 3.437±0.051b 3.903±0.124a 51.270±0.609c 54.127±1.709b 53.590±0.506b 59.110±0.180a 101.087±0.070d 187.297±0.228c 205.637±1.155b 299.287±0.407a
2.6 发酵剂对川味牦牛肉香肠挥发性香气的影响
川味牦牛肉香肠电子鼻雷分析达图及主成分分析见图4。由图4a可知，18根传感器对样品挥发性成分的响应不同。在LY2/LG～LY2/gCT传感器上，4种川味牦牛肉香肠的风味轮廓相似；其差异主要体现在T30/1～TA/2这12根传感器上，CK组的响应值明显低于其他3种发酵香肠，4种香肠对相应于氨、醇的P30/1传感器响应值最大，其次是对应乙醛、胺类化合物的PA/2传感器。因此，醇、胺类含量的差异可能是影响4组发酵香肠挥发性香气差异的主要物质，添加微生物发酵剂能使川味牦牛肉香肠产生更多的乙醇。
图4 川味牦牛肉香肠电子鼻分析雷达图（a）及主成分分析（b）
Fig.4 Sichuan yak sausage electronic nose analysis radar map (a)and principal component analysis (b)
由图4b可知，第一主成分（principal components1，PC1）方差贡献率为97.0%，第二主成分（PC2）方差贡献率为2.5%，累计方差贡献率99.5%，说明电子鼻对香肠香气化合物的信息提取较为完整。从4种香肠分布距离来看，CK组单独集中分布在第三象限，与其他3组香肠组间距离较大，说明自然发酵的香肠与加入发酵剂的香肠香气差异显著，且在PC1、PC2方向上差异均明显。LC组和FP组均分布在第二象限，说明添加弯曲乳杆菌和复配菌组香肠的挥发性香气成分比较接近。因此，添加微生物发酵剂会使川味牦牛肉香肠的香气成分差异变大。
2.7 发酵剂对川味牦牛肉香肠菌落总数的影响
发酵剂对川味牦牛肉香肠菌落总数的影响见图5。由图5可知，各组川味牦牛肉香肠菌落总数从低到高排序为CK组＜LC组＜LP组＜FP组，LC组、LP组菌落总数分别为8.00 lg（CFU/g）、9.00 lg（CFU/g），差异不显著（P＞0.05）。FP组菌落总数为10.17 lg CFU/g，显著高于CK组（6.50 lg（CFU/g））（P＜0.05）。在川味牦牛肉香肠的发酵过程中，原料肉自身携带有优势微生物，而发酵剂的添加使产品在发酵过程优势菌快速生长繁殖，数量增加。复配菌组接种了弯曲和植物两种乳杆菌，效果更明显，可能与接种微生物的种类有关，段艳等[30]的研究表明，乳酸菌是发酵香肠中的优势菌且植物乳杆菌的添加使其优势更加明显。乳酸菌在发酵过程中产酸使pH降低，可以抑制腐败菌和病原菌的生长来防止异味和酸败的形成，改善川味牦牛肉香肠制品的风味。
图5 微生物发酵剂对川味牦牛肉香肠菌落总数的影响
Fig.5 Effect of microbial starter culture on the total number of colonies of Sichuan yak sausage
2.8 发酵剂对川味牦牛肉香肠感官品质的影响
川味牦牛肉香肠各实验组的感官评分结果见图6。由图6可知，添加了发酵剂的处理组各项指标均优于CK组，其中，FP组川味牦牛肉香肠感官评分最高，为72.7分。LC组、LP组、FP组川味牦牛肉香肠在外观、质地以及气味方面评分较高，但差异不显著（P＞0.05）；从滋味来看，FP组评分与其他组有显著差异（P＜0.05），评分高达18.4分。表明微生物发酵剂的添加促进了蛋白质、脂肪分解生成风味物质，提高川味牦牛肉香肠的滋气味[31]，同时改善产品的色泽，使产品更加符合消费者的口感要求，提高其接受度。因此复配菌组发酵制得的川味牦牛肉香肠品质更优且更适合生产与推广。
图6 微生物发酵剂对川味牦牛肉香肠感官品质的影响
Fig.6 Effect of microbial starter culture on sensory quality of Sichuan yak sausage
3 结论
该实验研究微生物发酵剂对川味牦牛肉香肠品质指标的影响。添加微生物发酵剂能降低产品pH值，抑制亚硝酸盐的生成，减缓香肠脂肪氧化酸败的程度，提高抑菌能力；其中复配菌组的各项指标均在不同程度上优于自然发酵组，色泽亮红，弹性好；同时感官评分结果表明，接种发酵剂具有一定改善香肠滋气味和外观的效果，可以更好弥补香肠中为提高安全性而带来口感上的缺失。因此，添加发酵剂能改善川味牦牛肉香肠的品质和食用安全性，其中采用弯曲乳杆菌和植物乳杆菌复配（1∶1）所生产出来的川味牦牛肉香肠的品质最优，可以为后续进一步研究两种复配菌发酵剂提供理论基础。
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