阿魏酸（ferulic acid，FA）全称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，广泛存在于麸皮、米糠、咖啡、甜菜粕、谷壳等食品原料及副产物中，是一种天然的植物酚酸类物质[1-2]。阿魏酸具有抗氧化[3-5]、抑菌消炎[6-7]、降血脂[8]、抗肿瘤抗癌[9-10]等良好的生理保健功能，是公认的天然抗氧化剂。在国际上，一些国家已批准将其作为食品添加剂应用于食品[11-12]。但阿魏酸在植物细胞壁中通常以酯键或醚键形式与细胞壁多糖、木质素交联，多为结合态，无法发挥出最佳生理活性[13]。制备游离态阿魏酸的方法主要有直接从植物中提取、化学合成法以及生物合成法三类，相比碱水解法、化学法，微生物发酵法生产成本更低且绿色环保。
阿魏酸酯酶（feruloyl esterase，FAE）（E.C.3.1.1.73）属羧酸酯水解酶亚类，能高效降解植物细胞壁，水解断裂羟基化肉桂酸与多糖之间交联酯键，释放生物活性成分—游离态阿魏酸及其衍生物[14]。自然界中，包括细菌、真菌和酵母在内的超过30种微生物均能分泌阿魏酸酯酶，大多数为丝状真菌[15]，如黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、泡盛曲霉（Aspergillus awamori）、宇佐美曲霉（Aspergillus usamil）等。真菌中以黑曲霉研究居多[16-17]，主要通过微生物固态发酵分泌表达FAE。赵浩源等[18]以麦麸和甘蔗渣质量比2∶1混合作为基质，采用黑曲霉在30 ℃发酵7 d，阿魏酸酯酶活力最高为8.2 U/g；李松等[19]筛选出一株土曲霉（Aspergillus terreus），通过优化液态发酵条件，阿魏酸酯酶酶活达205 U/L；SHIN H Y等[20]研究发现，利用泡盛曲霉或米曲霉固态发酵黑米糠，可以提高黑米糠醇提物的抗氧化活性，其中原儿茶酸和阿魏酸含量显著增加；方园等[21]将泡盛曲霉接种在以麸皮和蔗渣为固态发酵底物的培养基中，通过培养基成分优化，得到最高FAE酶活达0.067 9 U/g。随着阿魏酸酯酶不断扩大应用范围，更多学者致力于寻求能产阿魏酸酯酶的优良菌株，但目前优化泡盛曲霉发酵产阿魏酸酯酶工艺的研究较少。
本研究以泡盛曲霉（Aspergillusawamori）CGMCC3.2576为研究对象，以FAE酶活性为响应值，利用单因素试验结合响应面法对该菌种发酵产FAE的条件进行优化，得出最佳产酶条件，以期进一步提高阿魏酸酯酶活性，为阿魏酸酯酶有效释放产品中阿魏酸提供参考和数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种泡盛曲霉（Aspergillus awamori）CGMCC3.2576：中国普通微生物菌种保藏中心。
1.1.2 试剂
葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、甘油、酵母浸粉、蛋白胨、硫酸铵、硝酸钠、尿素、无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司；淀粉酶（10 000 U/g）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司。本研究所用试剂均为分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
初始固态发酵培养基[22]：麸皮与水按1∶1（g∶mL）混合，250 mL锥形瓶中装量10 g，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
查氏培养基[23]：蔗糖30 g，NaNO3 3 g，KCl 0.5 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂15 g，水1 000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
SPL-250生化培养箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；UV-2600紫外分光光度计：日本Shimadzu公司；Heal Force台式高速冷冻离心机：力康生物医疗科技控股有限公司；高压灭菌器GI54DWS：武汉递热爱生物科技有限公司；VD-1320型洁净工作台：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。
1.3 方法
1.3.1 泡盛曲霉CGMCC3.2576的固态发酵
取已经培养好的斜面试管一支，加入5 mL无菌水，将表面的泡盛曲霉CGMCC3.2576孢子刮下，放入预先装有玻璃珠的三角瓶中，振荡0.5 h，将孢子悬液打散，过滤得孢子悬液，调节孢子悬液浓度为107～108个/mL。将泡盛曲霉CGMCC3.2576孢子悬液按2%的接种量接种至初始固态发酵培养基，28 ℃培养5 d。
1.3.2 阿魏酸酯酶酶活性的测定
酶解底物的制备[24]：取100 g新鲜麦麸于烧杯中，加入1 000 mL 60～70 ℃热水，pH 5.5～7.7之间，搅拌均匀，加入0.3%淀粉酶，55 ℃水浴加热30 min，pH值调至中性，加入0.3%的中性蛋白酶，40 ℃水浴加热45 min，沸水浴灭酶，干燥粉碎。
粗酶液的制备[25]：向发酵后的麸皮培养基中加入90 mL去离子水，28 ℃浸提1 h后过滤，滤液于4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集发酵上清液即为粗酶液，4 ℃储存。
酶活性的测定[26]：取0.5 mL粗酶液，加入pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液至反应体系为10 mL，加入0.2 g酶解底物，40 ℃恒温反应15 min，沸水浴灭酶，离心收集上清液。按上清液与无水乙醇体积比1∶4加入无水乙醇，混匀后离心，测定上清液在波长320 nm处吸光度值。以不接种微生物的发酵培养基提取液替代粗酶液为空白对照，计算酶活。
阿魏酸酯酶酶活性定义：在温度50 ℃、pH6.0条件下，每分钟水解阿魏酸乙酯，生成1 μmol阿魏酸所需酶量，定义为一个酶活力单位（mU/mL）。
1.3.3 泡盛曲霉CGMCC3.2576固态发酵产阿魏酸酯酶条
件优化
（1）单因素试验
采用单因素轮换法，在初始发酵条件的基础上，依次考察发酵时间（2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、碳源种类（葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、甘油，10 g/L）及最佳碳源添加量（5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L、20.0 g/L、25.0 g/L、30.0 g/L）、氮源种类（酵母浸粉、蛋白胨、硫酸铵、硝酸钠、尿素，2 g/L）及最佳氮源添加量（2.0 g/L、4.0 g/L、6.0 g/L、8.0 g/L、10.0 g/L、12.0 g/L）、接种量（2%、4%、6%、8%、10%、12%）对泡盛曲霉产阿魏酸酯酶的影响。
（2）响应面试验
在单因素试验基础上，选取发酵时间（A）、葡萄糖添加量（B）、酵母浸粉添加量（C）、接种量（D）四个因素为自变量，以阿魏酸酯酶酶活性（Y）为响应值，采用Design-Expert 13.0.1.0软件设计4因素3水平的Box-Behnken响应面分析试验，试验设计因素与水平见表1。
表1 泡盛曲霉CGMCC3.2576固态发酵产阿魏酸酯酶条件优化响应面试验设计因素及水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for optimization of solid-state fermentation conditions for feruloyl esterase production by Aspergillus awamori CGMCC3.2576
水平 A 发酵时间/d D 接种量/%-1 B 葡萄糖添加量/（g·L-1）C 酵母浸粉添加量/（g·L-1）8 0 1 3 4 5 10 15 20 2 4 6 10 12
1.3.4 数据处理与统计分析
采用IBM SPSS Statistics 20进行显著性分析，所有试验均重复3次，结果以“平均值±标准差”表示；采用Origin 2019绘图。
2 结果与分析
2.1 泡盛曲霉CGMCC3.2576固态发酵产阿魏酸酯酶条件优化单因素试验
2.1.1 发酵时间对阿魏酸酯酶活性的影响
发酵时间对泡盛曲霉CGMCC3.2576产阿魏酸酯酶活力的影响见图1。
图1 发酵时间对泡盛曲霉CGMCC3.2576产阿魏酸酯酶酶活性的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on the activities of feruloyl esterase produced by Aspergillus awamori CGMCC3.2576
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1可知，随着发酵时间的延长，FAE活性呈先升高后下降的趋势，当发酵时间为4 d时，FAE酶活性最高，为（1 496.60±56.64）mU/mL。分析原因可能是酶在发酵开始时产生缓慢，直到达到酶活力最高值，微生物代谢产物增加，阻碍发酵继续进行，酶活性随之降低[27]。因此，选择最佳发酵时间为4 d。
2.1.2 碳源及葡萄糖添加量对阿魏酸酯酶活性的影响
不同碳源及葡萄糖添加量对泡盛曲霉CGMCC3.2576产阿魏酸酯酶活力的影响见图2。
图2 碳源种类（A）及葡萄糖添加量（B）对泡盛曲霉CGMCC3.2576产阿魏酸酯酶酶活性的影响
Fig.2 Effects of carbon source types (A) and glucose addition (B)on the activities of feruloyl esterase produced by Aspergillus awamori CGMCC3.2576
细胞合成和分泌酶受到多种因素调控，其中发酵底物是提高菌种产酶量的关键[28]。由图2A可知，在葡萄糖作为唯一添加碳源时，FAE酶活性最高，达到（2 554.80±111.13）mU/mL，其次是蔗糖，FAE酶活为（2 261.53±30.23）mU/mL。因此，确定最佳碳源为葡萄糖。
由图2B可知，随着葡萄糖添加量的升高，FAE酶活性呈现先升高后下降的趋势，可能是葡萄糖添加量较低时，发酵培养基中营养物质含量低，微生物生长受到限制；而当葡萄糖添加量过多，培养基营养物质浓度过高，微生物菌体生长被抑制[29]。当葡萄糖添加量为15 g/L时，FAE酶活性最高为（2 666.67±71.99）mU/mL。因此，选择葡萄糖的最佳添加量为15 g/L。
2.1.3 氮源及酵母浸粉添加量对阿魏酸酯酶活性的影响
不同氮源及酵母浸粉添加量对泡盛曲霉CGMCC3.2576产阿魏酸酯酶活力的影响见图3。
图3 氮源种类（A）及酵母浸粉添加量（B）对泡盛曲霉CGMCC3.2576产阿魏酸酯酶酶活性的影响
Fig.3 Effects of nitrogen source types (A) and yeast extract powder addition (B) on the activities of feruloyl esterase produced by Aspergillus awamori CGMCC3.2576
阿魏酸酯酶等微生物分泌的酶系，其本质上是蛋白质，而菌体分泌蛋白质的关键营养因素是氮源[30]。由图3A可知，采用酵母浸粉为唯一氮源时，FAE酶活性最高，达（3 368.10±37.89）mU/mL，其次为蛋白胨，FAE酶活为（2 923.66±21.80）mU/mL。分析原因可能是酵母浸粉作为蛋白质类原料的水解产物，含有多种易被微生物所利用的含氮有机化合物及核苷酸等微量元素，促进微生物生长和产酶[31]。因此，确定最佳氮源为酵母浸粉。
由图3B可知，随着酵母浸粉添加量逐渐增加，FAE活性呈现先上升后降低的趋势。当酵母浸粉添加量为4 g/L时，FAE活性最高，为（3 383.22±23.99）mU/mL。因此，选择酵母浸粉的最佳添加量为4 g/L。
2.1.4 泡盛曲霉CGMCC3.2576接种量对阿魏酸酯酶活性的影响
微生物发酵产酶活性不仅与产酶菌种优良的生长条件及营养条件有关，控制发酵条件也十分必要。泡盛曲霉CGMCC3.2576接种量对阿魏酸酯酶活性的影响见图4。
图4 泡盛曲霉CGMCC3.2576接种量对产阿魏酸酯酶酶活性的影响
Fig.4 Effect of Aspergillus awamori CGMCC3.2576 inoculum on feruloyl esterase activities
由图4可知，随着接种量的升高，阿魏酸酯酶活力呈先升高后下降的趋势，分析原因可能是，接种量影响微生物在培养基中发酵速度和产酶效率，接种量过低时，固态发酵培养基中碳源、氮源等营养物质充足，菌株可以快速生长增殖并发酵分泌更多所需酶；但接种量过高，营养物质匮乏，菌株生长受到抑制，进而导致酶的分泌量减少。当泡盛曲霉CGMCC3.2576接种量为10%时，FAE活性最高，为（3 879.06±34.07）mU/mL。因此，选择最佳接种量为10%。
2.2 泡盛曲霉CGMCC3.2576固态发酵产阿魏酸酯酶条件优化Box-Behnken响应面试验
在单因素试验基础上，选取发酵时间（A）、葡萄糖添加量（B）、酵母浸粉添加量（C）、接种量（D）4个因素为自变量，以阿魏酸酯酶活性（Y）为响应值，采用Design-Expert 13.0.1.0软件设计4因素3水平的Box-Behnken响应面分析试验，试验设计及结果见表2，方差分析见表3。
表2 Box-Benhnken响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments
试验号 A B C D Y 阿魏酸酯酶活性/（mU·mL-1）1 2 3 4 5 0 1-1 1 0 0-1 0-1 0 0 0 -1 0 0 1 0 0 -1 0 2 566.893±56.21 3 102.041±77.14 3 092.971±104.12 3 346.939±24.01 3 863.946±25.27
续表
试验号 A B C D Y 阿魏酸酯酶活性/（mU·mL-1）67891 0 0010-1 0-1-1 110-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29-1 000-1100-001000-1-1 11001-1 10010010-10001--1 10000000-01001000 10000000-1001-111-101000-11 10010-1 1010 3 210.884±55.14 3 147.392±72.60 2 639.456±61.22 3 183.673±35.64 3 074.830±64.18 2 938.776±55.80 3 746.032±14.38 3 256.236±29.10 3 183.673±22.58 3 002.268±47.55 3 011.338±85.24 3 764.172±63.27 3 882.086±77.14 2 829.932±69.15 3 092.971±17.38 2 829.932±104.27 2 965.986±66.45 2 639.456±82.96 3 029.478±11.57 3 845.805±55.62 3 092.971±36.74 2 521.542±74.50 3 283.447±59.71 3 210.884±33.96
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。
来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性回归模型*********14 ABCDA B AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2 39.2 6.4 41.02 12.91 21.67 1.55 17.36 1.06 23.2 10.9 1.06 233.14 165.3 148.05 79.72＜0.000 1 0.024 0＜0.000 1 0.002 9 0.000 4 0.233 7 0.000 9 0.321 3 0.000 3 0.005 3 0.321 3＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1**************残差失拟项纯误差总离差3 854 000 44 981.26 288 100 90 668.67 152 200 10 880.24 121 900 7 424.89 162 900 76 531.9 7 424.89 1 637 000 1 161 000 1 040 000 559 900 98 323.92 83 284.91 15 039 3 953 000 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 10 4 28 275 300 44 981.26 288 100 90 668.67 152 200 10 880.24 121 900 7 424.89 162 900 76 531.9 7 424.89 1 637 000 1 161 000 1 040 000 559 900 7 023.14 8 328.49 3 759.75 2.22 0.230 5
通过Design-Expert 13.0.1.0软件对表2数据进行多元线性回归分析，得到二次多项式方程为：Y=3 820.41-61.22A-154.95B-86.92C-112.62D-52.15AB-174.60AC-43.08AD-201.81BC-138.32BD-43.08CD-502.42A2-423.05B2-400.38C 2-293.80D2。
由表3可知，模型F值=39.20，P值＜0.01，极显著，失拟项P值=0.230 5＞0.05，不显著，表明模型具有良好的拟合度，能与数据较好拟合。在回归模型中，决定系数R2=0.975 1，调整决定系数R2Adj=0.950 3，说明该模型可以解释95.03%的FAE酶活性变化，表明该模型建立成功，并可以利用该模型对泡盛曲霉产酶进行理论分析及预测。由表3亦可知，各因素对泡盛曲霉CGMCC3.2576产FAE活性的影响大小依次为：葡萄糖添加量＞微生物接种量＞酵母浸粉添加量＞发酵时间。一次项B、C、D，交互项AC、BC、BD及二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。
通过Design-Expert 13.0.1.0软件绘制AC、BC、BD间交互作用对FAE酶活性影响的响应曲面及等高线，结果见图5。
图5 各因素间交互作用对泡盛曲霉CGMCC3.2576产阿魏酸酯酶酶活性影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the activities of feruloyl esterase produced by Aspergillus awamori CGMCC3.2576
由图5可知，响应面均呈凸面，存在最大值，且等高下均呈椭圆形，说明各因素间交互作用对泡盛曲霉固态发酵麸皮产FAE酶活力影响较大，与方差分析结果一致。
利用Design-Expert 13.0.1.0软件对回归方程进行求解，得到最优发酵工艺为：发酵时间3.96 d，葡萄糖添加量14.28 g/L，酵母浸粉3.88 g/L，接种量9.69%。该方程模拟预测的阿魏酸酯酶活性为3 843.57 mU/mL。为便于实际操作，将最优产酶条件修正为发酵时间4d，葡萄糖添加量14.28g/L，酵母浸粉3.88g/L，接种量9.70%。在此条件下进行3次平行验证试验，得到阿魏酸酯酶活性实际值为（3 912.32±34.34）mU/mL，与预测值相差1.75%，说明该模型适用于泡盛曲霉CGMCC 3.2576固态发酵产FAE酶活性工艺条件优化。
3 结论
本研究采用单因素试验及响应面试验，确定泡盛曲霉CGMCC3.2576发酵产FAE的最优条件为：发酵时间4 d，葡萄糖添加量14.28 g/L，酵母浸粉3.88 g/L，接种量9.70%。在此条件下，阿魏酸酯酶活性为3 912.32 mU/mL，为优化前的1.89倍。
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