过量饮酒或饮酒不当会引起严重的健康问题，全世界每年有300万人死于过量饮酒，占所有死亡人数的5.3%[1-3]。乙醇进入人体后主要在小肠中吸收[4]，随后穿过生物膜并分布到全身，在几乎所有组织中进入柠檬酸循环[5]。大脑、心脏、胃肠道和肝脏等多个器官的200多种疾病都与习惯性饮酒有关[6]。在这些酒精损伤的器官中，肝脏是体内酒精代谢的主要部位，因此更易受到损伤。因乙醇造成的肝组织疾病包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化和肝癌等[7-8]。
人们对如何解酒的探讨也是长盛不衰，目前，有关解酒的研究主要围绕中草药、果蔬、粮油类、畜产类等原料及其制品进行[9-13]，如解酒功能成分分析（主要为多糖、多肽、黄酮、酶等）及解酒酵素、复方制剂、保健凉茶的研制等[12-13]。其解酒原理主要集中在影响乙醇代谢或抑制乙醇吸收方向，如基于乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）参与的氧化代谢途径，通过加强乙醇的首过效应而达到解酒的目的[14]；或者基于保肝护肝的原理，通过代谢增强肝组织中超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）的活性，改善肝细胞的通透性等起到解酒护肝的作用[15]；或者减少、减慢胃和十二指肠对乙醇的吸收来实现解酒功能等[16]。这些醒酒方式虽具有一定解酒、醒酒功效，但也会伴随着不同的副作用，对人体健康不利。对此，微生物制剂以能够直接降解乙醇特点受到人们的广泛关注，刘威良等[17]筛选得到1株乙醇耐受性强的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），其在体积分数为20%的乙醇条件下培养24 h后，乙醇含量降为10%左右；在体积分数为40%的乙醇条件下培养24 h后，乙醇含量降为15%左右。杨小柏[18]从黄水和窖泥中筛选得到1株降解乙醇能力较强的菌株，其降解乙醇速度达1.45mL/d。
为了进一步研究开发具有解酒功能的益生菌，本研究采用传统培养分离法从传统发酵食品奶疙瘩中分离乳酸菌，通过乙醇降解能力的测定筛选具有降解乙醇功能的菌株，并通过形态观察、生理生化试验及分子生物技术对其进行菌种鉴定，同时，对其安全性及耐受性进行研究，并通过小鼠试验研究该菌株对体内防醉和解酒的功效，为其解酒应用提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与动物
传统发酵食品奶疙瘩样品：内蒙古呼伦贝尔额尔古纳市三河回族乡，无菌操作取样寄送至实验室，并于-20 ℃条件保存备用。
60只健康昆明小鼠，年龄6周，体质量25～30 g，雌雄各1/2，购自辽宁长生生物技术有限公司，生产许可SCXK（辽）2020-0001。动物在抵达后用标准饮食喂养一周后进行试验。环境温度维持在25 ℃左右，相对湿度控制在50%左右，光暗12 h循环。
1.1.2 培养基
MRS液体培养基[19]：酵母蛋白胨10 g/L，牛肉粉3 g/L，酵母浸出物4 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，一水柠檬酸2 g/L，乙酸钠5 g/L，无水葡萄糖20 g/L，硫酸镁0.58 g/L，硫酸锰0.25 g/L，吐温-80 0.6 g/L，番茄汁10 mL/L，调pH至6.5，115 ℃高压蒸汽灭菌30 min；MRS固体培养基：MRS液体培养基中添加2%琼脂。
改良的MRS固体培养基[19]：酵母蛋白胨10 g/L，牛肉粉3 g/L，酵母浸出物4 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，一水柠檬酸2 g/L，乙酸钠5 g/L，无水葡萄糖20 g/L，硫酸镁0.58 g/L，硫酸锰0.25 g/L，吐温-80 0.6 g/L，碳酸钙10 g/L，中性红0.05 g/L，番茄汁10 mL/L，琼脂粉20 g/L，调pH至5.5，115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
基础培养基：酵母蛋白胨10 g/L，酵母浸出物5 g/L，无水葡萄糖20 g/L，一水柠檬酸2 g/L，L-苹果酸3 g/L，乙酸钠5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.01 g/L，pH 6.60。115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
优化培养基：酵母蛋白胨10 g/L，酵母浸出物30 g/L，无水葡萄糖30 g/L，一水柠檬酸2 g/L，L-苹果酸3 g/L，乙酸钠5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.01 g/L，吐温80 0.1 g/L，氯化钙0.5 g/L，pH 6.60。115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
1.1.3 试剂
无水葡萄糖、三氯乙酸、苯酚（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；浓硫酸、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；重铬酸钾（纯度99%）：西陇科学股份有限公司。牛胆盐（纯度99.8%）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；盐酸、氢氧化钠（均为分析纯）、胃蛋白酶（酶活12 000 U/g）：北京奥博星生物技术有限公司；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）：生工生物工程（上海）股份有限公司；梅里埃21342革兰氏阳性细菌鉴定卡VITEK GP及配套试剂：法国生物梅里埃股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
DHP-500BS恒温培养箱：北京市永光明医疗仪器有限公司；LDZX-50KBS灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1D无菌操作台：上海沪净医疗器械有限公司；TGL-16M高速冷冻离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；EPOCH2NSC-SN酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；UPT-II-20T纯水仪：四川优普超纯科技有限公司；C20-F3E电磁炉：格兰仕生活电器制造有限公司；VITEK2 Compact全自动微生物分析系统：法国生物梅里埃股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 传统奶疙瘩样品中乳酸菌菌株的分离纯化
取适量奶疙瘩样品于MRS液体培养基中，37 ℃富集24 h。将富集后的样品混匀，采用无菌水按10倍梯度稀释，取不同梯度的稀释液涂布于改良的MRS固体培养基上，37 ℃条件下培养48 h。挑取菌落呈球状、细胞成对排列、无内生芽孢、革兰氏阳性的单菌落进行多次分离纯化，得到纯化菌株，4 ℃保存备用。
1.3.2 高效降解乙醇功能菌株的筛选
将分离纯化的菌株接种至5 mL MRS液体培养基中，37 ℃培养20 h后，取5 mL菌液接种至100 mL MRS液体培养基中，37 ℃培养17 h，作为种子液。
将分离菌株的种子液按5%的接种量接种于乙醇体积分数为10%的MRS液体培养基中，以乙醇体积分数为10%的MRS液体培养基为空白对照，37 ℃培养24 h。取培养好的菌液10 000 r/min离心10 min，取上清液，利用重铬酸钾-硫酸法测定乙醇含量，并计算乙醇降解率，分析各菌株的乙醇降解能力。乙醇降解率的计算公式如下：
式中：C0为空白对照中乙醇的体积分数，%；C为试验组中乙醇的体积分数，%。
1.3.3 筛选菌株的乙醇耐受性分析
将分离菌株的种子液按2%的接种量接种于不同乙醇体积分数（4%、6%、8%、10%、12%）的MRS液体培养基中，37 ℃进行乙醇胁迫12 h，同时以不含乙醇的MRS液体培养基培养组作为阴性对照，胁迫后采用紫外分光光度计在波长620 nm处测定OD620 nm值，比较其生长状况，并计算存活率，其计算公式如下：
式中：A1为含乙醇的MRS培养基培养12 h后的OD620nm值；A0为不含乙醇的MRS培养基培养12 h后的OD620nm值。
1.3.4 筛选菌株的鉴定
形态学观察：将筛选菌株接种至MRS固体培养基，37 ℃培养48 h，观察菌株形态。挑取单个菌落进行革兰氏染色，在生物显微镜下观察细胞形态。
生理生化鉴定：利用梅里埃21342革兰氏阳性细菌鉴定卡VITEK GP和VITEK2 Compact全自动微生物分析系统对筛选菌株进行生理生化鉴定。
分子生物学鉴定：参照文献[20]对筛选菌株进行分子生物学鉴定。
1.3.5 筛选菌株的安全性评价
药物敏感性试验：参照CLSI M45-A3《不常见或苛养菌药敏方法》（2015）标准执行。
溶血试验：参照文献[21]进行。
1.3.6 筛选菌株的耐酸及耐胆盐试验
耐酸及耐胆盐试验：将筛选菌株的种子液按10%的接种量分别接种于不同pH（2.0、3.0、6.5）及不同胆盐含量（0、0.3%、0.5%、1.0%和1.5%）的MRS液体培养基中，37 ℃静置培养，于培养0 h、1 h、2 h和4 h取样，用灭菌生理盐水按10倍梯度稀释后，取适宜稀释度的菌液1 mL接种于MRS固体培养基，37 ℃静置培养36 h后进行菌落计数[22]。
耐酸及耐胆盐延迟时间测定：将筛选菌株的种子液按10%的接种量分别接种于不同pH（2.0、3.0、6.5）及不同胆盐含量（0、0.3%、0.5%、1.0%和1.5%）的MRS液体培养基中，37 ℃静置培养。其中耐酸延迟时间试验在培养2 h后，按照10%的接种量转接在pH 6.5的MRS液体培养基中继续培养，耐胆盐延迟时间试验不进行转接。每隔30 min取样测定OD620 nm值，直到OD620 nm值增长0.3个单位时，停止测定。计算菌株在酸性/含胆盐培养基中与在pH6.5/胆盐含量0%的培养基中OD620nm值增加0.3个单位所需的时间，二者之差被称为延迟时间[22]。
1.3.7 筛选菌株耐胃液试验
人工模拟胃液的配制[22]：取稀盐酸16.4 mL，加蒸馏水800mL，加入胃蛋白酶10g，摇匀后用蒸馏水定容至1000mL，调节pH值至2.0，0.22 μm有机滤膜过滤除菌。
取菌悬液10 mL离心（5 000×g，10 min，4 ℃）获得菌泥，用PBS冲洗2次，获得的菌泥重悬于10 mL人工模拟胃液中，37 ℃条件下消化3 h，分别于0 h、3 h取样，用灭菌的生理盐水进行10倍梯度稀释，取适宜稀释度的菌液1 mL涂布于MRS固体培养基，37 ℃静置培养36 h后，进行菌落计数。
1.3.8 筛选菌株防醉和醒酒能力体内试验
按照10%的接种量将冻存管中复苏的菌体转接到10mL基础培养基中，37 ℃静置培养17 h，获得菌悬液。将该菌悬液转接到100 mL基础培养基中，37 ℃静置培养17 h。然后将该菌悬液以3%的接种量接种到200 mL优化培养基中，37 ℃静置培养17 h。培养结束后将其稀释为活菌数分别为1×107 CFU/mL、1×108 CFU/mL、1×109 CFU/mL的菌悬液，备用。
参考文献[23]，将60只小鼠随机分为10组，解酒试验和防醉试验各5组，每组6只，雌雄各占50%。根据常见市售白酒的酒精度，本试验小鼠在禁食12 h后，各组灌胃10 mL/kg体质量（body mass，bm）体积分数为50%的乙醇以建立醉酒模型。乙醇灌胃30 min前（防醉试验）及5 min后（解酒试验），阴性对照组（NC）灌胃10 mL/kg bm生理盐水，阳性对照组（PC）灌胃10 mL/kg bw美他多辛（约500 mg/kg bm），低（L）、中（M）、高（H）剂量组灌胃10 mL/kg bm菌悬液，活菌数分别为1×107 CFU/mL、1×108 CFU/mL、1×109 CFU/mL。记录5组小鼠翻正反射消失时间和翻正反射恢复时间，翻正反射消失时间的标准为小鼠仰卧保持30 s，否则认为翻正反射恢复。计算醉酒潜伏期（灌酒到翻正反射消失时间）、醒酒时间（翻正反射消失到翻正反射恢复时间）。
1.3.9 数据处理
每个试验重复3次平行测定，试验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，并利用Duncan's法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌的分离及高效降解乙醇菌株的筛选结果
采用传统培养分离法从奶疙瘩样品中共分离得到12株疑似乳酸菌菌株，其乙醇降解能力见图1。
图1 分离菌株的乙醇降解能力
Fig.1 Ethanol degradation abilities of isolated strains
由图1A可知，所有菌株均具有乙醇降解能力，乙醇降解率为1.15%～13.38%，其中，菌株RH2712的乙醇降解率最高为13.38%。因此，将菌株RH2712作为高效降解乙醇的目标菌株。
2.2 菌株RH2712的乙醇耐受性
菌株RH2712的乙醇耐受性试验结果见见图2。由图2可知，随着乙醇体积分数的增加，菌株RH2712存活率逐渐下降，当乙醇体积分数为10%时，菌株RH2712的存活率为45.34%；当乙醇体积分数为12%时，菌株RH2712的存活率仍可达34.20%，说明菌株RH2712具有较好的乙醇耐受性，可耐受体积分数为12%的乙醇。
图2 菌株RH2712的乙醇耐受性
Fig.2 Ethanol tolerance of strain RH2712
2.3 菌株RH2712的鉴定
2.3.1 形态观察
菌株RH2712的菌落及细胞形态见图3。由图3可知，菌株RH2712的菌落为白色，圆形，表面湿润，不透明，边缘整齐；细胞呈球状，直径为0.7～1.0 μm，单个或成对排列，革兰氏染色为阳性。
图3 菌株RH2712的菌落（A）及细胞（B）形态
Fig.3 Colony (A) and cell (B) morphology of strain RH2712
2.3.2 生理生化鉴定
菌株RH2712的生理生化鉴定结果见表1。由表1可知，D-苦杏仁甙、β-半乳糖苷酶、水杨素、磷脂酰酯酶C、α-葡糖苷酶、支链淀粉等29项结果呈阴性，亮氨酸芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶、丙氨酸芳胺酶、L-乳酸盐碱化、杆菌肽耐受等14项结果呈阳性。根据VITEK2 Compact全自动微生物分析系统中的GP结果，初步鉴定该菌株为片球菌属（Pediococcus sp.）。
表1 菌株RH2712的生理生化试验结果
Table 1 Results of physiological and biochemical tests of strain RH2712
注：“+”表示结果呈阳性，“-”表示结果呈阴性。
项目 结果 项目 结果D-苦杏仁甙β-半乳糖苷酶水杨素亮氨酸芳胺酶蔗糖D-山梨醇D-核糖D-麦芽糖D-甘露醇D-棉子糖D-海藻糖精氨酸水解酶1环糊精磷酸酶α-半乳糖苷酶磷脂酰酯酶C α-葡糖苷酶支链淀粉L-脯氨酸芳胺酶β-葡萄糖醛酸酶尿素酶L-乳酸盐碱化-- - + - - - - - - - + - - - - - - + - - +杆菌肽耐受D-甘露糖O/129耐受精氨酸双水解酶2酪氨酸芳胺酶D-半乳糖N-乙酰-D-氨基葡萄糖6.5%Nacl生长D-木糖丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶α-甘露糖苷酶β-葡萄糖醛酸酶丙氨酸芳胺酶多粘菌素B耐药乳糖新生霉素耐受甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷β-半乳糖吡喃糖苷酶奥普托欣耐药L-天冬氨酸芳胺酶L-吡咯烷酮芳胺酶++ + + - + - + - - - - + - - + - - + - +
2.3.3 分子生物学鉴定
基于16S rDNA基因序列构建菌株RH2712的系统发育树，结果见图4。由图4可知，菌株RH2712与乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）DSM 20284T在一个分支上，亲缘关系最近。结合形态、生理生化鉴定结果，最终鉴定菌株RH2712为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。
图4 基于16S rDNA基因序列菌株RH2712的系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree of strain RH2712 based 16S rDNA gene sequences
2.4 乳酸片球菌RH2712的安全性评价结果
乳酸片球菌RH2712耐药性实验结果见表2，溶血试验结果见图5。
表2 乳酸片球菌RH2712最小抑菌浓度值及药敏性
Table 2 Minimal inhibitory concentration and drug sensitivity of Pediococcus acidilactici RH2712
抗菌药物 MIC/（μg·mL-1） 药敏性氨苄西林青霉素亚胺培南氯霉素2.000 1.000 0.125 4.000敏感敏感敏感敏感
图5 乳酸片球菌RH2712的溶血性实验的结果
Fig.5 Hemolysis test results of Pediococcus acidilactici RH2712
A：阴性对照菌，英诺克李斯特氏菌CICC 10417；B：阳性对照菌，金黄色葡萄球菌CCIC 10473；C：乳酸片球菌RH2712。
由表2可知，乳酸片球菌RH2712对氨苄西林、青霉素、亚胺培南、氯霉素敏感，最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值分别为2 μg/mL、1 μg/mL、0.125 μg/mL和4 μg/mL。由图5可知，阳性对照菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CICC 10473出现明显的透明圈，表现为溶血，乳酸片球菌RH2712与阴性对照菌英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua）CICC 10417结果一致，均无透明圈，说明乳酸片球菌RH2712溶血性安全，可作为安全益生菌使用。
2.5 乳酸片球菌RH2712耐逆性试验结果
乳酸片球菌RH2712的耐逆性试验结果见图6。
图6 乳酸片球菌RH2712耐逆性试验结果
Fig.6 Stress tolerance test results of Pediococcus acidilactici RH2712
A：耐酸试验结果；B：耐酸延迟时间；C：耐胆盐试验结果；D：人工模拟胃液耐受性试验结果。
由图6A和6B可知，乳酸片球菌RH2712在pH 6.5的条件下活菌数对数值随着培养时间的延长而增加；在pH 3.0的条件下活菌数对数值无明显变化，延迟时间为2 h；在pH 2.0的条件下活菌数对数值降低，延迟时间为2.15 h。由图6C可知，在不同胆盐含量条件下，活菌对数值随培养时间的延长均呈现先下降后上升的趋势，0.3%、0.5%和1.0%胆盐含量下延迟时间均为0 h。即使胆盐含量达到1.5%，培养4 h后活菌对数值也达到8.72，延迟时间也只有0.5 h。由图6D可知，乳酸片球菌RH2712在人工模拟胃液条件下，0 h的活菌对数值为9.19，经3 h处理后活菌对数值也达到7.14。
通常情况下人在空腹状态时的胃酸pH约在0.9～1.5，饭后胃液被稀释，pH也在3.5左右[24]。当益生菌进入人体后，胃酸会导致其活力下降[25]，而乳酸片球菌RH2712在模拟胃液条件下经3 h处理后活菌数对数值仍能达到7.14，表明其能顺利通过胃进入肠道。乙醇的主要吸收部位在小肠，小肠中胆盐含量一般在0.03%～0.30%之间，高含量的胆盐会抑制益生菌的生长和定植[26-28]，本研究中即使胆盐含量达到1.5%时培养4 h后活菌对数值也能达到8.72，表明乳酸片球菌RH2712能够顺利进入并定植于小肠中。延迟时间代表菌株在逆环境下受到影响的大小，乳酸片球菌RH2712无论在酸还是胆盐的胁迫下延迟时间都在可接受范围内，表明该菌株还具有良好的耐酸耐胆盐能力，满足益生菌生理功能正常发挥的要求。
2.6 乳酸片球菌RH2712防醉和醒酒能力体内实验结果
通过灌胃乙醇建立小鼠醉酒模型进一步验证乳酸片球菌RH2712的解酒防醉的效果，结果表明，所有组小鼠都出现了不同程度的醉酒症状，且无雌雄差异。乳酸片球菌RH2712对小鼠醉酒潜伏期和醒酒时间的影响见图7。由图7可知，与阴性对照组相比，其他组小鼠醉酒潜伏期显著增加（P＜0.05），醒酒时间显著降低（P＜0.05）。
图7 乳酸片球菌RH2712对小鼠醉酒潜伏期（A）和醒酒时间（B）的影响
Fig.7 Effects of Pediococcus acidilactici RH2712 on drunken latency(A) and sober up time (B) in mice
不同小写字母代表组间差异显著（P＜0.05）；“**”表示组内解酒试验和防醉试验差异显著（P＜0.05）。
由图7A可知，在解酒试验中，与阳性对照组相比，中、高剂量乳酸片球菌RH2712组的醉酒潜伏期显著增加（P＜0.05）；低剂量乳酸片球菌RH2712组的醉酒潜伏期无显著差异（P＞0.05）。在防醉试验中，高剂量乳酸片球菌RH2712组的醉酒潜伏期与阳性对照组无显著差异（P＞0.05）。由图7B可知，在解酒试验中，高剂量乳酸片球菌RH2712组醒酒时间显著低于阳性对照组（P＜0.05），而在防醉试验中阳性对照组效果最佳。此外，无论是从醉酒潜伏期还是醒酒时间来看，乳酸片球菌RH2712的解酒能力显著强于防醉能力（P＜0.05）。
本研究所用的阳性对照美他多辛（哆醇L-2-吡咯烷酮-5-羧酸盐）是一种常见的解酒药，能够增加细胞中乙醇和乙醛脱氢酶的活性，加快血浆中乙醇和乙醛的消除[29]。与美他多辛相比，中、高剂量乳酸片球菌RH2712的解酒功能更强，低剂量时效果也与之相似。而在防醉试验中，只有高剂量乳酸片球菌RH2712醉酒潜伏期达到美他多辛的效果。说明该菌株更适合在饮酒后立即服用，这可能是因为饮酒后胃酸被稀释，使胃中pH升高，从而更适合菌株的生长。
3 结论
本研究从传统发酵食品奶疙瘩中分离筛选出一株乙醇降解率为13.38%、可耐受体积分数12%乙醇的菌株RH2712，经形态观察、生理生化试验及分子生物学技术鉴定为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。该菌株对氨苄西林、青霉素、亚胺培南、氯霉素敏感，MIC值分别为2 μg/mL、1 μg/mL、0.125 μg/mL和4 μg/mL，溶血性安全，可作为安全益生菌使用。该菌株具有良好的耐酸、耐胆盐能力，在pH 3.0的条件下活菌对数值几乎不变，延迟时间为2 h；在1.5%胆盐含量下培养4 h后活菌对数值达到8.72，延迟时间仅为0.5 h；在人工模拟胃液条件下处理3 h后活菌对数值仍能达到7.14。乳酸片球菌RH2712在小鼠试验中表现出明显的防醉解酒的功效，且活菌数为1×108～1×109 CFU/mL时解酒功能强于美他多辛。本研究为益生菌在急性酒精中毒上的应用提供了依据，未来市场前景广阔。
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