甜茶是集糖、茶、药于一体的食药同源类植物，也是壮族、瑶族等少数民族地区的常用药物[1]，含有丰富的甜茶素、茶多酚和多种矿物质元素等物质，其中甜茶素和茶多酚具有降血压、降血糖、促进代谢等作用[1-2]。甜茶素具有甜度高、热量低、甜味舒适和风味独特等特点，作为一种低热量的天然非糖甜味剂被广泛应用于各种食品的加工中[3-4]。甘蔗含糖量高并含有丰富的维生素、有机酸、多酚类及矿物质元素[5-6]和风味物质[7]。
发酵性茶酒因富含多糖、茶色素、茶多酚、氨基酸和咖啡碱等成分而具有保健医疗[8-10]等功能，其是以茶叶和茶汤为原料，但由于咖啡碱含量不易控制或原材料选择不当而造成多数产品存在滋味不协调、苦涩味、香气不丰富等现象[11-12]，亟需通过原材料或生产工艺改善其品质。因此，本试验选用富含甜茶素的甜茶和高糖分的甘蔗汁作为原材料，通过甜茶中的甜味素调和由茶碱产生的苦涩味，以甘蔗汁中糖分为发酵提供能量，将两种原材料的特性有机的融合和利用，在改善茶酒口感的基础性上保留了甜茶和甘蔗的营养价值及风味，有利于延长茶叶和甘蔗产业链，提高甜茶和甘蔗资源的利用率和效益。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甘蔗：广西来宾市售；甜茶：采摘于广西金秀瑶族自治县莲花山；果酒专用RW酵母：湖北省安琪酵母股份有限公司。
福林酚（1 mol/L）：上海源叶生物试剂有限公司；芦丁标准品（纯度≥95%）、没食子酸（纯度≥95%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、碳酸钠（均为分析纯）：西陇科学股份有限公司。
1.2 仪器与设备
6890B-5977型气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：美国安捷伦公司；UV-2600紫外可见分光光度仪：岛津企业管理有限公司；SPX-250型生化培养箱、DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海申贤恒温设备厂；WYA阿贝折射仪：上海仪电物理光学仪器有限公司；pHS-3E pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 甜香型甘蔗甜茶酒发酵工艺流程及操作要点
甜茶汁制备[13]：甜茶叶用粉碎机粉碎1.0 min后过20目筛，采用超声波结合水浴的方法进行浸提，提取条件为料液比1∶25（g∶mL）、提取温度73 ℃、提取时间31 min，得到的甜茶提取液于高速离心机中3 600 r/min离心10 min。重复以上步骤两次，合并甜茶提取液后于60 ℃恒温浓缩。
甘蔗汁的制备：选用新鲜，无霉变和病虫害的甘蔗，经清洗、压榨、过滤，采用蒸馏水将甘蔗汁初始糖度调整为18°Bx。
菌种活化：将3.5 g果酒专用RW酵母缓缓加入38 ℃的100 mL水中活化，静置10 min后搅拌，冷却后加入发酵液中。
成份调配与发酵：将18°Bx甘蔗清汁和茶浓缩汁按照质量比为100∶3混合（以不添加茶浓缩汁的甘蔗清汁制备甘蔗酒），用柠檬酸溶液调整pH为3.8后灭菌，接种3.5%已活化酵母25 ℃发酵5 d。
离心、澄清：原酒置于高速离心机中4 000 r/min离心10 min，得到澄清的成品并装瓶。装瓶酒样采用巴氏灭菌法（63 ℃杀菌30 min）灭菌，即得甜香型甘蔗甜茶酒。
1.3.2 甜香型甘蔗甜茶酒发酵工艺优化
（1）单因素试验
以甜香型甘蔗甜茶酒的酒精度和感官为评价指标，考察甜茶汁添加量（相对于甘蔗汁的百分含量）、酵母接种量、发酵温度3个因素对甜香型甘蔗甜茶酒品质的影响。
在甘蔗汁的糖度16.0 °Bx、酵母添加量3.5%、发酵温度25.0 ℃，发酵时间5 d的条件下，考察甜茶汁添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）对甜香型甘蔗甜茶酒品质的影响。
在甘蔗汁的糖度16.0°Bx、甜茶汁添加量3.0%、发酵温度25.0 ℃、发酵时间5 d的条件下，考察酵母接种量（1.5%、3.5%、5.5%、7.5%、9.5%）对甜香型甘蔗甜茶酒品质的影响。
在甘蔗汁的糖度16.0°Bx、甜茶汁添加量3.0%、酵母添加量3.5%，发酵时间5 d的条件下，考察发酵温度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）对甜香型甘蔗甜茶酒品质的影响。
（2）响应面优化试验
在单因素试验的基础上，选择甜茶汁添加量（A）、酵母接种量（B）、发酵温度（C）3个因素为自变量，以感官评分（Y）为响应值，采用Box-Behnken（BBD）响应面设计3因素3水平试验优化甜香型甘蔗甜茶酒发酵工艺[14-16]，响应面试验因素与水平见表1。
表1 甜香型甘蔗甜茶酒发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermentation conditions optimization of sweet sugarcane tea wine
因素A 甜茶汁添加量/%B 酵母接种量/%C 发酵温度/℃-1水平0 1 2 3 4 1.5 20 3.5 25 5.5 30
1.3.3 感官评价方法
甜香型甘蔗甜茶酒感官评价：参考已有茶酒的评价标准[14-16]和GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[17]，并根据本产品特性做适当调整，由10名受过感官评分培训的食品专业人员，从色泽、香气、口感、风格4项进行感官评分，取10人平均分，满分100分。感官评分标准见表2。
表2 甜香型甘蔗甜茶酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of sweet sugarcane tea wine
感官指标 标准 感官评分/分色泽（20分）香气（30分）呈浅棕黄，有原茶汤色，澄清透明发亮，无沉淀呈棕黄色，有原茶汤色，透明，稍有沉淀呈棕色，颜色暗淡、浑浊，无光泽甘蔗香、茶香、酒香较浓，且气味协调悦人甘蔗香、茶香较淡，但酒香较浓，气味尚怡悦甘蔗香、茶香、酒香均较淡，但无异香甘蔗香、茶香均不足，酒香较淡，气味不悦人无甘蔗香，无茶香，酒香单薄，有不良气味18～20 12～17＜12 28～30 25～27 20～24 15～19＜15
续表
感官指标 标准 感官评分/分口感（40分）风格（10分）酒体丰满，柔和协调，绵甜爽净，回甘绵延，茶味适中酒质柔顺，柔和爽口，绵甜爽净，有茶味酒体协调，纯正无杂，甜味不明显，茶味较淡轻微苦涩味或无回甘，回味稍粗糙，茶味浓重或很淡酒体寡淡、粗糙，苦涩味较重，无茶味具有典型茶酒风格，整体优雅完美，风格独特具有明显茶酒风格，风格良好基本符合茶酒风格，但不够怡雅与茶酒风格有较大出入，有明显缺陷35～40 30～34 33～28 27～22＜22 10 9 6～8＜6
1.3.4 理化指标测定
酒精度：按照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》的酒精计法进行[17]；可溶性固形物：采用阿贝折光仪测定；总黄酮含量：采用亚硝酸钠—硝酸铝法测定；总酚含量：采用Folin-Ciocalteau法测定[18]；pH、总酸：按照GB/T 13362—2018《黄酒》测定[19]。
1.3.5 挥发性香气成分分析
香气富集：参考谭敏华等[20]的方法并稍作修改。取8.0 mL甜香型甘蔗甜茶酒、甘蔗酒加入15.0 mL样品瓶，随后加入1.0 g NaCl，并在样品瓶中加入搅拌子。用萃取头（DVB/CAR/PDMS 57348-U）在40 ℃条件下萃取40 min，于气相色谱进样口解吸5 min进行气相色谱-质谱分析。
气相色谱条件：DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 mm）；载气为氦气（He）；进样口温度250 ℃；程序升温：35 ℃保持8 min，以2 ℃/min升至150 ℃，再以4 ℃/min升至210 ℃，保持10 min；柱流量0.8 mL/min；不分流进样。
质谱条件：质量扫描范围35～550 amu；离子源温度230 ℃；电离方式：电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量70 eV；传输线温度230 ℃。
定性定量方法：选取匹配度≥80%的物质，通过美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）14谱库与挥发性化合物谱图进行比对，结合相关资料及文献进行分析和鉴定进行定性；采用峰面积归一法进行定量。
1.3.6 数据处理
试验结果采用Origin pro 2018软件进行单因素及曲线回归分析和制图，单组别试验重复3次，试验结果用“平均值±标准差”。采用SPSS19.0进行单因素方差分析、采用Design-Expert 8.0.6软件设计Box-Behnken（BBD）试验并进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 甜香型甘蔗甜茶酒发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 甜茶汁添加量对甜香型甘蔗甜茶酒品质的影响由图1可知，随着甜茶汁添加量的增加，甜香型甘蔗甜茶酒的酒精度呈先缓慢后较快速下降的趋势，感官评分呈先快速升高后缓慢降低的趋势；当甜茶汁添加量为3%时，甜香型甘蔗甜茶酒茶味明显，口感回甘绵延，呈浅棕黄澄清透明发亮，感官评分最高为85.10分，此时酒精度也较高为8.41%vol；当甜茶汁添加量为4%和5%时甜香型甘蔗甜茶酒酒精度下降较明显可能是因为随着甜茶汁添加量增加，茶浓缩汁中较高浓度的生物碱浓度从而抑制了酵母菌的生长，导致酒精度降低[21]。综合考虑，选择甜茶汁添加量为3%时较为合适。
图1 甜茶汁添加量对甜香型甘蔗甜茶酒酒精度和感官评分的影响
Fig.1 Effect of different sweet tea juice addition on alcohol content and sensory score of sweet sugarcane tea wine
不同小写、大写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.1.2 酵母接种量对甜香型甘蔗甜茶酒品质的影响
由图2可知，随着酵母接种量的增加，感官评分和酒精度先升高后下降。当酵母接种量为3.5%时，感官评分最高为85.90分，此时酒精度为8.87%vol；当酵母接种量超过3.5%时，酒精度和感官评分都呈现下降趋势，这是因为当酵母接种量过高，样品起酵快，然而发酵液营养基质有限，造成发酵液中糖分不足，导致果酒中乙醇下降[22-23]；同时发酵过快导致过多的酵母活力不足甚至死亡，造成酒体粗糙，香气不足、酵母味较重，影响甜香型甘蔗甜茶酒的品质和风味[16]。因此，酵母接种量为3.5%时，甜香型甘蔗甜茶酒的发酵效果和品质最好。
图2 酵母接种量对甜香型甘蔗甜茶酒酒精度和感官评分的影响
Fig.2 Effect of yeast inoculum on alcohol content and sensory score of sweet sugarcane tea wine
2.1.3 发酵温度对甜香型甘蔗甜茶酒品质的影响
由图3可知，发酵温度由15 ℃升高至25 ℃时，随着发酵温度的升高甜香型甘蔗甜茶酒的酒精度和感官评分逐渐升高，当发酵温度为25 ℃时，感官评分最高为90.50分，此时酒精度为8.89%vol；当温度超过25 ℃时，甜香型甘蔗甜茶酒的随着发酵温度升高酒精度和感官评分呈现下降趋势。这是因为当发酵温度低于25 ℃时，酵母的活性较低和生长较慢，导致酒精度低和香气不足[23]；当发酵温度高于25 ℃时，出芽率和发酵速度过快，使其发酵动力不足，使其酒精度数降低，同时也会导致茶叶中香味成分的挥发，导致香味物质的产生不充分，对甜香型甘蔗甜茶酒的香味产生不利影响[15，23]。综合考虑，选择发酵温度为25 ℃时较为合适。
图3 发酵温度对甜香型甘蔗甜茶酒酒精度和感官评分的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory score of sweet sugarcane tea wine
2.2 甜香型甘蔗甜茶酒发酵工艺优化响应面试验结果与分析
2.2.1 响应面试验结果
采用Design Expert 8.0.6软件对考察各因素水平进行响应面分析，结果见表3，方差分析结果见表4。对表3试验结果进行二次多项回归拟合，得到以甜香型甘蔗甜茶酒感官评分（Y）作为响应值的回归方程：Y=91.56-0.64A+1.07B+0.59C+0.092AB-0.28AC-0.4BC-2.57A2-3.50B2-4.01C2。
表3 甜香型甘蔗甜茶酒发酵工艺优化响应面试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of response surface methodology for fermentation conditions optimization of sweet sugarcane tea wine
试验号A 甜茶汁添加量/%B 酵母接种量/%C 发酵温度/℃Y 感官评分/分12345678 33332243 1.5 5.5 3.5 3.5 3.5 1.5 3.5 3.5 30 20 25 25 30 25 30 25 83.80 85.10 91.70 91.40 86.50 85.30 84.80 91.50
续表
试验号A 甜茶汁添加量/%B 酵母接种量/%C 发酵温度/℃Y 感官评分/分9 10 11 12 13 14 15 16 17 333243442 1.5 3.5 3.5 3.5 1.5 5.5 5.5 3.5 5.5 20 25 25 20 25 30 25 20 25 82.00 91.40 91.80 84.60 83.70 85.30 85.87 84.00 87.10
表4 回归模型果方差分析
Table 4 Analysis of variance of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。下同。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型ABCA B********AC BC*A2 B2 C2 503.37 82.84 231.19 69.53 0.86 7.62 16.12 701.00 1 296.09 1 708.16＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.384 1 0.028 1 0.005 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1********残差失拟项纯误差总离差179.90 3.29 9.18 2.76 0.034 0.30 0.64 27.84 51.47 67.83 0.28 0.15 0.13 180.18 91111111117341 6 19.99 3.29 9.18 2.76 0.034 0.30 0.64 27.84 51.47 67.83 0.040 0.049 0.033 1.47 0.348 4
根据表4可知，该模型具有极显著性（P＜0.01），失拟项P=0.348＞0.05，不显著，说明二次多项回归模型显著。该模型决定系数R2=0.998 5，证明有99.85%响应值的变化能用该模型来解释，表明该模型适用分析相关因素与响应值的关系。根据F值的大小，可以判断各因素对感官评价的影响顺序为酵母添加量（B）＞甜茶汁添加量（A）＞发酵温度（C）。根据P值可知，一次项A、B、C，二次项A2、B2、C2和交互项BC对结果具有极显著性影响（P＜0.01），交互项AC对结果具有显著性影响（P＜0.05）。
2.2.2 响应面交互作用分析
根据曲面的陡峭程度来分析任意两个变量的交互关系。由图4a可知，曲面斜率较平缓，A、B因素交互作用不显著；由图4b可知，曲面斜率较陡峭，表明A、C因素交互作用显著，与表4试验结果相符；由图4c可知，曲面斜率陡峭，表明B与C交互作用极显著，与表4中试验结果相符，表明AC和BC对甜香型甘蔗甜茶酒感官评价影响较大。
图4 各因素间交互作用对甘蔗糖茶酒品质影响的响应面和等高线
Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between various factors on the quality of sugarcane sweet tea wine
利用Design Expert 8.0.6软件对上述回归模型进行极值分析，得到预测最佳发酵工艺条件为甜茶汁添加量2.87%、酵母接种量3.79%、发酵温度25.32 ℃，在此条件下甜香型甘蔗甜茶酒的感官评分预测值为91.70分。考虑到实际可操作性，修正发酵工艺条件为甜茶添加量2.9%、酵母接种量3.8%、发酵温度25.3 ℃，在此条件下进行3组平行试验，得到甜香型甘蔗甜茶酒的酒精度为（8.9±0.08）%vol，感官评分平均实际值为92.5分，所得结果与预测结果值接近，表明该模型所得的优化条件准确可靠。
2.3 产品指标分析
2.3.1 基本理化指标
由表5可知，甜香型甘蔗甜茶酒的酒精度为（8.94±0.08）%vol、pH为3.74±0.01、总酸含量为（4.74±0.05）g/L，甜茶中丰富的无机酸和有机酸类保证了甜香型甘蔗甜茶酒独特醇厚的风味。甜香型甘蔗甜茶酒具有较高的清澈度，亮度L*值为84.17±0.23；亮度较高，a*值为2.92±0.17，相对于甘蔗酒增加3.79，偏向红色调；b*值为51.17±0.72，相对于甘蔗酒增加34.25，偏向黄色调；酒体通透有光泽且呈现落日般的微红黄色，其结果与感官评价吻合。
表5 甜香型甘蔗甜茶酒与甘蔗酒理化指标测定结果
Table 5 Determination results of physicochemical indexes of sweet sugarcane tea wine and sugarcane wine
样品 酒精度/%vol pH值 总酸/（g·L-1） L*值 a*值 b*值甜香型甘蔗甜茶酒甘蔗酒8.94±0.08 9.26±0.14 3.74±0.01 3.61±0.12 4.74±0.05 3.89±0.07 84.17±0.23 94.17±0.22 2.92±0.17-0.87±0.03 51.17±0.72 16.92±0.04
2.3.2 抗氧化成分和能力分析
由表6可知，甜香型甘蔗甜茶酒总黄酮、总酚含量分别为120.99 mg/100 g、67.10 mg/100 g，较甘蔗酒总黄酮和总酚分别高75.01 mg/100 g、49.63 mg/100 g；甜香型甘蔗甜茶酒的总黄酮和总酚有助于增强其抗氧化能力，经测定，其DPPH自由基清除率为87.34%，这是由于甜茶含有丰富的茶多酚[9，12]等活性成分，有效提高了甜香型甘蔗甜茶酒的抗氧化能力[4，13]。
表6 甜香型甘蔗甜茶酒与甘蔗酒抗氧化成分及能力结果
Table 6 Determination results of antioxidant components and capacity of sweet sugarcane tea wine and sugarcane wine
DPPH自由基清除率/%甜香型甘蔗甜茶酒甘蔗酒样品 总黄酮含量/（mg·100 g-1）总酚含量/（mg·100 g-1）120.99±0.80 45.98±2.00 67.10±2.89 17.47±1.92 87.34±0.02 35.18±0.13
2.3.3 甜香型甘蔗甜茶酒挥发性香气成分分析
利用GC-MS从甜香型甘蔗甜茶酒与甘蔗酒中共检测出24种挥发性香气成分（见表7），其中甜香型甘蔗甜茶酒中检出20种挥发性香气成分，包括酯类7种、醇类6种、有机酸类3种、酚类1种、酮类1种、烷烃类2种；甘蔗汁酒中检出18种挥发性香气成分，包括酯类4种、醇类5种、有机酸类4种、酚类1种、酮类1种、烷烃类2种、胺类1种。添加甜茶后，甜香型甘蔗甜茶酒酯类化合物和醇类化合物的数量增多，分别比甘蔗酒增加了4和1种。甜香型甘蔗甜茶酒中检测出来的酯类化合物有乙酸- 2-叔丁基-4-（二氟甲基）-1,3-恶唑-5-羧酸-2-苯基酯、甲酸己酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙基-9-癸烯酸酯、肉桂醇丙酸酯7种，其中辛酸乙酯相对含量为9.39%，赋予甘蔗茶酒果香和甜香[25]，癸酸乙酯相对含量为2.94%，赋予甘蔗茶酒菠萝香、花香[26]，甜香型甘蔗甜茶酒特有四种酯类赋予其苹果和未成熟梅子似甜香气、果香和甜香及葡萄、草莓香[27]，甜香型甘蔗甜茶酒丰富的香气是由于甜茶汁和甘蔗汁在酵母厌氧代谢过程中产生，使其呈现馥郁、迷人、独特的甜香和茶香。
表7 甜香型甘蔗甜茶酒与甘蔗酒挥发性香气成分GC-MS测定结果
Table 7 Determination results of volatile aroma compounds of sweet sugarcane tea wine and sugarcane wine by GC-MS
注：-代表未检测到。
编号 化合物 分子式 保留时间/min相对含量/%甜香型甘蔗甜茶酒 甘蔗酒酯类1 2 3 4 5 6 7 8醇乙酸-2-叔丁基-4-（二氟甲基）-1,3-恶唑-5-羧酸-2-苯基酯甲酸己酯正己酸乙酯辛酸乙酯癸酸乙酯乙基-9-癸烯酸酯肉桂醇丙酸酯乙酸苯乙酯C9H11F2NO3 C7H14O2 C8H16O2 C10H20O2 C12H24O2 C12H22O2 C12H14O2 C10H12O2 2.891 3.481 13.518 28.894 41.405 44.376 50.618 50.644 0.51 4.43 3.02 9.39 2.94 0.64 2.30-- -5.15 1.14 0.87-1.14类9 1 0--11 12 13 14 15酸类16 17 18 19酚类20酮类21烷烃类22 23胺类24异丁醇2-甲基丙醇异戊醇苯乙醇庚乙二烯乙二醇七聚乙二醇九甘醇C4H10O C4H10O C5H12O C8H10O C14H30O8 C14H30O8 C18H38O10 2.709 3.210 12.973 55.821 76.998 80.234 81.495 8.61 42.4 4.02 0.55 0.79 0.73 5.93-27.87 3.15-0.35 0.38乙酸异丁酸辛酸癸酸C2H4O2 C4H8O2 C8H16O2 C10H20O2 30.489 37.839 63.514 71.579 2.65-3.34 1.49 1.29 0.36 2.70 1.18 2.4-二叔丁基苯酚C14H22O 72.774 1.35 1.59 4-羟基-2-丁酮C4H8O2 3.394 4.43 0.42十甲基环五硅氧烷环己硅氧烷C10H30O5Si5 C12H36O6Si6 6.399 23.020 1.53 2.83 19.94 24.93乳酰胺C3H7NO2 2.859-0.58
3 结论
以甜茶和甘蔗汁为主要原料制备甜香型甘蔗甜茶酒，通过单因素试验和Box-Behnken中心组合响应面设计确定甜香型甘蔗甜茶酒的最优发酵工艺条件为甜茶汁添加量2.9%、酵母接种量3.8%、发酵温度为25.3 ℃，此时甜香型甘蔗甜茶酒感官评分为92.5分、酒精度为8.9%vol。不仅丰富茶酒口感和香气，同时保留了甜茶和甘蔗的天然营养活性成分。研究表明在最佳发酵工艺下制作甜香型甘蔗甜茶酒，具有茶清香、甘蔗果香和回甘绵长等特点，在调和茶酒苦涩味和丰富酒香的基础上，增加茶酒中总酚、总黄酮的含量及提高抗氧化能力，总酚和总黄酮含量分别为67.10 mg/100 g、120.99 mg/100 g，DPPH自由基清除率为87.34%。
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