苹果酒是一种由苹果汁发酵而成的酒精饮料，以其低酒精度和适口性广受欢迎，已成为世界第二大消费量的果酒[1]。苹果酒发酵是微生物代谢的生化过程，酵母把糖转化为酒精、酯、酸和其他次级代谢产物，这些代谢产物对苹果酒的感官和品质特性有重要影响[2]。苹果酒发酵代谢产物的产生受多种因素的影响，如发酵菌株[3-5]、苹果果汁成分[6-7]以及可同化的氮[8]等。除了以上几个因素以外，发酵温度也可以影响微生物的代谢，进而影响果酒风味。近年来，采用低于酿酒酵母适宜温度（25～32 ℃）的低温发酵（10～15 ℃）成了果酒发酵的一种新趋势[9]。低温可使酿酒酵母能够通过除Ehrlich途径之外的其他补偿途径，使氧化还原平衡多样化，从而产生更多样化的风味活性酯[10]。马懿等[11]研究认为，较低温度发酵的梨果酒酸度更低，褐变度和色泽饱和度低，澄清度更高；邓开野等[12]研究发现，低温既能有效保留荔枝酒的香气成分，还能控制高级醇的生成；肖作兵等[13]的研究结果表明，樱桃酒的香气物质和有机酸在不同的发酵温度下的种类和含量各不同。另外，一些学者也对脐橙果酒[14]、枸杞果酒[15]和香蕉酒[16]的低温发酵工艺及挥发性香气成分的变化也进行了研究。由此可见，发酵温度对果酒的质量影响显著，但目前关于发酵温度对苹果酒的理化成分和挥发性香气成分的影响研究相对较少。
本研究以富士苹果为原料，以15 ℃和25 ℃两种不同温度进行发酵试验，研究发酵温度对苹果酒的发酵性能、理化成分和挥发性香气成分的影响，探究不同温度发酵苹果酒品质特性的差异，旨在为低温发酵苹果酒的研发与品质提升提供一定的理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酿酒酵母1023：由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供；富士苹果：采自甘肃天水市；丁酸、丙酸、琥珀酸、乙酸、乳酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸（纯度均＞98%）：上海麦克林生化科技有限公司；17种氨基酸混合标准品：日本Wako公司；偏重亚硫酸钾（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
TRACE ISQ型三重四级杆气质联用仪（gas chromatography-triple four-stage mass spectrometry，GC-MS）：美国赛默飞世尔科技公司；Waters 2695型高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）：美国沃特斯公司；ATAGO PAL-3 型糖度计：日本爱拓公司；PB-10型精密pH计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；S433D型全自动氨基酸分析仪：德国赛卡姆Sykam公司；LRH-70型恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；YXQ-LS-75SII型立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ZHJH-C11128型超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 苹果酒生产工艺流程及操作要点
富士苹果→清洗→破碎→苹果汁→酵母接种→酒精发酵→苹果酒
操作要点：将富士苹果分选、洗涤、去核后进行破碎、压榨，在压榨好的果汁中加入偏重亚硫酸钾（以SO2计，终质量浓度为75 mg/L），将酿酒酵母从保存的斜面培养基中用接种环挑取6环菌苔接种于装有100 mL液体种子培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min摇床培养48 h；然后将活化好的酿酒酵母接种于装有500 mL苹果汁的三角瓶中，接种量为6%，接种浓度为106 CFU/mL，然后分别在15 ℃和25 ℃条件下厌氧静置发酵至质量恒定。
1.3.2 理化指标分析方法
有机酸含量测定：参考胡陆军等[17]的方法并加以改进。取2 mL样品，10 000 r/min离心5 min后取上清液，经0.45 μm滤膜过滤后通过高效液相色谱检测有机酸的含量。Waters Atlantis C18色谱柱（250 mm×4.5 mm，5 μm），柱温30 ℃；流动相：0.05 mmol/L H3PO4∶甲醇=95∶5（V/V）混合；流速：0.8 mL/min，检测波长：210 nm。进样量：10 μL。
氨基酸含量测定：参考唐柯等[18]的方法并加以改进。取1 mL样品，用100 g/L的三氯乙酸等体积稀释后静置1 h，双层滤纸过滤后10 000 r/min离心10 min，取400 μL上清液于液相样品瓶内，通过HPLC检测氨基酸的含量。检测条件为流动相A（pH=7.2）：27.6 mmol/L醋酸钠-三乙胺-四氢呋喃（500∶0.11∶2.5，V/V）；流动相B（pH=7.2）：80.9 mmol/L醋酸钠-甲醇-乙腈（1∶2∶2，V/V）。Agilent Hypersil ODS色谱柱（4.0 mm×250 mm，5 μm），采用梯度洗脱，洗脱程序：0 min，8% B；17 min，50% B；20.1 min，100% B；24.0 min，0% B；流动相流速1.0 mL/min；柱温40 ℃；检测波长338 nm（脯氨酸检测波长262nm）。
可溶性固形物、可滴定酸及pH：可溶性固形物采用糖度计进行测定；可滴定酸：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]测定；pH值：采用pH计测定。
酵母酒精发酵力测定[20]：采用失重法，以二氧化碳挥发产生的质量损失来衡量酵母发酵力的大小，每隔24 h称质量一次，直至发酵结束。
1.3.3 苹果酒挥发性香气成分分析
苹果酒挥发性香气成分的测定采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法：参考曾朝珍等[21]的方法进行测定并采用内标法进行定量。
1.3.4 数据分析
通过Excel 2016对试验数据进行整理，采用IBM SPSS Statistics 24.0和Origin 2021等软件对数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 不同发酵温度条件下酵母发酵力及苹果酒基本理化成分变化
不同发酵温度条件下发酵过程中酵母发酵力及苹果酒可溶性固形物、可滴定酸、pH等基本理化成分含量的变化影响情况见图1。
图1 不同发酵温度条件下酵母发酵力（A）及苹果酒可溶性固形物（B）、可滴定酸（C）和pH值（D）的变化
Fig.1 Changes of yeast fermentation capacity (A), soluble solids (B),titratable acid (C) and pH (D) in cider under different fermentation temperature
由图1A可知，不同发酵温度条件下的发酵均已完成，15 ℃发酵苹果酒的结束时间由25 ℃发酵的8 d延长至12 d。另外，酵母发酵力第4天达到最大值，且15 ℃发酵条件下的二氧化碳质量损失（30.87 g）低于25 ℃发酵（39.32 g），表明低温对酵母的发酵动力学有影响，酵母发酵力因温度的升高而变强，这与GAMERO A等[22]的研究结果一致。由图1B可知，15 ℃发酵条件下的可溶性固形物消耗量比25 ℃发酵条件下的低，在25 ℃发酵条件下，苹果酒的可溶性固形物含量0～6 d时迅速下降，而15 ℃发酵条件下，苹果酒的可溶性固形物含量2～8 d时迅速下降，然后下降缓慢。发酵结束后，不同发酵温度条件的下苹果酒中可溶性固形物含量变化趋势趋于一致，但从前期发酵过程变化趋势可以看出，可溶性固形物消耗量随着发酵温度的升高而变大。由图1C可知，在不同发酵温度条件下苹果酒的可滴定酸含量均呈先升高后降低的趋势，最高含量均达到了4.57 g/L，发酵结束后可滴定酸含量较未发酵时略有增加，15 ℃发酵苹果酒的最终可滴定酸含量为4.41 g/L，而25 ℃发酵苹果酒的最终可滴定酸含量为4.53 g/L，最终可滴定酸含量因温度的升高其含量也增加。由图1D可知，苹果酒发酵过程中pH值在3.97～4.19之间变化，15 ℃发酵苹果酒的最终pH值为4.09，而25 ℃发酵苹果酒的最终pH值为4.04，最终pH因温度的升高其含量降低。以上结果表明，酵母发酵力、可溶性固形物消耗量及可滴定酸与发酵温度呈正相关，而pH与发酵温度呈负相关。
2.2 不同发酵温度条件下发酵的苹果酒中有机酸含量分析
不同发酵温度条件下发酵的苹果酒中苹果酸、柠檬酸、丁酸、乳酸、富马酸、琥珀酸、乙酸及丙酸含量见图2。
图2 不同发酵温度条件下苹果酒有机酸含量分析结果
Fig.2 Analysis results of organic acid contents in cider under different fermentation temperature
由图2可知，不同温度发酵苹果酒中有机酸的种类和含量都不同。15 ℃发酵的苹果酒中苹果酸、柠檬酸、丁酸和富马酸含量较高，分别为3.61 g/L、0.15 g/L、0.07 g/L和0.02 g/L；而25 ℃发酵的苹果酒含有较高的乳酸、琥珀酸、乙酸及丙酸，其含量分别为3.02 g/L、1.36 g/L、0.30 g/L和0.07 g/L。由以上结果可知，酵母菌会因发酵温度的影响而使其代谢发生变化。苹果酸在苹果汁中始终站主导地位[23-24]，在苹果汁发酵苹果酒时，发酵温度越低，苹果酸的含量降低不显著，而发酵温度越高，其含量降低越显著。在发酵过程中，苹果酸作为一种碳源可被酵母菌分解利用并转化为其他有机酸[25]。在不同种类的有机酸中，乳酸对苹果酒的柔软感有积极的影响，而琥珀酸则有咸味和苦味[26]。柠檬酸虽然不是有机酸中最酸的，但是一些研究发现柠檬酸对水果酸性的贡献率高于苹果酸[27]。琥珀酸可以由苹果酸在厌氧条件下转化和一些氨基酸的分解而形成，是酵母菌在发酵过程中形成的一种常见代谢物[27]。乙酸是酒类中的主要挥发酸，其特有的味道会对人的舌后部产生较强的刺激；丙酸、丁酸及富马酸在果酒中的含量极低，对果酒的酸味影响很小。另外，由于这些酸类化合物均具有极高的阈值，它们不会给苹果酒带来不良影响[28]。
2.3 不同发酵温度条件下苹果酒中氨基酸含量的变化
不同发酵温度条件下发酵的苹果酒中氨基酸含量见图3。
图3 不同发酵温度条件下苹果酒中氨基酸含量分析结果
Fig.3 Analysis results of amino acid contents in cider under different fermentation temperature
由图3可知，苹果酒中含17种氨基酸15 ℃发酵苹果酒中半胱氨酸（Cys-s）、苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、异亮氨酸（Ile）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、天冬氨酸（Asp）、蛋氨酸（Met）和脯氨酸（Pro）含量相对较高，其中甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp）含量相对较高，分别为7.37 mg/L、6.48 mg/L和5.11 mg/L；25 ℃发酵苹果酒中络氨酸（Tyr）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、苏氨酸（Thr）、赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）和组氨酸（His）含量相对较高，其中缬氨酸（Val）、组氨酸（His）和苏氨酸（Thr）含量相对较高，分别为10.99 mg/L、4.82 mg/L和2.84 mg/L。
一些研究认为游离态氨基酸是具有味觉活性的物质，谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸呈现鲜味，苏氨酸、组氨酸、丝氨酸、丙氨酸和脯氨酸呈现甜味，蛋氨酸、精氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸呈现苦味，苯丙氨酸和酪氨酸呈现芳香味[29]。氨基酸作为苹果酒中风味成分之一，其含量高低将会对苹果酒口感及风味的纵深度与复杂性产生直接的影响。氨基酸本身除了呈现出鲜、甜、苦、鲜等多种味感，给苹果酒提供丰富饱满的味觉层外，还与酒中的醇类、酯类、有机酸、羰基化合物和萜烯化合物等协同构成了苹果酒的特有风味，赋予了苹果酒较高的营养价值。综上，不同品种发酵苹果酒之间氨基酸存在差异，可以用氨基酸的种类和含量作为判别苹果酒产品的指标。
2.4 不同发酵温度条件下苹果酒挥发性香气成分的变化
不同发酵温度条件下苹果酒挥发性香气成分含量见表1。
表1 不同发酵温度条件下苹果酒挥发性香气物质含量分析结果
Table 1 Analysis results of volatile aroma compounds contents in cider under different fermentation temperature
种类化合物含量/（μg·L-1）15 ℃发酵苹果酒25 ℃发酵苹果酒酯类癸酸乙酯辛酸乙酯9-癸烯酸乙酯乙酸乙酯己酸乙酯丁二酸二乙酯月桂酸乙酯乙酸异戊酯乙酸-2-苯基乙酯1 348.88±1.14 1 199.72±1.69 827.37±1.09 210.01±1.17 216.87±1.70-175.72±0.20 215.31±0.76 117.57±0.58 1 051.44±1.37 667.17±1.33 262.79±1.47 228.41±0.69 119.01±0.92 67.25±0.65 37.78±0.77 36.83±0.62 29.07±0.16
续表
种类化合物含量/（μg·L-1）15 ℃发酵苹果酒25 ℃发酵苹果酒辛酸异戊酯苯甲酸乙酯乳酸乙酯2,2,4-三甲基戊二醇二异丁酸酯壬酸乙酯苯乙酸乙酯十五烷酸异戊酯（Z）-十五碳-9-烯酸乙酯乙酸丁酯丙酸乙酯丁酸乙酯庚酸乙酯3-羟基壬基乙酸酯3,7-二甲基-2,6-辛二烯酸甲酯己烷-5-烯酸乙酯10,13-十八碳二烯酸甲酯十六酸乙酯3-羟基丁酸丁酯乙酸2-庚（醇）酯癸酸丙酯乙酸己酯十一酸乙酯辛酸丙酯乙酸异丁酯4,4-二甲基-3-氧代戊酸甲酯乙酸庚酯乙酸戊酯甲基丙烯酸甲酯8-壬烯酸乙酯丙酸异戊酯乙酸辛酯顺-9-十八烯酸（2-苯基-1,3-二氧戊环-4-基）甲酯异丁酸乙酯3-羟基十三酸乙酯2-甲基丁酸乙酯2-己基-1,1-双环丙烷-2-辛酸甲酯3-甲基庚基乙酸酯（Z）-4-己烯-1-醇乙酸酯辛乙烯二醇单正十二烷基酯2-辛基-环丙烷十四烷酸甲酯异戊酸乙酯8-甲基壬酸乙酯2-己基-1,1-双环丙烷-2-辛酸甲酯总酯39.45±0.22 34.78±0.21-11.71±0.17 11.48±0.17 8.07±0.07 16.47±0.25-25.5±1.14 4.55±0.16 7.51±0.07 14.24±0.17 11.42±0.07-6.71±0.13 4.63±0.23-4.40±0.10 4.30±0.12-39.27±0.17 1.58±0.10 1.58±0.13 3.04±0.04 2.67±0.12 1.98±0.17 1.47±0.13 1.37±0.11 1.22±0.16 1.15±0.10 1.10±0.12 0.95±0.15 23.52±0.20-16.68±0.25 14.77±0.31 14.74±0.36 14.63±0.47 11.99±0.51 8.85±0.34 7.80±0.48 6.23±0.23 6.18±0.24 5.90±0.20-4.59±0.14 3.26±0.17-2.70±0.11 2.69±0.10-2.49±0.11 2.43±0.19 2.29±0.21 1.79±0.23 1.70±0.18-- -1.41±0.21-- - ---0.59±0.13-0.81±0.14 0.74±0.11 0.44±0.18 1.35±0.21 1.34±0.21 1.04±0.11 0.98±0.10 0.93±0.18—— - -4 576.62±1.50 0.63±0.17 0.51±0.18 0.46±0.21 0.42±0.19 2 664.06±1.43
续表
种类化合物含量/（μg·L-1）15 ℃发酵苹果酒25 ℃发酵苹果酒3-甲基-1-丁醇苯乙醇1-己醇3,4,5-三甲基-4-庚醇2-甲基-1-丙醇2-乙基-1-己醇6-甲基-5-庚烯-2-醇乙醇2-壬醇（R）-3,7-二甲基-6-辛烯醇2-庚醇1-辛醇反式-金合欢醇1-十二醇1,3-辛二醇3,7,11-三甲基-2,6,10-十二烷三烯-1-醇芳樟醇1-十一醇1-丁醇1-丙醇顺-3-己烯-1-醇9-十烯-1-醇反式-橙花叔醇1-癸醇庚醇[S-（R*,R*）]-2,3-丁二醇3,4,5-三甲基-4-庚醇3-甲基-5-甲氧基-1-戊醇3-乙基-4-甲基-1-戊醇（E）-3,7,11-三甲基-6,10-十二烷二烯-1-醇6,10-二甲基-5,9-十一碳二烯-2-醇顺-5-辛烯-1-醇Z-4-十二烯醇顺式-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢呋喃-2-甲醇（R）-2-辛醇3-己烯-1-醇7-甲基-3-亚甲基-6-辛烯-1-醇1 510.80±1.12 1 112.28±1.06 212.67±1.33 74.20±0.18 55.83±0.20 53.70±0.19 43.93±0.18 29.01±0.14 12.87±0.10 11.76±0.13 21.55±0.16 17.43±0.15 13.66±0.13-11.46±0.17-7.87±0.14 6.91±0.14 15.46±0.16 7.08±0.10 5.46±0.12 5.11±0.09 8.96±0.14 12.84±0.18 34.04±0.21 2.98±0.16 1 430.32±0.19 1 139.27±0.20 204.25±0.22 168.95±0.19 83.67±0.18 51.07±0.21 45.38±0.24 30.68±0.10 24.78±0.09 23.02±0.11 22.93±0.05--21.98±0.10 19.53±0.09 17.23±0.12 14.54±0.14-14.45±0.11 12.20±0.13醇类—— - - -1.19±0.11--壬醇2-十一醇1-戊醇（S）-（+）-2-戊醇3-乙氧基-1-丙醇总醇2.62±0.10 0.44±0.11-1.75±0.14-1.62±0.07 1.57±0.10-3 297.05±2.54 11.21±0.15 10.82±0.10 10.49±0.12 10.12±0.15 7.39±0.11 7.29±0.08 6.72±0.09 5.67±0.09 4.67±0.11 4.23±0.09 3.96±0.13 3.80±0.11 3.45±0.08 3.04±0.14 2.63±0.09 2.61±0.08 2.12±0.12 2.04±0.13 1.77±0.09 0.65±0.12 3 428.95±3.53
续表
注：“-”表示未检出。
种类化合物含量/（μg·L-1）15 ℃发酵苹果酒25 ℃发酵苹果酒酸类辛酸己酸癸酸乙酸异丁酸2-甲基-2-戊烯酸庚酸9-癸烯酸2,2-二甲基己酸总酸526.72±0.20 75.71±0.25 78.85±0.31-1.10±0.10-9.03±0.19 6.23±0.24 5.88±0.14 703.53±0.13 142.77±0.13 45.27±0.16 24.6±0.17 8.36±0.08 4.02±0.21 1.14±0.18-- -226.15±0.08
由表1可知，在15 ℃和25 ℃条件下发酵的苹果酒在每种香气类别（酯类＞醇类＞酸类）的挥发性化合物总含量上表现出基本相同的行为，但各组之间的香气特征有所不同。苹果酒所有类别的挥发性化合物中，酯类物质的含量占主导地位，15 ℃、25 ℃条件下发酵苹果酒的总酯含量分别为4 576.62 μg/L、2 664.06 μg/L。总酯根据其化学结构可分为脂肪酸乙酯（癸酸乙酯、辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、己酸乙酯和月桂酸乙酯）、乙酸酯（乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸-2-苯乙酯、乙酸丁酯和乙酸己酯）和高级醇酯（辛酸异戊酯）。具体而言，在15 ℃发酵的苹果酒中脂肪酸乙酯比25 ℃发酵的苹果酒中脂肪酸乙酯更丰富，其中含量相对较高的是癸酸乙酯和辛酸乙酯。癸酸乙酯和辛酸乙酯属于中链脂肪酸乙酯，是最丰富的挥发性香气物质，占苹果酒总芳香族化合物含量的50%以上，这与XU J N等[30]的研究结果一致。另外，醇是苹果酒中含量丰富的另一类主要挥发性物质。高级醇被认为是酯的最重要的前体之一，但过量的高级醇可能会对最终产品的质量产生不利影响[9]。本试验中发酵苹果酒中总的高级醇含量随着发酵温度的降低而降低，由25 ℃发酵苹果酒的3 428.95 μg/L降低为15 ℃发酵苹果酒3 297.05 μg/L，其中3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、1-己醇在发酵后的苹果酒中含量相对较高。大多数高级醇是在酵母发酵过程中由氨基酸降解而来的[31]，高级醇根据其浓度的不同会对果酒的感官特性有正面或负面的影响。已有学者研究证明，低温发酵会在果酒中产生低浓度的高级醇[32]。在本研究中，该酵母在苹果酒发酵中也表现出了相同的行为。羧酸是苹果酒发酵中形成的一类挥发性化合物。15 ℃条件下发酵苹果酒的脂肪酸总含量（703.53 μg/L）高于在25 ℃条件下发酵苹果酒的脂肪酸总含量（226.15 μg/L）。其中，己酸、辛酸和癸酸是苹果酒中检测到的主要脂肪酸，它们是脂质氧化的产物，对此可能的解释来自于酿酒酵母的脂质代谢。中链脂肪酸是酒精发酵过程中脂质合成的副产物，与其他弱酸一起影响酵母质膜的组织和稳定性。这种现象会使酿酒酵母将亲脂性酸排泄到外部介质中。事实上，在某些胁迫条件下，如发酵温度低，酿酒酵母可以产生更高含量的中链脂肪酸[33]。
3 结论
本试验研究了酿酒酵母在不同发酵温度下对苹果酒品质的影响，理化成分和挥发性香气成分检测结果表明，15 ℃发酵对酵母发酵动力学有显著影响，发酵周期较25 ℃发酵延长了4 d；可滴定酸与pH的变化呈现先增加后减少的趋势，可滴定酸最终含量由25 ℃发酵的4.53 g/L下降为4.41 g/L，而pH则由4.04增加为4.09；不同发酵温度条件下苹果酒中有机酸和氨基酸的种类及含量都差异显著；发酵温度对主要挥发性化合物的类别产生了不同的影响，与25 ℃发酵苹果酒相比，在低温发酵的苹果酒中显示出较高的总酯含量、脂肪酸含量和较低的高级醇含量，其含量分别为4 576.62 μg/L、703.53 μg/L、3 297.05 μg/L。因此，发酵温度的变化会显著影响关键香气化合物的产生和苹果酒的理化成分，这些结果可以帮助苹果酒生产商在最佳发酵温度下为消费者生产出质量更好的产品。
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