白酒是中国的国酒，在中国传统文化中占有独特的地位。白酒是一种以粮谷为主要原料，以酒曲为发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏制成的传统蒸馏酒[1-4]。白酒现已形成12种香型，分别为清香、浓香、酱香、米香、凤香、芝麻香、药香、特香、豉香、兼香、老白干香和馥郁香型白酒[5-7]，其中清香型白酒被视为中国白酒的起源，其清香纯正、醇厚绵甜、协调爽净、回味悠长的特点深受消费者的喜爱[8-11]。
乙酸乙酯与乳酸乙酯是清香型白酒的两种主体酯类物质，它们的含量和比例与清香型白酒的风味品质密切相关[12-13]。现行国家标准GB/T 10781.2—2022《白酒质量要求第2部分：清香型白酒》理化要求部分，对乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量做出了明确的规定，检验的方法标准为GB/T 10345—2022《白酒分析方法》。甲醇是白酒中重要的卫生指标[14]，饮用甲醇超标的白酒，会对人体造成极大伤害，表现为头痛、眩晕、疲劳、呕吐、视力模糊、失明，甚至死亡[15-17]，国家市场监管总局发布的《2020版国家食品安全监督抽检实施细则》规定了甲醇含量为白酒中必检项目[18]，检测方法为GB 5009.266—2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定》。白酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯与甲醇对应不同的检测方法，这样降低了工作效率和仪器的利用率。因此对标准中的方法进行优化，建立一种操作简单、准确度高、精密度好，适用于清香型白酒中甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯快速检测的方法具有重要意义。
现有对白酒中风味物质分析检测的方法有气相色谱（gas chromatography，GC）法、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法、气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）法、电子鼻和气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion migration spectrometry，GC-IMS）技术等[19-25]，因气相色谱法对碳氢化合物有较好的响应及稳定的信号，且操作简便、成本较低、分离效果好、样品用量少等优点广泛用于白酒中各类风味物质的分析[26-28]。孟庆顺等[29]用气相色谱法同时测定了白酒中8种醇类和酯类风味物质，韩旭等[30]建立了白酒中同时检测己酸乙酯和己酸的毛细管气相色谱分析方法，吴丽华等[31]利用白酒毛细管色谱柱气相色谱法，分析了白酒中酯类、醇类、有机酸类、醛类等29种微量成分。
本研究选取清香型白酒中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯这三种物质为检测目标，建立气相色谱（GC）内标法同时测定清香型白酒中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯含量的方法，并进行方法学考察，以期建立同时检测清香型白酒中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯的方法，提高检测效率，在满足清香型白酒三大重要指标同时达到快速、准确检验的要求。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
10个不同酒精度酒样[1#（42%vol）、2#（45%vol）、3#（50%vol）、4#（52%vol）；5#（55%vol）、6#（57%vol）、7#（58%vol）、8#（60%vol）、9#（61%vol）、10#（65%vol）]：某白酒企业提供。
甲醇、乙酸乙酯、乙醇（均为色谱纯）：成都市科隆化学品有限公司；乳酸乙酯（色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司；叔戊醇（纯度99%）：阿达玛斯试剂有限公司；乙酸正戊酯（色谱纯）：山东西亚化学工业有限公司。
1.2 仪器与设备
GC-2030气相色谱仪：日本岛津公司；CP225D电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；UPR-Ⅱ-10TNP超纯水机：四川优普超纯科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 混合标准工作溶液的配制
混合标准储备液：分别准确称取0.5 g甲醇，2.5 g乙酸乙酯、2.5 g乳酸乙酯，至100 mL容量瓶中，用体积分数40%乙醇定容至刻度，充分混匀，其中，甲醇质量浓度为5000 mg/L，乙酸乙酯、乳酸乙酯的质量浓度为25 000 mg/L，0～4 ℃密封保存。
混合内标溶液：分别准确称取2.0 g叔戊醇、2.0 g乙酸正戊酯至100 mL容量瓶中，用体积分数40%乙醇定容至刻度，充分混匀，内标溶液的质量浓度为20 000 mg/L，0～4 ℃密封保存。
混合标准工作溶液的配制：分别准确移取甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯混合标准储备液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL于5个10 mL的容量瓶中，然后加入0.1 mL叔戊醇、乙酸正戊酯混合内标溶液，以体积分数40%乙醇溶液定容至刻度，依次配制成甲醇质量浓度为50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、乙酸乙酯和乳酸乙酯质量浓度为250 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L、2 000 mg/L、2 500 mg/L的系列混合标准工作溶液，充分混匀，现配现用。
1.3.2 样品前处理
移取9.9 mL样品置于10 mL容量瓶中，加入0.1 mL混合内标（20 000 mg/L），充分混匀，现配现用。
1.3.3 分析检测
甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯的检测采用气相色谱法。
色谱条件：CP-WAX57CB色谱柱（50.0 m×0.25 mm×0.20 μm）；进样量1.0 μL；进样口温度250 ℃；分流比50∶1；氢火焰离子化检测器（hydrogen flame ionization detector，FID）250 ℃；柱箱梯度升温程序为初温40 ℃，以3.5 ℃/min升到80 ℃，以35 ℃/min升到180 ℃，保持2.5 min。
定性、定量分析：根据甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯的单标准品色谱峰的保留时间进行定性，内标法定量。采用标准工作曲线得到样品中各待测组分的质量浓度与对应内标的质量浓度的比值Ii，再根据待测组分对应内标的浓度ρi，计算样品中各待测组分的含量Xi进行定量。标准曲线的建立：将配制好的混合标准工作溶液参考色谱条件测定各组分的峰面积。以甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯系列标准工作液的质量浓度（X）为横坐标，以甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯峰面积与对应内标峰面积的比值（Y）为纵坐标，绘制其标准工作曲线，获得其回归方程。其中，甲醇以叔戊醇为内标，乙酸乙酯、乳酸乙酯以乙酸正戊酯为内标。样品中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量计算公式如下：
式中：Xi为样品中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量，g/L；Ii 为从标准曲线得到待测液中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯质量浓度与对应的内标质量浓度的比值；ρi为甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯对应内标的质量浓度，mg/L；1 000为单位换算系数。
1.3.4 方法学考察
（1）线性方程、检出限及定量限
按照1.3.1中配制好混合标准工作溶液后，用1.3.3的色谱工作条件进行测定，以标准工作液中各组分的质量浓度（X）为横坐标，各组分峰面积与其对应的内标峰面积的比值（Y）为纵坐标绘制标准曲线。并且分别按照信噪比S/N=3和S/N=10计算得到方法的检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ），采用逐级稀释法确定甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯的最低检出浓度。
（2）样品的精密度及加标回收率试验
精密度试验：在清香型酒样中加入一定质量浓度的甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯标准溶液，按照1.3.2的方法进行样品前处理，用1.3.3的色谱条件连续进样6次测定后，计算各组分的精密度试验结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
加标回收率试验：在已测定本底值的清香型酒样中分别准确加入一定质量浓度的甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯标准溶液，按照1.3.2的方法进行样品前处理，用1.3.3的色谱条件进行测定后计算其加标回收率。
1.3.5 数据处理
利用LabSolution查看色谱图、绘制标准曲线，利用Origin81软件处理数据。
2 结果与分析
2.1 方法学考察
2.1.1 定性分析结果
按照1.3.3的色谱条件对甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯3种单标溶液进行测定，确定各物质的出峰顺序和保留时间。按照1.3.1配制的混合标准溶液进行测定，根据保留时间定性。3种标准品和2种内标物质的混合溶液气相色谱图见图1。从图1可知，甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯和其对应的2种内标物质能够完全分离，峰形尖锐，在17 min内完成检测。
图1 混合标准溶液气相色谱图
Fig.1 Gas chromatogram of mixed standard solution
2.1.2 线性关系、检出限及定量限
对混合标准工作溶液进行测定，以甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯系列标准工作液的质量浓度（X）为横坐标，甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯峰面积与对应内标峰面积的比值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得出各组分回归方程、相关系数及线性范围，计算检出限及定量限，结果见表1。由表1可知，各组分在各自质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（R2）均＞0.999。甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯检出限分别为0.12mg/L、0.74 mg/L、0.66 mg/L，定量限分别为0.39 mg/L、2.44 mg/L、2.18 mg/L，说明该方法检出限较低，灵敏度高。
表1 各组分的标准曲线回归方程、相关系数、线性范围、检出限及定量限
Table 1 Standard curve regression equation, correlation coefficient,linear range, detection limit and quantification limit of each component
组分保留时间/min标准曲线回归方程相关系数（R2）线性范围/（g·L-1）检出限/（mg·L-1）定量限/（mg·L-1）甲醇7.159 0.999 83 0.12 0.39乙酸乙酯6.746 0.999 60 0.74 2.44乳酸乙酯16.074 Y=0.002 388X+0.019 472 Y=0.003 816X-0.212 600 Y=0.003 480X+0.087 027 0.999 28 0.05～0.5 0.25～2.5 0.25～2.5 0.66 2.18
2.1.3 精密度试验
用同一酒样，按照1.3.2的步骤配制样品，再按照1.3.3色谱条件连续进样6次，记录峰面积计算各组分的含量，并计算相对标准偏差，结果见表2。由表2可知，甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯含量测定结果的RSD分别为2.29%、0.59%、1.03%，表明该方法精密度良好。
表2 各组分的精密度试验结果（n=6）
Table 2 Precision test results of each component (n=6)
组分 平均值/（g·L-1）测定次数1 2 3 4 5 6 RSD/%甲醇乙酸乙酯乳酸乙酯0.081 1.414 0.628 0.084 1.437 0.634 0.081 1.422 0.625 0.085 1.423 0.644 0.082 1.425 0.631 0.085 1.434 0.633 0.083 1.426 0.632 2.29 0.59 1.03
2.1.4 加标回收率试验
取同一酒样，测定本底值后，分别准确加入低、中、高质量浓度的甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯标准溶液后，平行测定6次，计算各组分的加标回收率及RSD，结果见表3。由表3可知，甲醇的平均加标回收率为94.3%～100.4%，乙酸乙酯的平均加标回收率为93.4%～100.2%，乳酸乙酯的平均加标回收率为96.3%～99.8%，加标回收率测定结果的RSD分别为1.35%～2.89%、0.45%～2.82%、0.59%～2.33%，均＜3%，满足分析要求。表示该方法准确度高。
表3 各组分的加标回收率试验结果（n=6）
Table 3 Experimental results of adding standard recovery rate of each component (n=6)
组分 本底值/（g·L-1）加标量/（g·L-1）测定值/（g·L-1）回收率/%平均回收率/%RSD/%0.050 94.3 2.48甲醇 0.056 0.200 96.5 2.89 0.500 0.103 0.104 0.103 0.102 0.105 0.102 0.244 0.249 0.258 0.253 0.246 0.244 0.559 0552 0.561 0.548 0.560 0.567 94.0 96.0 94.0 92.0 98.0 92.0 94.0 96.5 101.0 98.5 95.0 94.0 100.6 99.2 101.0 98.4 100.8 102.2 100.4 1.35
续表
组分 本底值/（g·L-1）加标量/（g·L-1）测定值/（g·L-1）回收率/%平均回收率/%RSD/%0.250 98.1 2.82乙酸乙酯0.861 1.00 93.4 1.50 2.500 100.2 0.45 0.250 96.3 2.23乳酸乙酯0.468 1.00 98.4 2.33 2.500 1.095 1.107 1.104 1.114 1.105 1.113 1.778 1.793 1.794 1.815 1.806 1.782 3.372 3.349 3.367 3.356 3.374 3.378 0.715 0.704 0.709 0.713 0.701 0.711 1.482 1.426 1.431 1.448 1.444 1.467 2.942 2.981 2.959 2.952 2.971 2.973 93.6 98.4 97.2 101.2 97.6 100.8 91.7 93.2 93.3 95.4 94.5 92.1 100.4 99.5 100.2 99.8 100.5 100.7 98.8 94.4 96.4 98.0 93.2 97.2 101.4 95.8 96.3 98.8 97.6 100.7 99.0 100.5 99.6 99.4 100.1 100.2 99.8 0.59
2.2 样品的测定
对10个不同酒精度的清香型白酒样品，按照方法1.3.2制备3组待测平行样，分别按照1.3.3条件进行进样，测定3种化合物的含量并计算平行样品中甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯含量的RSD，结果见表4。由表4可知，各样品中的甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯在3次平行测定中含量的RSD值均＜3%，说明该方法在实际样品检测中精密度能较好的满足检测要求。
表4 样品测定结果
Table 4 Determination results of samples
样品编号含量/（g·L-1）甲醇 乙酸乙酯 甲醇乳酸乙酯RSD/%乙酸乙酯 乳酸乙酯1#2.11 0.19 0.38 2#1.84 0.37 0.43 3#2.86 0.25 0.36 4#2.05 0.17 0.37 5#2.17 0.18 0.34 6#1.18 0.39 0.19 7#2.52 0.13 0.26 8#1.64 0.17 0.29 9#1.13 0.14 0.19 10#0.028 0.027 0.027 0.031 0.032 0.031 0.036 0.035 0.034 0.073 0.075 0.076 0.052 0.054 0.054 0.128 0.131 0.130 0.061 0.059 0.062 0.093 0.095 0.092 0.134 0.137 0.136 0.083 0.085 0.083 1.065 1.069 1.067 0.829 0.833 0.835 1.443 1.438 1.436 0.894 0.891 0.892 1.472 1.468 1.467 0.537 0.533 0.534 1.557 1.561 1.558 0.897 0.895 0.894 1.869 1.874 1.873 1.694 1.699 1.697 0.544 0.541 0.545 0.468 0.464 0.466 0.581 0.585 0.584 0.537 0.541 0.539 0.608 0.612 0.609 0.806 0.803 0.804 0.596 0.594 0.593 0.685 0.689 0.687 1.408 1.403 1.404 1.327 1.334 1.333 1.38 0.15 0.28
3 结论
本实验建立了气相色谱内标法同时测定清香型白酒中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯含量的方法。甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯能够实现有效分离，在17 min内完成检测；在各自的质量浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数R2均＞0.999，甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯检出限（LOD）分别为0.12 mg/L、0.74 mg/L、0.66 mg/L；定量限（LOQ）分别为0.39 mg/L、2.44 mg/L、2.18 mg/L。其精密度试验结果的相对标准偏差（RSD）分别为0.59%、1.03%、2.29%；加标回收率分别为94.3%～100.4%、93.4%～100.2%、96.3%～99.8%。检测结果准确可靠，可用于清香型白酒中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯快速分析检测。
[1]杜静怡，朱婷婷，黄明泉，等.清香型志都五谷酒关键香气成分分析[J].食品科学，2021，42（2）：185-192.
[2]LI H,HAN X,LIU H,et al.Silage fermentation on sweet sorghum whole plant for Fen-flavor Baijiu[J].Foods,2021,10(7):1477.
[3]李行，吴李玲，裴荣红，等.6种武陵酱香型白酒中挥发性含硫化合物差异分析[J/OL].食品科学技术学报：1-12[2023-05-31].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/10.1151.TS.20230310.1040.002.html
[4]方海仙，普娅丽，普家云，等.气相色谱法测定白酒中甲醇、乙酸乙酯和己酸乙酯含量的优化[J].食品安全质量检测学报，2021，12（17）：6879-6886.
[5]张志勇，程伟，陈兴杰，等.全二维气相色谱-飞行时间质谱法分析大曲清香型白酒中的挥发性香气组分[J].酿酒科技，2022（7）：26-32.
[6]朱开宪，胡雪，邓静，等.基于GC-MS技术对不同香型白酒的判别分析[J].中国酿造，2023，42（1）：213-218.
[7]任金玫，陈君平，李志健，等.十二种香型白酒相关研究概况[J].中国酿造，2022，41（4）：13-19.
[8]ZHANG Q,YANG J G,AO Z H,et al.Research progress on the aromatic components of Fen-flavor liquor (Baijiu)[J].Adv J Food Sci Technol,2017,13(5):190-195.
[9]彭思婕，张立强，郭佳，等.加热熟化小麦制曲对清香型白酒风味的影响研究[J].酿酒科技，2022（6）：30-37，44.
[10]王震，叶宏，朱婷婷，等.清香型白酒风味成分的研究进展[J].食品科学，2022，43（7）：232-244.
[11]余汉超，蒋燕明，陈家豪，等.清芝复合香型白酒生产工艺的优化[J].食品研究与开发，2023，44（3）：102-109.
[12]李书婷，黄志久，吴正云，等.清香型白酒酿造中乳酸乙酯和乙酸乙酯合成代谢调控的研究进展[J].酿酒科技，2022（11）：99-103.
[13]李伟，李佳，王宇鹏，等.清香型白酒乳酸利用菌的筛选及鉴定[J].中国酿造，2017，36（9）：87-91.
[14]林龙飞.FID-气相色谱法快速检测白酒中的甲醇和四大酯[J].广州化工，2022，50（2）：81-83.
[15]杜小强，周劝娥，郭文辉，等.气相色谱内标法测定白酒中的甲醇含量[J].现代食品，2021（10）：151-154.
[16]闫海彦，赵亚雄，郇丹，等.白酒中微量有害成分的分析检测研究进展[J].酿酒科技，2022（10）：94-106.
[17] NAJARI F, BARADARAN I, NAJARI D.Methanol poisoning and its treatment[J].Int J Med Tox Forens,2020,10(1):26639.
[18]孟庆顺.气相色谱法快速测量清香型白酒中甲醇和乙酸乙酯含量[J].中国食品添加剂，2020，31（11）：89-93.
[19] WANG Z, SUN X, LIU Y, et al.Characterization of key aroma compounds in Xiaoqu liquor and their contributions to the sensory flavor[J].Beverages,2020,6(3):42.
[20]胡瑾，马一飞，罗佳雪，等.气相色谱法同时测定白酒中57种风味物质[J].中国酿造，2022，41（5）：206-211.
[21]王励英，史晓梅，钱承敬.白酒风味特征研究进展[J].食品安全质量检测学报，2019，10（21）：7212-7219.
[22]张晓婕，邱树毅，王晓丹，等.白酒挥发性风味物质气相分析方法及研究进展[J].食品与发酵工业，2021，47（14）：313-320.
[23]李欢欢，余丽娜，雷婷，等.基于气相色谱-离子迁移谱分析石花白酒风味特征[J].中国酿造，2023，42（2）：240-244.
[24]张卜升，袁丛丛，李汶轩，等.浓香、酱香、清香型白酒挥发性风味的特征与差异研究[J].食品安全质量检测学报，2022，13（24）：8058-8067.
[25]王艳晓，张雯雯.气相色谱法在白酒检测中的应用[J].化工设计通讯，2020，46（8）：121-125.
[26] HONG J, ZHAO D, SUN B.Research progress on the profile of trace components in Baijiu[J].Food Rev Int,2023,39(3):1666-1693.
[27]杨亚娇，黄婷，刘茗铭，等.气相色谱法检测白酒中34种微量组分[J].酿酒，2022，49（1）：71-79.
[28]朱明，殷红，靳喜庆，等.气相色谱-氢火焰离子化检测器法测定白酒中50种风味物质[J].中国酿造，2021，40（5）：168-172.
[29]孟庆顺，卜媛媛，王悦，等.气相色谱法测定白酒中醇类及酯类[J].食品安全质量检测学报，2021，12（11）：4666-4671.
[30]韩旭，吴宏萍，吴丽华，等.气相色谱法同时测定白酒中己酸乙酯和己酸[J].酿酒，2020，47（3）：99-100，104.
[31]吴丽华，吴宏萍，薛锡佳，等.毛细管气相色谱法同时检测白酒中29种微量成分的研究[J].酿酒，2018，45（1）：76-78.