中国酒历史悠久，中国的白酒更是我国特有的蒸馏酒，白酒根据香型最初被分为酱香型、米香型、清香型、浓香型四大基本香型和其他香型[1]，其中，米香型白酒被众多专家公认为中国白酒的起源酒[2]。苗家米酒属于米香型白酒的范畴，其是以大米为原料，经过酒曲发酵之后，再经过蒸馏得到的蒸馏米酒[3]。大米本身含有氨基酸、微量元素、维生素等[4-9]。除此之外，大米中也含有风味物质[10]，为米酒风味提供一定基础。
苗家米酒最大的特点是其采用具有疗效的中草药配方制作酒曲，例如具有抗菌、抗肿瘤活性的毛大丁草、忍冬[11-12]，具有抗氧化活性的猕猴桃、五味子[13-14]，并且还加入了有抗肿瘤作用的毛大丁草[15]，其在少数民族地区用来制作酒曲早有记载[16]。然而，在白酒酿造过程中，影响其感官品质的因素很多，例如原料、容器、水分、温度、发酵时间、酒曲种类等[17-19]。目前，还未见传统苗家米酒的研究报道，在实际生产中，酿酒师们只是凭借自身的经验，没有相应的工艺参数，因此酿出的酒口感参差不齐。
为研究苗家传统米酒的工艺技术，发挥苗家米酒价值，推动苗家米酒产业发展，本研究以大米为原料，酒曲为糖化发酵剂制备苗家米酒，通过单因素试验和响应面试验对其发酵工艺条件进行优化，并对其理化指标及微生物指标进行测定，同时采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技术对苗家米酒的挥发性风味物质进行分析，旨在为苗家米酒的研究提供一定思路，促进民族产业的发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大米：市售；母曲、稻谷：雷山当地村民提供。
酒曲原料（毛花猕猴桃、中华猕猴桃、鸡矢藤、忍冬、地瓜榕、地菍、亮叶桦、披针叶五味子、千里光、白千里光、羊耳菊、毛大丁草、河北木蓝、波叶山蚂蝗、野葛、滇白珠、毛叶木姜子、川莓、山莓、苦苣苔、山茶、木贼、马尾松、杨梅、红豆杉）：雷山当地。
平板计数琼脂培养基、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤培养基：广东环凯微生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
202-3AB型电热恒温干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；酒精比重计：河北省衡水武强县玻璃仪表厂；7890B-5977B气相色谱-质谱联用（GC-MS）仪、DB-5MS色谱柱（30 mm×250 mm，0.25 μm）：美国安捷伦公司。
1.3 方法
1.3.1 苗家米酒的加工工艺流程及操作要点
采药→制曲→蒸饭→拌曲、糖化发酵→蒸馏
操作要点：
采药：7～8月份，从贵州雷山地区采千里光地上部分、白千里光地上部分、羊耳菊地上部分、毛大丁草全草、苦苣苔地上部分、河北木蓝叶、波叶山蚂蝗叶、野葛叶、毛花猕猴桃叶、中华猕猴桃叶、滇白珠叶、毛叶木姜子叶、亮叶桦叶、川莓地上部分、山莓地上部分、地瓜榕叶、地菍地上部分、披针叶五味子藤茎及叶、鸡矢藤藤茎及叶、忍冬叶、山茶叶及花、木贼地上部分、马尾松叶、杨梅叶、红豆杉叶及果实，选取当地多种植物原料，共计25种。
制曲：选用的原料为粘谷和糯谷（4∶3）（g∶g），采用当地的碾米机进行粉碎（约60～100目）。各原料质量如下：粘谷20 kg、糯谷15 kg、毛花猕猴桃1 kg、中华猕猴桃1 kg、鸡矢藤1.5 kg、忍冬1.5 kg、地瓜榕1 kg、地菍1 kg、亮叶桦1 kg、披针叶五味子1.5 kg、千里光0.5 kg、白千里光0.5 kg、羊耳菊0.5 kg、毛大丁草0.5 kg、河北木蓝1 kg、波叶山蚂蝗0.5 kg、野葛0.5 kg、滇白珠0.5 kg、毛叶木姜子0.5 kg、川莓1 kg、山莓0.5 kg、苦苣苔0.5 kg、山茶0.5 kg、木贼0.5 kg、马尾松0.5 kg、杨梅0.5 kg、红豆杉0.5 kg，粉碎（20～60目）。将粉碎后的谷粉和酒曲植物搅拌均匀。以清水与谷粉质量约1∶1的比例加入清水，并加入约1.5 kg的母曲混匀，再倒入已搅拌均匀的原料中。而后将润湿的原料捏成粒径为4～10 cm的酒曲颗粒，放于稻草之上，在此酒曲之上还要撒一层母曲粉末，盖上稻草保证适宜的温度。待酒曲表面长满白色菌落后，将酒曲于30～40 ℃烘干即可。
蒸饭：取50 kg大米，按照米∶水（2∶1）的比例加入清水进行蒸煮，蒸煮时间约2～3 h，待米蒸熟（捻之无白心）后，盛出摊开晾凉至35 ℃左右。
拌曲、糖化发酵：向晾凉后的米饭中拌入粉碎的酒曲1.5 kg，待搅拌均匀之后，装入密封的发酵缸中，在室温下密封发酵，发酵时间约为1个月。
蒸馏：糖化发酵后得到酒醅，将酒醅倒入大锅（加热容器）中，加入约同等质量的水，在大锅之上安装蒸馏设备（当地叫做天锅），以中火进行加热，加热至沸腾状态后，就会有液体从出酒口流出，收集馏出液（要弃去前2 min流出的液体），即得传统苗家米酒。
1.3.2 苗家米酒发酵工艺优化
单因素试验：以传统苗家米酒制作工艺为基础，分别考察发酵时间（22 d、26 d、30 d、34 d、38 d）、酒曲添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、发酵温度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）对米酒感官评分和酒精度的影响。
响应面试验：在单因素试验结果的基础上，选择发酵时间（A）、酒曲添加量（B）、发酵温度（C）为3个自变量，以感官评分（Y）为响应值，设计3因素3水平响应面试验对米酒的发酵工艺条件进行优化[20-22]，响应面试验设计因素与水平见表1。
表1 苗家米酒发酵条件优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation conditions optimization of Miao rice wine
水平 A 发酵时间/d B 酒曲添加量/% C 发酵温度/℃-1 0 1 26 30 34 2 3 4 26 28 30
1.3.3 分析检测
酒精度测定：参照GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》[23]；菌落总数测定：参照GB 4789.2—2022《食品微生物学检验菌落总数测定》[24]；大肠杆菌总数：参照GB 4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》[25]。
1.3.4 挥发性风味物质测定
挥发性风味物质测定采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术。具体条件如下：
气相色谱条件：进样口温度为260 ℃；不分流进样；流速为1 mL/min；柱压为9.08 Psi；程序升温条件为初始温度60 ℃保持1 min，以12 ℃/min升温至200 ℃，以5 ℃/min升温至325 ℃；进样量为1.0 μL。
质谱条件：离子源温度250 ℃；传输线温度为280 ℃；溶剂切换时间为2 min；电子电离（electron ionization，EI）源；Scan扫描。
定性定量：根据保留时间定性，采用峰面积归一化法定量。
1.3.5 感官评价
参考T/GZSX017—2020《贵州米酒》[26]，对米酒的感官品质进行评分，选取培训过的白酒品评人员从苗家米酒的色泽和外观、香气、口味及风格4个方面进行评价，满分为100分，传统苗家米酒感官评分标准见表2。
表2 传统苗家米酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of traditional Miao rice wine
项目 感官评价 感官评分/分色泽和外观液体清亮，色泽均匀，无沉淀色泽较均匀，略浑浊，无沉淀色泽不均匀，有明显沉淀或悬浮物11～15 6～10 1～5
续表
项目 感官评价 感官评分/分香气口味风格酒香浓郁，纯正协调自然酒香，柔和但不够协调淡而无味，带涩味或其他混杂气味酒体醇厚柔和，诸香和谐纯正酒体淡薄，柔和但不够协调淡而无味，带涩味或其他混杂气味风格独特，色、香、味协调风格明显，色、香、味较协调风格不明显，色、香、味尚协调26～35 16～25 1～15 26～35 16～25 1～15 11～15 6～10 1～5
1.3.6 数据分析
采用Origin 2021进行图像绘制和数据处理，Design-Expert 13.0用于响应面试验设计和数据分析。
2 结果与分析
2.1 发酵条件优化单因素试验结果
2.1.1 发酵时间的确定
糖化发酵时间对苗家米酒感官评分和酒精度的影响见图1。由图1可知，发酵时间为22～30 d时，苗家米酒感官评分呈上升趋势，酒精度快速上升；发酵时间为30 d时，苗家米酒的感官评分达到最高，为83.67分，米酒的酒精度为29.5%vol；当发酵时间＞30 d时，感官评分逐渐下降，酒精度缓慢上升。综合考虑，确定最佳发酵时间为30 d。
图1 发酵时间对苗家米酒感官评分和酒精度的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on sensory score and alcohol content of Miao rice wine
2.1.2 酒曲添加量的确定
酒曲添加量对苗家米酒感官评分和酒精度的影响见图2。由图2可知，酒曲添加量＜3%时，米酒感官评分及酒精度快速增加；当酒曲添加量为3%时，感官评分为最高值，为85分，此时，酒精度为29.2%vol；当酒曲添加量＞3%时，米酒感官评分下降，酒精度缓慢增加。其原因可能是，酒曲添加量的增加，米酒的苦味加重，研究表明，苦味物质的主要来源是高级醇[27]，酒曲会影响高级醇的含量，从而影响其苦味。综合考虑，确定最佳酒曲添加量为3%。
图2 酒曲添加量对苗家米酒感官评分和酒精度的影响
Fig.2 Effect of Jiuqu addition on sensory scores and alcohol content of Miao rice wine
2.1.3 发酵温度的确定
发酵温度对苗家米酒感官评分和酒精度的影响见图3。由图3可知，当发酵温度＜28℃时，感官评分及酒精度均快速增加；当发酵温度为28℃时，感官评分达到最大值（84.67分），此时，酒精度为28.4%vol；当发酵温度＞28 ℃时，感官评分下降，酒精度缓慢增加。综合考虑，确定最佳发酵温度为28 ℃。
图3 发酵温度对苗家米酒感官评分和酒精度的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory score and alcohol content of Miao rice wine
2.2 发酵条件优化响应面试验结果与分析
2.2.1 多元回归方程及方差分析
在单因素试验结果的基础之上，以发酵时间（A）、酒曲添加量（B）、发酵温度（C）为3个影响因素，以感官评分（Y）为响应值进行响应面试验，确定苗家米酒的最佳发酵工艺条件，响应面试验设计及结果见表3，方差分析见表4。
表3 苗家米酒发酵条件优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface for fermentation condition optimization of Miao rice wine
试验号 A B C 感官评分/分1234567891 0-1 1-1 1-1 1-1-1-1 110000-0000-1-1 11-1-1 11 12 13 14 15 16 17 1000000000 1 1-1100000 1100000 74.4 81.0 79.0 82.8 73.0 77.0 77.0 83.4 74.0 75.3 76.9 85.1 86.0 84.9 84.6 84.0 85.4
表4 回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值模型ABCA B AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总和334.46 54.08 31.72 66.53 1.96 1.44 11.80 36.80 31.24 82.40 4.20 1.87 2.33 338.66 91111111117341 6 37.16 54.08 31.72 66.53 1.96 1.44 11.80 36.80 31.24 82.40 0.5995 0.6229 0.5820 61.99 90.20 52.91 110.97 3.27 2.40 19.68 61.38 52.10 137.44＜0.000 1**＜0.000 1**0.000 2**＜0.000 1**0.113 5 0.165 1 0.003 0**0.000 1**0.000 2**＜0.000 1**1.07 0.445 6
采用Design-Expert 13.0软件对表3结果进行统计分析得到二次多项回归方程为：
由表4可知，该模型显著（P值＜0.01）；失拟项不显著（P值=0.445 6＞0.05），表明试验结果与回归模型之间具有良好的拟合度。模型的决定系数R2=0.987 6，调整决定系数R2adj=0.971 7，表明该试验拟合程度高，可以用该模型预测试验结果。由P值可知，一次项A、B、C，二次项A2、B2、C2及交互项BC对结果影响极显著（P＜0.01），其他项对结果影响均不显著（P＞0.05）。由F值可知，3个因素对感官评分影响的次序为C＞A＞B，即发酵温度＞发酵时间＞酒曲添加量。
2.2.2 响应面分析
响应曲面图在水平方向落下的投影是等高线，等高线若呈椭圆形，表示这两因素有极为显著的交互作用[28]。各因素间交互作用对苗家米酒感官评分影响的响应曲面及等高线见图4。由图4可知，酒曲添加量（B）和发酵温度（C）等高线图接近椭圆形，交互作用显著，与方差分析结果一致。
图4 各因素间交互作用对感官评分影响的响应面及等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of the interaction between each factors on sensory evaluation
通过Design-Expert 13.0软件进行预测，获得苗家米酒的最佳工艺条件为：发酵时间31.724 d、酒曲添加量3.449%、发酵温度28.885 ℃。在该工艺条件下，苗家米酒的感官评分预测值为86.626分。结合实际，将苗家米酒的最佳工艺条件修正为：发酵时间32 d，酒曲添加量3.5%，发酵温度29 ℃，在此条件下进行验证试验，米酒感官评分实际值为86.33分，与模型预测值较为接近，说明该模型可以用于苗家米酒的工艺优化。
2.3 苗家米酒品质分析
苗家米酒具有米酒特有的色泽及清香气味，味感柔和，酸甜可口，米酒的酒精度为29%vol，菌落总数0 CFU/g，大肠菌群0 MPN/g，符合NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》[29]的要求。
2.4 挥发性风味物质的测定
采用GC-MS对苗家米酒的挥发性风味物质进行测定，结果见表5。由表5可知，传统苗家米酒共检出挥发性风味物质21种，其中醇类2种、酯类3种、酸类4种、醛类6种、酮类2种及其他类4种，这些香气成分构成了苗家米酒的独特风味。其中，酸类化合物的相对含量最高，为15.95%，酸类物质是酯化反应的前体物质，同时又能增加酒体的醇厚度，有机酸是重要的味感剂，在一定程度上可减少或消除酒中的苦杂味[30]。醇类化合物是酒香气的主要构成物质，主要由糖代谢、氨基酸脱羧和脱氢产生，适量的醇使能使苗家米酒的香气浓郁丰富[31]，苯乙醇具有令人愉快的香味，能与脂肪酸形成具有玫瑰花香及水果香的酯类化合物，普遍存在于生物发酵品之中，是重要的呈香物质。酯类物质的相对含量虽低，但是酒类花香和果香气味的主要贡献者，己酸乙酯似菠萝香气、味甜爽口，辛酸乙酯具有梨和菠萝的香气[32]，更有研究表明辛酸乙酯香气强度贡献值比传统观点认为的四大酯中的乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯均要大[33]，赋予了苗家米酒独特的风味。在苗家米酒中，还含有烯烃类等其他类物质，但是烯烃类成分阈值较高，因此对风味贡献值较小[34]。
表5 米酒挥发性物质检测结果
Table 5 Volatile substance test results of rice wine
种类 保留时间/s 化合物 香气特征[35-38] CAS号 相对含量/%酯类10.557 16.557 35.767正己酸乙酯辛酸乙酯棕榈酸乙酯果香，甜香果香，甜香，花香蜡，奶油香123-66-0 106-32-1 628-97-7合计酸类19.037 24.148 24.378 26.268磷酰基乙酸二亚油酸亚麻酸共轭亚麻仁油酸类似于乙酸乙酯的果香和香草香气淡淡的果香和香草香气一种淡淡的木质、草本和香料味道53044-27-2 60-33-3 506-21-8 2420-56-6合计酮类合计醇类合计16.852 19.895香薷酮去氢香薷酮淡淡的花香和木香淡淡的花香和木香488-05-1 6138-88-1 14.853 27.261苯乙醇3,4-二羟基苯基二醇具有蜂蜜和玫瑰样花香具有花香气味60-12-8 56114-62-6醛类15.72 18.681 19.674 20.372 21.504 30.452 2-壬烯醛反式-2-癸烯醛2.4-癸二烯醛反式-2,4-癸二烯醛反-2-十二烯醛9,17-烯醛具有明显的花香气味，类似于茉莉花的香气有橙子及鸡、家禽肉香味具有鸡油香气有似柑橘、脂肪、油炸鸡肉香、芫荽的香气具有似柑橘和脂肪气味18829-56-6 3913-81-3 25152-83-4 25152-84-5 20407-84-5 56554-35-9合计--其他14.949 22.653 24.764 29.012甲基五硅氧烷长叶烯十五烷8-十七烷烯松木似的木香香气--141-63-9 475-20-7 629-62-9 2579-04-6合计0.32 0.62 0.68 1.62 14.65 0.15 1.01 0.14 15.95 2.06 0.19 2.25 0.26 2 2.26 0.18 0.29 0.19 0.55 0.21 0.14 1.56 0.2 0.14 0.07 0.22 0.63
3 结论
本研究通过单因素试验和响应面试验确定传统苗家米酒的最佳发酵条件：发酵时间32 d，酒曲添加量3.5%，发酵温度29 ℃。在此优化条件下，米酒感官评分为86.33分，酒精度为29%vol，其理化及微生物指标符合相关标准要求。传统苗家米酒共检出挥发性风味物质21种，其中醇类2种、酯类3种、酸类4种、醛类6种、酮类2种及其他类4种，酸类的相对含量最高，为15.95%。此研究为苗家米酒的发展提供一定参考，有利于推动其产业化。
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