多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）是指碳链中含有两个或两个以上双键的脂肪酸，主要包括亚油酸（linoleic acid，LA）、亚麻酸（linolenic acid，LNA）及其衍生物[1-3]。PUFAs是人及动物生长发育所必需的脂肪酸，对人体有重要的生理功能[4-6]。PUFAs能调节人体的脂质代谢，治疗和预防心脑血管疾病，促进生长发育[7-9]，此外对抗癌、免疫调节、延缓衰老、减肥、美容等方面均具有重要的生理作用[10-12]。目前PUFAs主要从植物种子、海洋鱼油和一些哺乳动物中提取，但加工处理复杂且污染严重[13-15]。微生物作为PUFAs的又一主要来源，相比植物种子、海洋鱼油和一些哺乳动物，微生物具有生长周期短、培养简单、PUFAs含量高的特点[16-18]，使得利用微生物生产PUFAs成为近几年来人们研究的热点，尤其是日本、英国等国家已经先后问世了PUFAs中花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）的发酵产品[19-21]。国内在这一领域的研究起步较晚，虽然在发酵生产PUFAs方面有了一定的研究，但是还存在菌体生物量和油脂产量偏低的问题，与国外发达国家相比还有着不足和差距，离大规模生产存在一定的距离[22-23]。
玉米粉水解糖液作为发酵工业物美价廉的重要原料，含有葡萄糖、蛋白质、脂肪及多种维生素、矿物质和微量元素等[24-26]。目前国内外微生物主要以葡萄糖为碳源发酵生产PUFAs，相比葡萄糖，玉米糖具有成本低，含营养物质丰富等优点[27-28]。
本研究以高山被孢霉（Mortierella alpina）3.12824为发酵菌株，玉米糖为碳源，酵母膏为氮源，以生物量和油脂产量为评价指标，通过单因素试验、正交试验对菌株3.12824产PUFAs发酵条件进行优化。采用气相色谱（gaschromatography，GC）法分析油脂中脂肪酸组成，为高山被孢霉3.12824工业化生产PUFAs提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
高山被孢霉（Mortierella alpina）3.12824：中国普通微生物菌种保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）。
1.1.2 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基[29]：马铃薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、琼脂20.0 g/L。121 ℃灭菌20 min。
液体种子培养基[30-31]：葡萄糖30.0 g/L、酵母膏6.0 g/L、KH2PO4 3.0 g/L、NaNO3 3.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 6.0。装液量200 mL/L，121℃灭菌30min。
液体发酵培养基[30-31]：玉米糖70.0 g/L、酵母膏10.0 g/L、KH2PO4 3.8 g/L、NaNO3 3.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 6.0。装液量200 mL/L，121 ℃灭菌30 min。
1.1.3 化学试剂
葡萄糖、盐酸、磷酸二氢钠（均为分析纯）：北京化工厂；酵母粉（生化试剂）：上海麦克林生化科技有限公司；硫酸镁（分析纯）：天津市津北精细化工有限公司；无水乙醇、石油醚（均为分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；氢氧化钠、硝酸钠（均为分析纯）、琼脂粉（生化试剂）：天津光复精细化工研究所。
1.2 仪器与设备
NTX-80B霉菌培养箱：天津市宏诺仪器有限公司；BgT-8A糖化仪：杭州博日科技有限公司；BSD-TX270恒温振荡器：上海博迅实业有限公司医疗医疗设备厂；RE 5298A旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；JD-05高速万能粉碎机：上海市九鼎工贸有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵：北京科伟永兴仪器有限公司；LH-T55数显折光仪：杭州陆恒生物科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌株3.12824发酵制备油脂工艺流程及操作要点
菌种斜面试管保藏→菌种传代活化→菌体种子液制备→菌体分散接种→菌体发酵液制备→真空抽滤分离菌体→收集湿菌体→菌体干燥→干菌体→菌体粉碎→索氏提取→旋转蒸发器脱水脱溶→油脂
操作要点：
菌种活化：将高山被孢霉3.12824接种到PDA斜面上，25 ℃恒温培养7 d，形成厚度适中的白色绒毛状菌落，4 ℃保存。
种子液的制备：用移液枪向活化后的高山被孢霉斜面加入20 mL无菌水，无菌接种环刮去斜面上的孢子制成孢子悬液，接种于装有200 mL种子培养基的1 L三角瓶中，于25 ℃、200 r/min振荡培养3 d，得到种子液。
发酵液的制备：培养结束的种子液倒入高温灭菌烧杯中，用分散机8 000 r/min打散种子液20 s，而后用移液枪取体积为10%的种子液于装液量为200 mL/L发酵培养基中。25 ℃、200 r/min振荡培养7 d，得到发酵液。
菌体收集、干燥：将发酵液用真空泵抽滤，所得菌体加蒸馏水洗涤3次，于70 ℃烘干至恒质量，得干菌体，并计算菌体生物量（菌体干质量/发酵液体积）。
油脂的制备：干菌体用研钵磨碎成粉末后，于索氏提取器中石油醚60 ℃不断冷凝回流提取5 h，收集全部回流液。旋转蒸发仪回收石油醚，得到油脂，并计算油脂产量（油脂干质量/发酵液体积）。
1.3.2 发酵条件优化
（1）单因素试验
在碳源为玉米糖70.0 g/L、氮源为酵母膏10.0 g/L、微量元素KH2PO43.8 g/L、NaNO33.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、培养温度26 ℃、培养时间6 d、pH 6.0、装液量200 mL/L基础条件下，固定其他因素，分别改变碳源添加量、氮源添加量、初始pH值、发酵温度、装液量、发酵时间，研究各单因素对菌株发酵生物量及油脂产量的影响。
（2）正交试验
根据单因素试验结果，进行4因素3水平L9（34）正交试验设计优化发酵工艺条件，以生物量及油脂产量为评价指标，分别考察发酵温度（A）、发酵时间（B）、初始pH值（C）、装液量（D）4个因素对高山被孢霉发酵产油脂的影响，发酵条件优化正交试验因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization
水平 A 发酵温度/℃ B 发酵时间/d C 初始pH值 D 装液量/（mL·L-1）1 2 3 24 25 26 6 7 8 6.0 6.5 7.0 150 200 250
1.3.3 油脂脂肪酸组成测定
采用气相色谱法分析高山被孢霉3.12824产油脂中脂肪酸组成。
气相色谱条件：毛细管色谱柱，聚二氰丙基硅氧烷强极性固定相（100 m×0.25 mm×0.2 μm）；火焰离子检测器（flame ionization detector，FID）；进样器温度为280 ℃，载气为氮气（N2），进样体积1.0 μL。
定性定量分析：采用保留时间定性，归一化法定量。
2 结果与分析
2.1 发酵条件优化单因素试验
2.1.1 氮源添加量对菌株3.12824发酵的影响
对高山被孢霉而言，培养基中氮源质量浓度对菌丝体生长和油脂积累影响很大，碳源质量浓度相同的条件下，氮源质量浓度过高或过低都不利于油脂的积累。在其他条件不变的情况下，考察酵母膏添加量（6.0 g/L、8.0 g/L、10.0 g/L、12.0 g/L、14.0 g/L）对菌株3.12824生物量及油脂产量的影响，结果见图1。
图1 酵母膏添加量对生物量和油脂产量的影响
Fig.1 Effect of yeast extract addition on biomass and oil production
由图1可知，随着酵母膏添加量在6～12.0 g/L范围内的提高，生物量逐渐升高，油脂产量也逐渐增加；当酵母膏添加量为12.0 g/L时，生物量达到23.00 g/L，而油脂产量达到最高值8.74 g/L；酵母膏添加量＞12.0 g/L之后，生物量随之稍有增加，但油脂产量随之降低。其原因为充足的氮源使菌体生长不受抑制，生物量小幅度提高，导致碳源可能主要用于菌体生长方向，脂类合成方向受阻，从而使油脂产量降低。综合考虑，酵母膏最适添加量为12.0 g/L。
2.1.2 碳源质量浓度对菌株3.12824发酵的影响
高山被孢霉胞内油脂的主要存在形式是甘油三酯，而甘油三酯主要元素为碳。在其他条件不变的情况下，考察玉米糖添加量（65.0 g/L、70.0 g/L、75.0 g/L、80.0 g/L、85.0 g/L）对菌株3.12824生物量及油脂产量的影响，结果见图2。
图2 玉米糖添加量对生物量和油脂产量的影响
Fig.2 Effect of corn sugar addition on biomass and oil production
由图2可知，当玉米糖添加量为65～80.0 g/L时，生物量和油脂产量随之增加；当玉米糖添加量为80.0 g/L时，生物量和油脂产量达到最高值，分别为23.00 g/L和8.51 g/L；当玉米糖添加量＞80.0 g/L之后，生物量和油脂产量有所下降。因此，最适玉米糖添加量为80.0 g/L。
2.1.3 初始pH值对菌株发酵3.12824的影响
初始pH值会改变细胞膜电荷，影响其对营养物质的吸收，同时还影响代谢过程中酶的活性。高山被孢霉生产油脂的pH值为4～8，在其他条件不变的情况下，分别考察初始pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）对菌体生物量和油脂产量的影响，结果见图3。
图3 初始pH值对生物量和油脂产量的影响
Fig.3 Effect of initial pH value on biomass and oil production
由图3可知，当初始pH值为5.5～6.5时，生物量及油脂产量随之增加；当初始pH值为6.5时，生物量及油脂产量达到最大值，分别为22.50 g/L和8.45 g/L；当初始pH值＞6.5之后，生物量及油脂产量有所下降。因此，最适初始pH值为6.5。
2.1.4 发酵时间对菌株3.12824发酵的影响
发酵时间对菌株发酵十分重要，培养时间过短，菌体无法良好生长，导致油脂无法很好的积累。培养时间过长，发酵成本变高，同时出现自溶现象，导致油脂进入培养基中，很难收集。在其他条件不变的情况下，考察发酵时间（6 d、7 d、8 d、9 d、10 d）对菌体生物量和油脂产量的影响，结果见图4。
图4 发酵时间对生物量和油脂产量的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on biomass and oil production
由图4可知，当发酵时间在6～7 d，随着培养时间延长，菌体生物量和油脂产量明显提高；当发酵时间在7 d时达到菌体生物量和油脂产量最大值，分别为24.00 g/L和8.40 g/L；当发酵时间在7～10 d时，随着培养时间的延长，菌体生物量和油脂产量均稍有下降。随着培养时间延长，菌丝体利用发酵培养基内的营养物质逐步累积代谢油脂，油脂产量也有明显提高，发酵时间过长，菌丝体不再生长，且产生自溶现象，导致生物量及油脂产量也逐步下降。因此，最适发酵时间为7 d。
2.1.5 发酵温度对菌株3.12824发酵的影响
当发酵温度过低时，菌丝生长受到抑制。其原因是低温不利于菌株吸收利用碳源，导致整个发酵过程中菌株生长缓慢；此外，菌株在低温条件下存在更长的延滞期，这也是生物量降低的因素之一。在其他条件不变的情况下，考察发酵温度（23 ℃、24 ℃、25 ℃、26 ℃、27 ℃）对菌体生物量和油脂产量的影响，结果见图5。
图5 发酵温度对生物量和油脂产量的影响
Fig.5 Effect of fermentation temperature on biomass and oil production
由图5可知，当发酵温度为23～25 ℃时，生物量和油脂产量随之增加；当发酵温度达到25 ℃时，高山被孢霉生物量和油脂产量达到最大值，分别为22.12 g/L和8.42 g/L；当发酵温度＞25 ℃之后，生物量及油脂产量逐步降低。其原因为高山被孢霉生长是一个高需氧的过程，发酵液溶氧能力会随着温度的升高缓慢降低，当发酵温度太高，发酵液中低的溶氧量会抑制菌株生长，导致菌体生物量降低，油脂产量降低。因此，最适发酵温度为25 ℃。
2.1.6 装液量对菌株3.12824发酵的影响
高山被孢霉属好氧菌，发酵生产油脂过程中有很大的氧需求量。装液量主要是通过改变氧供给来影响菌株发酵。装液量过多，培养液液面与空气接触面积变小，相对氧气量就会变少，进而会导致由于氧气不足而抑制菌体生长和发酵产油脂；装液量过少，培养液液面与空气接触面积变大，氧气量充足，但菌体的生长会因营养物质的缺乏而受限制。在其他条件不变的情况下，考察装液量（100 mL/L、150 mL/L、200 mL/L、250 mL/L、300 mL/L）对菌体生物量和油脂产量的影响，结果见图6。
图6 装液量对生物量和油脂产量的影响
Fig.6 Effect of liquid medium volume on biomass and oil production
由图6可知，当装液量为100～200 mL/L时，高山被孢霉生物量及油脂产量随之增加；当装液量为200 mL/L时，高山被孢霉生物量及油脂产量达到最大值，分别为20.62 g/L和6.75 g/L；当装液量为200～300 mL/L时，高山被孢霉生物量及油脂产量有所下降。因此，最适装液量为200 mL/L。
2.2 发酵条件优化正交试验
在单因素试验基础上。在培养基玉米糖添加量80.0 g/L、酵母膏添加量12.0 g/L、KH2PO4 3.8 g/L、NaNO3 3.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L的条件下，考察发酵温度（A）、发酵时间（B）、初始pH值（C）、装液量（D）四个因素对高山被孢霉发酵产油脂的影响，正交试验结果与分析见表2，方差分析结果见表3。
表2 发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization
试验号 A B C D 生物量/（g·L-1）油脂产量/（g·L-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 3 2 3 2 1 2 1 3 1 2 3 3 1 2 2 3 1 21.37 22.63 22.74 22.26 23.68 23.02 22.37 22.38 22.69 7.06 8.22 8.14 7.75 8.72 8.36 7.86 7.83 7.99 k1生物量k2 k3极差R油脂产量k1 k2 k3极差R 22.683 23.300 23.263 0.617 7.938 8.137 8.113 0.200 20.483 25.400 23.363 4.917 7.157 8.850 8.182 1.693 22.887 23.363 22.997 0.477 7.977 8.164 8.047 0.187 23.013 23.417 22.817 0.600 8.047 8.194 7.948 0.246
表3 正交试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results
注：F0.05（2，2）临界值=19.00。“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
指标 方差来源 离差平方和 自由度 均方 F 值 P 值生物量1.921 97.968 0.342 0.010*油脂产量ABCDABCD 0.718 36.616 0.374 0.561 0.071 4.365 0.054 0.092 222 22222 0.359 18.308 0.187 0.281 0.036 2.182 0.027 0.046 1.502 1.330 81.400 0.400 0.429 0.012*1.719 0.368
由表2可知，影响生物量的4因素主次顺序为B＞A＞D＞C，最佳发酵条件为A2B2C2D2。影响油脂产量的4因素主次顺序为B＞D＞A＞C，最佳发酵条件组合为A2B2C2D2。因此，得到最佳发酵条件为装液量200 mL/L、发酵时间7 d、发酵温度25 ℃、初始pH 6.5。在此优化条件下进行3次平行验证试验，生物量为26.05 g/L，油脂产量为9.37 g/L。
由表3可知，影响菌株发酵生物量和油脂产量的4个因素中，发酵时间对生物量、油脂产量均有显著影响（P＜0.05），培养温度、装液量、初始pH值均无显著影响（P＞0.05）。
2.3 油脂脂肪酸组成
采用气相色谱分析高山被孢霉产油脂中脂肪酸组成，结果见图7和表4。由图7和表4可知，油脂中不饱和脂肪酸C18：1、C18：2、C18：3、C20：4、C20：4的含量分别为17.72%、5.73%、0.75%、5.83%、39.93%，总含量超过69.00%，其中多不饱和脂肪酸（C18：2、C18：3、C20：3、C20：4）的总含量超过52.00%，花生四烯酸含量最为丰富，含量达到39.93%，可进一步作为功能性油脂深入研究。
图7 高山被孢霉产油脂脂肪酸组成分析气相色谱图
Fig.7 Gas chromatogram of fatty acids analysis in oil produced by Mortierella alpina
表4 高山被孢霉所产油脂中脂肪酸组成分析结果
Table 4 Composition analysis results of fatty acids in oil produced by Mortierella alpina
序号 脂肪酸名称 保留时间/min 含量/%1 软脂酸（C16:0） 16.849 15.28
续表
序号 脂肪酸名称 保留时间/min 含量/%2 3 4 5 6 7 8硬脂酸（C18:0）油酸（C18:1）亚油酸（C18:2）十八碳三烯酸（C18:3）花生三烯酸（C20:3）花生四烯酸（C20:4）二十二烷酸（C22:0）19.335 19.842 22.032 24.723 27.865 29.852 30.251 4.95 17.72 5.73 0.75 5.83 39.93 2.10
3 结论
本研究通过单因素试验和正交试验，确定了高山被孢霉产多不饱和脂肪酸的最佳发酵条件，试验结果表明，当碳源玉米糖液添加量为80.0 g/L、氮源酵母膏添加量为12.0 g/L、KH2PO4为3.8 g/L、NaNO3为3.4 g/L、MgSO4·7H2O为0.5 g时，影响生物量主次顺序为B＞A＞D＞C，即发酵时间＞发酵温度＞装液量＞初始pH值，影响油脂产量主次顺序为B＞D＞A＞C，即发酵时间＞装液量＞发酵温度＞初始pH值。高山被孢霉产多不饱和脂肪酸的最佳发酵条件为装液量200 mL/L、发酵时间为7 d、发酵温度25 ℃、初始pH值为6.5，在此优化条件下，菌株发酵生物量和油脂产量分别达到26.05 g/L和9.37 g/L。通过气相色谱分析油脂中脂肪酸组成，油脂中不饱和脂肪酸C18：1、C18：2、C18：3、C20：3、C20：4的含量分别为17.72%、5.73%、0.75%、5.83%、39.93%，总含量超过69.00%，其中多不饱和脂肪酸（C18：2、C18：3、C20：3、C20：4）的总含量超过52.00%。
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