玉米是我国重要粮食来源之一,广泛种植于中国北方、西南山区及其他旱谷地区[1]。玉米碴是玉米经脱皮、去胚芽后得到的玉米碎,玉米粉是由玉米碎经过粉碎磨细后过筛得到的,但未经过加工改良的玉米碴口感粗糙、硬度高,所制得的玉米粉颗粒大、质地不细腻,玉米面制品口感不佳,各地区生产的玉米碴都是用于饲料或者工业原料[2]。随着科技的进步,对玉米的研究也逐渐增多,也有诸多学者以玉米碴为原料来研究加工改良玉米粉品质特性[3]。早年前国内外对玉米碴的加工方法主要是酸法处理、酶法处理和物理法,但是由于三种方法的成本高、专业性强和仪器设备昂贵等诸多问题[4],使得玉米碴的加工方法逐渐向发酵技术发展。
玉米微生物发酵多数是以乳酸菌发酵为主,刘晓峰等[5]用乳酸菌发酵玉米粉,结果表明经发酵后玉米粉的膨胀率和保水力都明显提高;AFOAKWA E O等[6]以乳酸菌为发酵菌种发酵玉米粉,发酵后发现其主要养分含量发生了明显改变;马勇等[7]以植物乳杆菌发酵玉米碴制作玉米面条,降低了面条的硬度、黏度和弹性增大,玉米面条品质得到改善,说明了使用微生物发酵,不论对玉米粉或玉米碴发酵都能改善玉米的品质。但是由于微生物生态作用多变复杂,因此还需要对微生物发酵进一步的探究。微生物发酵最容易受外界条件干扰,对发酵条件的优化工作尤为重要[8-9]。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)属于乳酸杆菌属,是人体中最要的益生菌之一[10],产乳酸能力高于其他乳杆菌,乳酸及其代谢产物是形成风味化合物的重要物质[11],且能分泌多种消化酶,在乳酸及其产物和消化酶的作用下,玉米粉中的淀粉与蛋白质发生水解,可与其他分子结合形成结晶,使淀粉结构发生改变,从而影响玉米粉的特性,达到玉米粉改性的效果[12]。溶解度和膨胀力作为玉米粉特性的重要指标,两者关系着玉米粉糊化程度,对玉米粉品质特性有一定的影响,并且溶解度和膨胀力的大小与支链淀粉和直链淀粉比例有关,且发酵效果越好,两者变化越明显[13]。嗜酸乳杆菌发酵的代谢产物含有多种酸性物质和酶可促进淀粉等大分子物质水解,可提高淀粉与水的结合能力,使溶解度和膨胀力增大[14]。溶解度和膨胀力越高,玉米粉的糊化特性改变越剧烈[15-16],因此嗜酸乳杆菌发酵能够起到改善玉米品质的效果。为了进一步探究玉米碴发酵的工艺参数,以便后期进一步对玉米粉品质特性方面的研究,本研究以玉米碴为原料,利用嗜酸乳杆菌作为发酵剂对玉米碴进行发酵,制成玉米粉,采用单因素试验和响应面分析法,以玉米粉溶解度和膨胀力为指标,对嗜酸乳杆菌发酵玉米碴的工艺进行优化,进一步推动微生物在玉米发酵行业的发展、为玉米粉加工提供一定的理论依据。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus):江苏新申奥生物科技有限公司。MRS培养基、琼脂粉:北京奥博星生物技术有限责任公司;玉米碴(整粒脱皮):市售。
DHG-9000电热鼓风干燥箱、HWS-26型电热水浴锅:上海一恒科学仪器有限公司;ZHWY-2102C型恒温摇床培养箱:上海捷呈实验仪器有限公司;TG16-WS台式高速离心机:湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;SHZ-B水浴恒温振荡器:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;FA214电子分析天平:上海海康电子仪器厂;LY-100型破壁机:湖北因特文化用品有限公司。
1.3.1 玉米碴发酵工艺流程及操作要点
玉米碴→浸泡→发酵→清洗→打浆→过滤→干燥→粉碎→过筛→玉米粉
操作要点:
清洗:称取100 g的玉米碴,用自来水冲洗掉表面杂质和粉尘,冲洗多次直至水面清澈。
浸泡:冲洗干净后的玉米碴加入3倍玉米碴体积量的水浸泡24 h。
发酵:玉米浸泡完后,先用水冲洗两遍,加入无菌水,玉米与无菌水的比例为1∶1.5(g∶mL),紫外灭菌15 min,接入一定比例的嗜酸乳杆菌菌液,用组培封口膜封口,于37 ℃、160 r/min摇床条件下进行发酵。
打浆:玉米发酵后,用自来水反复冲洗,除去酸臭味,再用蒸馏水冲洗3遍,洗干净后放入打浆机加3倍量的水进行打浆,用打浆机研磨两次后得到玉米浆液。
过滤和干燥:浆液用无菌滤布自然状态下过滤,得到的玉米碴于热风干燥箱40 ℃中干燥10 h。
粉碎、过筛:烘干后的玉米碴用粉碎机粉碎,过200目筛,得到玉米粉。
1.3.2 菌种活化及培养液制备
用接种环挑取少量嗜酸乳杆菌的菌粉,接种于液体MRS培养基中,置于160 r/min摇床37 ℃培养24 h,得到活化的菌悬液,吸取1%活化后的菌悬液分别接到MRS液体培养基中,160 r/min、37 ℃摇床培养24 h(菌液浓度达到108 CFU/mL以上),得到种子液,再吸取1%的种子液接到新配制的MRS液体培养基中,将传代2次的菌液作为培养液。
1.3.3 嗜酸乳杆菌发酵能力的测定
(1)产酸能力的测定
吸取1%种子液于新鲜的MRS液体培养基,160 r/min、37 ℃摇床培养,每隔2 h用数显pH计测量pH值,并绘制时间与pH值的相关曲线,测定嗜酸乳杆菌24 h的产酸能力。
(2)生长曲线绘制
取多支试管,每支试管加入9 mL液体培养基,将上述制备好的培养液按1%接种量接入各试管,摇匀后于摇床中培养24 h,每隔2 h取培养液作梯度稀释,选取最后2~3个适宜的稀释梯度进行平板倾注,培养24 h后进行活菌计数。以测定时间作为横坐标、活菌数作为纵坐标绘制生长曲线。
1.3.4 溶解度和膨胀力测定
参照DA SILVA M A等[17]的方法进行修改,取发酵后得到的玉米粉0.2 g,加入10 mL蒸馏水,置于带刻度的离心管中振荡加热30 min左右,然后放入冷水中冷却,冷却后置于高速离心机离心,取上清液倒入称好质量的称量瓶(烘干后)中,放入烘箱中烘干至质量恒定,称及烘干物和离心管沉淀物的质量,测量玉米粉的溶解度和膨胀力。计算公式如下:
1.3.5 玉米碴发酵工艺的单因素设计试验
以玉米粉溶解度和膨胀力为评价指标,设置基础条件为发酵温度37 ℃、时间48 h、接种量10%、玉米碴与无菌水的比例1.5∶1(mL∶g),分别设计不同发酵时间(24 h、48 h、72 h、96 h、120 h)、发酵温度(29 ℃、33 ℃、37 ℃、41 ℃、45 ℃)、接种量(5%、10%、15%、20%、25%)、液料比(mL∶g)(1∶1、1∶1.25、1∶1.5、1∶1.75、1∶2)进行单因素试验,每个处理重复3次。
1.3.6 响应面优化试验设计
根据单因素试验的结果,以玉米粉膨胀力为评价指标,选择发酵时间(A)、发酵温度(B)、接种量(C)、液料比(D)为评价因素设计4因素3水平响应面试验,通过Design-Expert 8.0.6 软件分析确定玉米碴的最佳发酵工艺条件,Box-Benhnken试验因素与水平见表1。
表1 玉米碴发酵工艺优化Box-Benhken试验设计因素及水平
Table 1 Factors and levels of Box-Benhken experiments for fermentation conditions optimization of corn grit
时间/h B 发酵温度/℃ C 接种量/% D 液料比(mL∶g)1 0 -1 24 48 72 33 37 41 5 10 15 1.25∶1 1.50∶1 1.75∶1
1.3.7 数据处理
采用Origin 8.5软件绘图;使用Design-Expert V8.0.6设计软件进行响应面试验及分析。
吸取活化后的嗜酸乳杆菌种子液1%接入MRS液体培养基中,置于摇床37 ℃条件下培养24 h,每2 h测定一次活菌数,得到菌株的生长曲线,结果见图1。
图1 嗜酸乳杆菌的生长曲线及产酸曲线
Fig.1 Growth curve and acid-producing curve of Lactobacillus acidophilus
由图1可知,嗜酸乳杆菌在0~6 h为迟滞期,菌株在此阶段的活性最高,6~18 h为生长对数期,菌株在此阶段的生长速度最快,在18 h时菌株生长最快,活菌数达到5.89×109 CFU/mL,18 h后菌株生长开始下降,20~24 h为稳定期,时间越长培养基内的营养物质消耗越快,嗜酸乳杆菌生长缓慢,趋于稳定。随发酵时间增加,菌液中pH值不断下降,到20 h后变化缓慢,逐渐处于稳定状态。在0~20 h内菌株处于对数生长期,此时嗜酸乳杆菌生长力旺盛、产酸能力强,因此这阶段中菌液的pH值逐渐下降,菌液也逐渐变酸,菌株对发酵基质消耗利用越高。20 h后由于菌株生长稳定pH值变化稳定,其原因可能是培养基的营养物质消耗殆尽使菌种生长缓慢分泌的有机酸少。随着培养时间越长,菌种自身代谢出的有害物质会起到反抑制作用,因此菌种培养时间不宜过长。所以选用培养18 h的嗜酸乳杆菌培养液用于后续发酵试验最佳。
2.2.1 发酵时间对玉米粉溶解度和膨胀力的影响
发酵时间对玉米粉溶解度和膨胀力的影响见图2。由图2可知,随发酵时间的增加,玉米粉溶解度和膨胀力先增大后降低,在48 h时玉米粉的溶解度和膨胀力最大。玉米粉溶解度和膨胀力在24~48 h处于上升阶段,到48 h达到最大值,其原因可能是菌种在此阶段生长快速,代谢活力旺盛,分泌出大量的乳酸、淀粉酶和蛋白酶对淀粉和蛋白质分子结合产生一定的影响,且发酵也会使更多的有机营养物质析出,使得膨胀力和溶解度增大,并且在48 h阶段积累的乳酸、淀粉酶和蛋白酶最多,发酵最更加充分。在48 h后,玉米粉溶解度和膨胀力表现出下降趋势,分析其原因可能是长时间的发酵,使得发酵体系中营养物质的降低以及代谢产物的抑制,导致菌种的衰亡,菌种消亡导致发酵体系也下降[19],因此最适发酵时间为48 h。
图2 发酵时间对玉米粉溶解度和膨胀力的影响
Fig.2 Effect of fermentation time on solubility and swelling power of corn flour
2.2.2 发酵温度对玉米粉溶解度和膨胀力的影响
发酵温度对玉米粉溶解度和膨胀力的影响见图3。由图3可知,玉米粉的溶解度和膨胀率随温度的升高趋势改变明显,且在37 ℃时溶解度和膨胀力达到最大值。嗜酸乳杆菌在37 ℃生长繁殖快,此温度是嗜酸乳杆菌最适生长温度,也是最适发酵温度,37 ℃后玉米粉溶解度和膨胀力逐渐下降。可能是因为过低的温度阻碍嗜酸乳杆菌新陈代谢,体内生物物质合成缓慢,菌种能够产生的乳酸和酶含量变少,降解不完全导致淀粉与蛋白无法分离,淀粉无法吸水膨胀和溶解,这可能是膨胀率和溶解度力减小的原因;温度太高会导致嗜酸乳杆菌体内的消化酶失去活性,使发酵能力变弱,玉米粉的膨胀率和溶解度逐渐减小。因此最佳发酵温度为37 ℃。
图3 发酵温度对玉米粉溶解度和膨胀力的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on solubility and swelling power of corn flour
2.2.3 接种量对玉米粉溶解度和膨胀力的影响
接种量对玉米粉溶解度和膨胀力的影响见图4。由图4可知,玉米粉的溶解度和膨胀力随接种量的增加,先上升后缓慢下降,在接种量为10%时,玉米粉溶解度和膨胀力值最大。嗜酸乳杆菌能够分泌出大量乳酸和淀粉酶和蛋白酶等一些消化酶[20],在发酵过程中这些酶能够将玉米中含有的淀粉和蛋白质水解成新的化合物,便于与水等分子物质结合生成新的物质。玉米未经处理其内部结构非常结实,水等其他物质无法渗透[21],使得玉米粉加工性能低。玉米粉的溶解度和膨胀力对玉米淀粉结构有一定的影响[22]。淀粉酶和蛋白酶分解淀粉和蛋白使两者的相互作用力减弱从而达到分离的效果,淀粉易与水分子结合,玉米粉的溶解度和膨胀率逐渐提高,玉米粉的凝胶特性随之改变。嗜酸乳杆菌在发酵过程中产生的淀粉酶和蛋白酶会随着菌体的浓度增加而增加,接种量大使得淀粉和蛋白质分离的速度加快,溶解度和膨胀力会快速提高。但当接种量>10%时,膨胀率和溶解度却减小,原因可能跟嗜酸乳杆菌的代谢有关,嗜酸乳杆菌生长代谢需要氮源物质,玉米粉中的蛋白质是嗜酸乳杆菌生长所能获得的唯一氮源,玉米粉中的蛋白含量比较少,菌种的接种量大使得氮源供应不足,嗜酸乳杆菌的生长代谢受到影响;另一方面,随着接种量增加,产乳酸和淀粉酶的含量高,对淀粉颗粒的降解能力反而会更大[27],影响淀粉颗粒结构的完整度,反而抑制了玉米粉溶解和膨胀。因此嗜酸乳杆菌的最佳接种量为10%。
图4 接种量对玉米粉溶解度和膨胀力的影响
Fig.4 Effect of inoculum on solubility and swelling power of corn flour
2.2.4 液料比对玉米粉溶解度和膨胀力的影响
微生物发酵中料液比直接决定了培养基溶氧量[23],微生物体内含有大量的酶,这些酶类对于发酵环境的氧气浓度非常敏感。嗜酸乳杆菌是乳酸菌属,为兼性厌氧菌,过高的氧气含量会直接影响到菌体的生长发育,但是过低的氧气含量也会使发酵环境的pH过低[24-26]。液料比的比例影响发酵过程中菌体的生长代谢,液料比对玉米粉溶解度和膨胀力的影响见图5。
图5 液料比对玉米粉溶解度和膨胀力的影响
Fig.5 Effect of liquid material ratio on solubility and swelling power of corn flour
由图5可知,随着料液比的增加,溶解度和膨胀率都呈先升高后下降的趋势,在当液料比<1.5∶1(mL∶g)时,发酵液中的溶氧量高,发酵能力强,微生物体内的酶能较好地表达,对淀粉和蛋白质结构作用较大,蛋白质等物质溶解出来使得玉米粉的溶解度和膨胀力上升。料液比1.5∶1(mL∶g)时达到最大值,溶解度为11.96%,膨胀力为14.76 g/g。当液料比>1.5∶1(mL∶g)时,发酵液内的溶氧过低,微生物生长代谢受到抑制,体内的酶也无法较好地表达,对淀粉和蛋白质作用小,使得玉米粉的溶解度和膨胀力下降。因此发酵时最佳的料液比为1.5∶1(mL∶g)。
2.3.1 模型的建立及显著性检验
玉米粉溶解度容易受外界干扰如温度影响,温度越高越不稳定,膨胀力受影响较小,其次膨胀力的大小体现了颗粒表面结构破坏的程度,膨胀力越高发酵效果越好[20],因此在单因素试验的基础上,根据响应面试验设计原理,以膨胀力(Y)为响应值,选择发酵时间(A)、发酵温度(B)、接种量(C)和液料比(D)作为响应面优化的考察因素设计优化试验,结果见表2。
表2 玉米碴发酵工艺优化Box-Behnken试验设计与结果
Table 2 Design and results of Box-Benhken experiments for fermentation conditions optimization of corn grit
试验号 A B C D Y 膨胀力/(g·g-1)1234567891 0 0 1-1 0-1-1-1-1 1011000-00000-0011000110-0111000-10-110-11 12 13 14 15 16 17 10-11-1101000 100-1 1010-11-1 1 100 11.33 11.16 10.30 11.40 11.20 13.02 11.36 11.69 11.60 11.84 11.56 11.35 11.19 11.14 12.65 12.43 11.50
续表
试验号 A B C D Y 膨胀力/(g·g-1)18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 12.13 11.38 14.65 12.84 10.98 14.54 9.89 11.14 12.07 14.76 000--1 10010-0000-10-10-1-1 1100000-10 00 100 1100010
以玉米粉膨胀力为响应值,建立玉米碴发酵工艺参数回归模型,并对模型方程进行方差分析,结果见表3。
表3 以膨胀力为响应值的回归模型及方差分析
Table 3 Regression model and variance analysis with swelling power as response value
注:“**”表示对结果影响极显著(P<0.01);“*”表示对结果影响显著
(P<0.05)。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型14 ABCDA B***********AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2 32.15 17.06 19.47 9.55 25.29 4.48 2.16 0.40 2.06 3.57 0.11 168.98 279.39 143.02 71.32<0.000 1 0.001 4 0.000 8 0.009 4 0.000 3 0.045 9 0.167 5 0.540 7 0.177 1 0.083 3 0.918 2<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1********残差项失拟项净误差总和36.75 1.39 1.59 0.78 2.07 0.37 0.18 0.032 0.17 0.29 9.000E-004 13.81 22.83 11.69 5.83 0.98 0.96 0.024 37.77 R2=0.974 0 111111111111111 2 10 2 26 2.63 1.39 1.59 0.78 2.07 0.37 0.18 0.032 0.17 0.29 9.000E-004 13.81 22.83 11.69 5.83 0.082 0.096 0.012 7.91 0.117 4 R2adj=0.943 7
根据表2分析可得出回归方程:Y=14.65+0.34A-0.36B+0.25C+0.42D+0.3AB+0.21AC+0.09AD+0.21BC-0.27BD+0.015CD-1.61A2-2.07B2-1.48C 2-1.05D2
由表3可知,该模型的P<0.01,模型方程极显著,失拟项P=0.117 4>0.05,不显著,因此本试验的二次回归方程拟合度好,能预测上述4个因素对玉米粉膨胀力的影响;本试验的R2为0.974 0、变异系数为2.14%,说明拟合度越高、试验结果可靠。从回归系数显著性检验可知,一次项A、B、C、D及二次项A2、B2、C2、D2为极显著(P<0.01);交互项AB为显著(0.01<P<0.05);其余交互项AC、AD、BD、CD不显著(P>0.05)。从F值的变化大小可以看出,4个因素对玉米粉膨胀力影响的程度:液料比>发酵温度>发酵时间>接种量。
2.3.2 响应面图和等高线图分析
发酵时间、发酵温度、接种量、液料比4个因素之间的交互作用对玉米粉膨胀力影响的响应面图和等高线图见图7。
图7 各因素交互作用对膨胀力影响的响应面及等高线
Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of the interaction between various factors on the expansibility
响应面图曲面倾斜度越大即坡度越陡,等高线越接近椭圆形,因素交互作用越显著。由图7可知,各因素交互作用响应面开口均向下,且越向下颜色逐渐加深,说明玉米粉的膨胀力均随每个因素的增大而增大,达到一定峰值后逐渐减小,响应面坡度越陡、曲面颜色越深,则该因素对膨胀力影响越大。图中可以看出只有AB坡度较陡、曲面颜色较深,发酵时间与发酵温度的交互作用较显著(P<0.05),其他因素的交互作用对玉米粉膨胀力影响并不显著(P>0.05)。响应面各因素交互作用对结果影响大小:AB>BD>AC>BC>AD>CD,说明发酵时间与发酵温度交互对膨胀力影响最大,与方差分析结果一致。
2.3.3 玉米碴发酵最佳工艺参数的选取和模型验证试验
经软件分析得到最佳发酵工艺参数为液料比1.55∶1(mL∶g)、发酵温度36.64 ℃、发酵时间49.01 h、接种量10.44%。在此条件下,玉米粉膨胀力预测值为14.96 g/g。考虑到试验的可操作性,将最佳工艺条件参数修正为液料比1.5∶1(mL∶g)、发酵温度37 ℃、发酵时间49 h、接种量10%,修饰后进行3次重复试验。在此条件下,得出玉米粉膨胀力的实际值为14.76 g/g,与预测值相差不大,证明了模型拟合性良好,验证了模型的可靠性。
本研究通过单因素试验和Box-Behnken中心组合设计,优化玉米碴发酵的发酵工艺条件,得出最佳发酵工艺条件参数为:液料比1.5∶1(mL∶g)、发酵温度37 ℃、发酵时间49 h、接种量10%,此条件下,玉米粉溶解度为11.96%,膨胀力可达到14.76 g/g,试验结果表明,使用嗜酸乳杆菌对玉米进行发酵的过程中,影响玉米粉膨胀力的因素大小为液料比>发酵温度>发酵时间>接种量。发酵后得到的玉米粉从感官上来看粉质细腻柔软,玉米粉溶解度和膨胀力明显提高。
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Optimization of fermentation conditions of corn grit by Lactobacillus acidophilus