克氏原螯虾（Procambarus clarkia），俗称小龙虾，20世纪20年代由日本引入我国[1]，到20世纪70年代，克氏原螯虾养殖产业开始飞速发展，逐渐从简单的养殖加工发展成为集育苗、养殖、加工、销售，以及餐饮、休闲旅游和文化等为一体的综合性产业。2021年，我国克氏原螯虾养殖面积2 600万亩、产量263.36万t，同比分别增长19.01%和10.02%，克氏原螯虾产业总产值为4 221.95亿元，同比增长22.43%[2]。
目前，对克氏原螯虾的研究主要集中于行为学[3-4]、种群结构[5]与分布[6]及疾病[7-8]与免疫[9-11]等，有关营养与饲料的研究主要集中在脂肪[12-13]、蛋白质[14]等方面。随着我国小龙虾产业的规模化发展，相关的科学研究已显得较为滞后，难以解决规模化养殖过程中出现的一些新问题，主要包括克氏原螯虾养殖过程中的健康监测、疾病预防、免疫力增强和迫切需求的高效利用饲料等。随着研究的逐渐深入，科研工作者们发现水产动物的生长代谢、营养吸收和免疫抗病都与肠道微生物的作用密不可分，肠道微生物种群多样性和结构组成是影响宿主健康的重要因素[15-16]。
关于克氏原螯虾肠道微生物的相关研究还处于起步阶段，对克氏原螯虾肠道菌群结构的影响因素进行研究，可以通过调节肠道菌群结构来改善克氏原螯虾的健康状况，增强免疫力。研究克氏原螯虾肠道菌群的物种组成、特性和功能，有助于了解这些物种在宿主生长发育过程中的作用以及演替规律，有助于了解宿主与菌群间的相互关系。通过对克氏原螯虾肠道中功能益生菌进行筛选，并利用这些微生物制备微生物制剂，开发克氏原螯虾专属的高效利用饲料，也有利于解决克氏原螯虾规模化养殖过程中的饲料瓶颈问题。本文总结了克氏原螯虾肠道微生物的研究方法、肠道微生物群落的构建及其演替规律、肠道微生物的相关功能，重点综述了影响肠道微生物结构的因素（食物、生长环境、发育阶段、性别及疾病），为克氏原螯虾规模化健康养殖和肠道微生物的进一步研究和利用提供参考。
1 克氏原螯虾肠道微生物的研究方法
近些年，肠道微生物的研究已成为热点之一，推动了肠道微生物研究方法的不断革新，从传统培养的检测方法发展成基于16S rDNA的分子检测方法，演化出变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、末端片段长度多态性（terminal restriction fragment length polymorphism，TRFLP）等指纹图谱技术，伴随测序技术的快速发展，高通量测序技术，又称“二代测序”逐渐成为肠道微生物研究的主流方法。
第二代测序技术，其核心优势在于可以一次性对上百万条DNA分子并行测序，并且检测结果更加准确、测序时间更短，实验成本更低。在二代测序技术出现后，相继出现了多种平台，其中Illumina测序平台（Solexa公司）和454焦磷酸测序平台（Roche公司）应用较为广泛。利用Illumina测序平台在肠道微生物多样性研究中的基本流程为基因提取、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增及纯化基因序列、上机测序和信息数据分析，该技术已成为研究微生物群落多样性的首选[17]，在植物内生细菌[18-19]、肠道微生物[20-22]、环境工程[23-24]、农作物育种技术[25]等领域都有应用。
第二代测序技术虽然测序通量高，但是序列读长变短，并且需要通过PCR扩增来完成测序，从而降低了测序的准确性，因此，第三代测序技术诞生。与第二代测序技术相比，第三代测序技术具有超长的序列读取长度、运行速度快、且不需要经过PCR扩增，避免了碱基替换及偏置等错误出现，提高了测序的准确性，具有广阔的应用前景。总而言之，随着测序需求的不断增加，高通量测序技术还将继续革新和发展，朝着测序更精准、操作更简化、生物信息学分析更自动化的方向推进。
2 克氏原螯虾肠道微生物群落的结构及其演替规律
肠道微生物作为动物体最庞大、最复杂的微生态系统，本身及其代谢产物不仅能调节动物体健康，在水产动物营养吸收、生长代谢和免疫抗病等方面发挥着重要作用，伴随着克氏原螯虾产业的飞速发展，克氏原螯虾肠道微生物近些年也成为研究的热点。冯光志等[26]采用纯培养法，从克氏原螯虾肠道筛选产木聚糖酶细菌，并对克氏原螯虾肠道细菌进行了16S高通量测序，表明克氏原螯虾肠道内细菌资源丰富，在属水平上，克氏原螯虾肠道细菌主要是杆状念珠菌属（Candidatus Bacilloplasma）、拟杆菌属（Bacteroides）、弧菌属（Vibrio）、不动杆菌属（Acinetobacter）、营发酵单胞菌属（Dysgonomonas）、泰勒菌3（Tyzzerella 3）、气单胞菌属（Aeromonas）、希瓦氏菌属（Shewanella），芽孢杆菌属（Bacillus）细菌在木质纤维素降解过程中发挥一定功能。SHUI Y等[27]研究了克氏原螯虾-水稻一体化栽培模式下养殖的克氏原螯虾肠道细菌群落组成多样性。结果显示，优势菌群在门水平上为放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、软壁菌门（Tenericutes）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroides）。贾丽娟等[28]研究了武汉地区、永州地区、韶关地区稻虾综合种养系统的微生物群落结构。发现不同地区养殖系统微生物的优势菌门种类没有变化，但是，优势菌门和优势菌属的相对丰度会改变。谢梦琪等[29]研究表明，不同生长阶段的克氏原螯虾肠道微生物群落多样性、丰度及功能都有显著差异，成虾肠道菌群多样性比幼虾降低，多种代谢功能升高。由此可见，不同生长阶段克氏原螯虾肠道微生物含有相对固定的菌群结构，在成熟阶段，菌群结构更趋于稳定。这为研究菌群在肠道内行使的生理功能，以及菌群与宿主的共生关系提供了可能。目前，关于克氏原螯虾肠道微生物的研究，在肠道细菌方面研究的较多，而肠道中同样也寄居着大量的真菌。它们与肠道中的细菌一起构成肠道内功能强大的微生态系统。真菌消化酶产量较细菌更大，然而，对克氏原螯虾肠道内真菌的研究还鲜见报道。
3 影响克氏原螯虾肠道微生物结构的因素
克氏原螯虾肠道菌群结构的相关研究逐步揭开了克氏原螯虾肠道微生物的面纱。然而，克氏原螯虾肠道微生物的组成受食物、生长环境、发育阶段、性别乃至疾病等多种因素的影响。
3.1 食物对肠道微生物结构的影响
宿主自身不能或未消化分解的食物，最终都成了肠道微生物的佳肴。同样，这些不同来源的食物也会反过来影响肠道内微生物的种类和丰度。对人类肠道微生物的研究发现，不同国度不同饮食习惯的人肠道菌群差异显著[30-32]。不同食物来源的克氏原螯虾肠道微生物菌群同样也存在较大差异。
大量研究聚焦在克氏原螯虾对蛋白质、脂质、维生素、微量元素等营养素需求及饲料开发方面。杨伟杰等[33]研究不同生长阶段克氏原螯虾对饲料中蛋白质水平的需求，表明不同生长阶段的克氏原鳌虾对饲料蛋白水平的需求存在明显差异。彭迪等[34]探讨脂肪水平分别为1.98%（对照组）、4.12%、5.84%、7.89%、10.48%和11.89%的6组半精制饲料对克氏原鳌虾生长性能的影响，显示克氏原螯虾亲虾对脂肪需要量为7.60%～7.89%。张诗雨等[35]研究壳寡糖对克氏原螯虾肠道菌群结构的影响，实验组的Simpson指数、Chao1指数、ACE指数及Shannon指数均显著高于对照组（P＜0.05），在饲料中添加适量的壳寡糖可以提高克氏原螯虾消化酶活性，改善肠道菌群结构。刘永涛等[36]分别投喂5种不同饲料（玉米、大豆、添加了复方黄芪多糖蛋白质含量≥26%的饲料、蛋白质含量≥26%的饲料、蛋白质含量≥28%的饲料），研究克氏原鳌虾的生长性能、非特异性免疫，表明添加了复方黄芪多糖蛋白含量≥26%的饲料优于其他饲料。赖婷等[37]研究较极端条件下克氏原鳌虾的肠道菌群变化，对克氏原螯虾饥饿胁迫28 d，发现饥饿第7天肠道微生物多样性高于第0、14、28天，其菌群组成结构在不同水平的物种丰度上均发生显著变化。随着研究的逐渐深入，科研工作者研究发现[38-40]，在饲料中添加微生物制剂，可以显著改善克氏原鳌虾肠道菌群结构，提高免疫力。田立立等[38]在克氏原螯虾饲料中添加乳酸菌，研究克氏原螯虾菌群结构变化，表明饲料中添加乳酸菌能改变克氏原螯虾肠道菌群结构，改善非特异性免疫机能。ZHANG Z T等[39]研究发酵或非发酵饲料对克氏原螯虾肠道菌群组成的影响，发现发酵饲料饲喂的克氏原螯虾肠道中拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度显著高于非发酵饲料，表明发酵饲料对肠道微生物群的功能（如多糖降解）具有重要作用。晏明瑶等[40]研究不同饲料对克氏原螯虾幼虾肠道形态结构、消化能力的影响，发现与硬颗粒饲料相比，生物发酵饲料可以提高幼虾肠道消化吸收面积，提高消化酶活力和消化能力，促进幼虾生长，这与克氏原螯虾肠道微生物结构的演变密切相关。
在所有影响肠道微生物结构的因素中，食物是最容易发生改变和调节的因素，因此，通过调整食物来调节肠道微生物的结构，改善克氏原螯虾的健康状况具有较大的应用前景，在克氏原螯虾饲料中添加益生菌制剂[41]，能够改善肠道菌群结构，抵御有害病菌，预防疾病。
3.2 环境因素对肠道微生物结构的影响
克氏原螯虾的肠道菌群部分来自环境。生长环境的不同，必然会引起肠道微生物菌群结构的变化。WANG Y等[42]探讨了池塘养殖和水稻共养殖模式下克氏原螯虾肠道微生物群落与周围环境之间的生态相互作用，发现水、沉积物与克氏原螯虾肠道的微生物组成有显著差异，而两种养殖模式的微生物组成无显著差异。李飞等[43]分析池塘和稻田养殖模式下克氏原螯虾肠道的微生物多样性。结果显示，池塘和稻田养殖克氏原螯虾肠道微生物在物种组成、多样性上都存在明显差异。池塘模式下肠道微生物多样性较低，认为是两种模式下克氏原螯虾生长环境不同所致，但两种模式下肠道内的优势菌群相似。CHEN X等[44]分析池塘和稻田养殖模式下的克氏原螯虾肠道微生物，发现两种环境中细菌和古菌群落的相对丰度差异显著，而真菌和病毒群落的相对丰度差异不显著。不同的生长环境，克氏原螯虾肠道微生物菌群结构存在差异，与其生长环境存在一定的相关性，如池塘和稻田两种养殖模式下，稻田种植和管理为克氏原螯虾提供了丰富和多样的饵料、微生物和水质环境。
相同环境下生长的克氏原螯虾肠道微生物结构的差异与许多因素有关。李雪红等[45]对克氏原螯虾尾肉、养殖水体及周围土壤进行基因序列测序，分析克氏原螯虾虾肉与其生长环境之间的相关性，发现克氏原螯虾、土壤和水体中有相对固定的优势菌群，克氏原螯虾的养殖环境与克氏原螯虾虾肉间微生物联系密切。叶建勇等[46]对克氏原螯虾肠道、养殖水体、池塘底泥及饲料进行基因序列测序，分析肠道与外界养殖环境之间的相关性，结果表明克氏原螯虾肠道菌群多样性在较大程度上受到外界环境细菌的影响，特别是底泥中的细菌，但同时也有一定的保守性，可能是肠道原著细菌影响。王飞飞等[47]研究稻虾模式下克氏原螯虾肠道、肝胰腺、鳃及其养殖池塘水体、底泥中菌群多样性，结果表明克氏原螯虾肠道、肝胰腺、鳃与其养殖环境中菌群结构存在着一定的相关性，但各样品优势菌群差异较大。由此可见，克氏原螯虾肠道菌群结构受其生长环境中的土壤、水体、池塘底泥及饲料等因素的影响，但肠道菌群也具有保守性，维持着相对固定的优势菌群。
3.3 发育阶段对肠道微生物结构的影响
生物体在刚出生时肠道内并没有微生物，肠道中的微生物都是在后天的生命活动中慢慢累积，逐渐形成稳定的微生态系统。不同年龄和发育阶段，肠道内微生物结构也会有差别。谢梦琪等[29]研究了不同生长阶段对克氏原螯虾肠道菌群的变化，发现成虾肠道菌群多样性低于幼虾，多种代谢功能升高。ZHANG Z T等[39]研究发现，克氏原螯虾在发育过程中肠道菌群组成的alpha多样性下降，肠道微生物群具有高度可比性，且有发育依赖性。XIE M Q等[48]分析实验室培养的1龄、2龄、3龄、幼虾和克氏原螯虾成虾肠道样本，在幼虫发育早期，肠道菌群的结构相似，随着生长发育，肠道菌群的组成和功能也发生了变化，alpha多样性随下降。肠道微生物多样性常作为宿主健康的生物指标[49]，克氏原螯虾幼虾生物多样性高于成虾，一个可能的原因是克氏原螯虾在幼虾阶段时，胃肠道发育尚不健全，免疫系统也还不完善，幼虾的肠道菌群更易受到外界环境的影响，水体和淤泥中的微生物更容易进入到幼虾肠道，而随着幼虾的发育成熟，成虾的肠道菌群结构趋于稳定，对外来微生物也具有选择性。由此可见，克氏原螯虾的发育阶段影响其肠道微生物的菌群结构，肠道内的微生物又行使特殊的功能，服务于克氏原螯虾的生长发育。肠道微生物的演替过程与克氏原螯虾的生命活动息息相关，弄清克氏原螯虾肠道内微生物的演替规律，有助于揭示肠道微生物在克氏原螯虾生长过程中的作用。
3.4 性别对肠道微生物的影响
性别对于肠道微生物的影响常具有不确定性。一些研究表明，不同性别动物肠道微生物菌群结构不同。许刚等[50]研究了5龄家蚕第3天雄、雌幼虫中肠道微生物的多样性，发现雌蚕与雄蚕肠道微生物类群的组成和所占比率存在明显差异。韩学平等[51]研究环湖牦牛瘤胃微生物区系特征和性别之间的差异，发现性别显著影响牦牛瘤胃微生物区系的组成，尤其是在属水平上差异较大。人类肠道微生物同样存在性别差异，女性肠道微生物多样性高于男性[52]。一种观点认为，肠道微生物受宿主性激素调节，宿主分泌的激素水平不同，肠道微生物多样性不同。也有些研究显示，性别与肠道微生物菌群结构没有显著性差异。何永果等[53]研究表明，成年大熊猫性别对肠道菌群没有影响。谢梦琪等[29]探讨了性别对克氏原螯虾肠道菌群的影响，表明不同性别克氏原螯虾肠道菌群的多样性和功能均没有显著差异，但各优势菌群在个体间的丰度差异较大。然而，性别对克氏原螯虾肠道微生物的影响，在克氏原螯虾生长的各个阶段可能有所不同。在克氏原螯虾生长的特定阶段，其肠道微生物也可能表现出差异，而行使特殊功能，这方面的研究还需要继续进行。研究性别在不同发育阶段对克氏原螯虾肠道微生物的影响，有利于揭示肠道微生物的功能与宿主发育的关系。
3.5 疾病对肠道微生物的影响
克氏原螯虾肠道中数量巨大、种类多样的微生物复杂生态系统处于动态平衡中，一旦平衡被打破，肠道中的致病菌就可能导致克氏原螯虾患病。目前，已报道的克氏原螯虾致病的病原主要有白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophilia）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和弗氏柠檬酸杆菌（Cit robcter freundii）等[54]。陈一铭等[55]揭示感染了白斑综合征病毒克氏原螯虾肠道菌群的变化，结果说明白斑综合征病毒或可通过干扰肠道稳态致病。XIONG J等[56]研究表明，肠道菌群的变化与虾病的严重程度密切相关。张立强等[57]通过Illumina高通量测序技术探索了健康与患病克氏原螯虾肠道微生物菌群结构和多样性的差异。结果表明，患病克氏原螯虾肠道微生物中变形菌门的占比显著上升，生物多样性显著下降。吴金凤等[58]研究发病对虾与健康对虾细菌的群落结构和多样性，并尝试挑选指示物种，利用对虾的肠道细菌差异来指示其健康状况，具有一定的实际意义。除了药物治疗外，投喂益生菌制剂调节肠道菌群结构，筛选能够代表克氏原螯虾健康的指示物种，对于防御克氏原螯虾疾病具有积极作用。
克氏原螯虾肠道微生物菌群结构会受到许多因素影响而发生演变，它们又有相对固定的优势菌群，具有一定的保守性。可以尝试通过改变这些影响因素，优化克氏原螯虾肠道菌群结构，保障克氏原螯虾的健康和预防疾病。克氏原螯虾肠道微生物影响因素及菌群结构变化见表1。
表1 克氏原螯虾肠道微生物影响因素及菌群结构变化
Table 1 Influencing factors of intestinal microorganism and changes of microbial community structure of Procambarus clarkii
影响因素 因素变量 菌群结构比较 参考文献食物饥饿胁迫[37]壳寡糖[35]乳酸菌[38]发酵饲料[39-40]环境池塘和稻田[42-43]池塘和稻田[44]发育阶段性别疾病养殖环境幼虾和成虾雌虾和雄虾白斑综合征病毒感染健康与患病拟杆菌属、柠檬酸杆菌属、链球菌属、奈瑟菌属及嗜血杆菌属为主。饥饿后，柠檬酸杆菌属、拟杆菌属降低，链球菌属增加，菌群组成结构在不同水平的物种丰度上均发生显著变化。变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门为主。添加壳寡糖后，变形菌门的相对丰度有所下降，厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门的相对丰度均有所上升，实验组的Simpson指数、Chao1指数、ACE指数及Shannon指数均显著高于对照组，改善肠道菌群结构。主要优势菌属为柠檬酸杆菌属、不动杆菌属、气单胞菌属、念珠杆菌属。添加乳酸菌后，柠檬酸杆菌属丰度有所降低，Shannon指数增大，群落多样性高于对照组。变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、软壁菌门和RsaHF231为优势门，饲喂发酵饲料的小龙虾肠道拟杆菌门的相对丰度显著高于未饲喂发酵饲料组，拟杆菌门在营养吸收方面发挥重要功能。两种模式下的肠道微生物优势菌均为厚壁菌门，其中池塘模式中占比67.40%，稻田模式中占比为32.69%；池塘养殖克氏原螯虾肠道微生物多样性的Shannon、ACE和Chao指数均低于稻田养殖克氏原螯虾肠道微生物指数。厚壁菌门、变形菌门、蓝藻门、放线菌门和拟杆菌门为优势门，池塘养殖克氏原螯虾肠道厚壁菌门丰度显著低于稻田养殖克氏原螯虾。细菌和古菌群落的相对丰度差异显著，而真菌和病毒群落的相对丰度差异不显著。克氏原螯虾肠道、养殖水体、池塘底泥及饲料有相对固定的优势菌群，克氏原螯虾肠道菌群多样性在较大程度上受到外界环境细菌的影响，特别是底泥中的细菌，但同时也有一定的保守性。相比于幼虾，成虾肠道菌群多样性降低。不同性别间克氏原螯虾肠道菌群的多样性和功能均没有显著性差异，但各优势菌群在个体间的丰度差异较大。对照组优势菌门为变形菌门和软壁菌门，分别占75.42%和19.17%；感染组肠道优势菌门为变形菌门和拟杆菌门，分别占78.14%和17.38%。感染组与对照组相比，拟杆菌科和黄杆菌科的丰度显著上升。患病克氏原螯虾肠道微生物中变形菌门的占比显著上升，生物多样性显著下降。[45-47][39，48-49][29][55][56-57]
4 克氏原螯虾肠道微生物的生理功能
肠道微生物作为宿主后天获得的非常重要的“器官”，与宿主正常的生理过程息息相关，在促进食物消化、免疫调节、改善肠屏障、抵御病菌等方面都发挥重要功能和关键作用[59-61]。目前，人体肠道微生物功能的相关研究较多，但仍然有很多功能和作用机制没有解开。
克氏原螯虾肠道微生物在生命活动中发挥着重要作用。冯光志等[62]从克氏原螯虾肠道中筛选到产纤维素酶细菌，高通量测序结果表明，该菌基因组含有许多碳水化合物相关酶基因，有较高的纤维素降解能力，表明克氏原螯虾肠道细菌在辅助克氏原螯虾降解纤维素过程中发挥一定作用。XU Y等[63]在克氏原螯虾日粮中添加酿酒酵母，发现各组间免疫相关基因Crustin2的表达相似，而溶菌酶和酚氧化酶的表达水平在处理组中显著升高，Prophenoloxidase的表达量最高，显著提高了克氏原螯虾对弗氏柠檬酸杆菌的抗性水平。FOYSAL M J等[64]探讨在鱼粉基础饲料中添加丁酸梭菌对克氏原螯虾生长、肠道菌群和免疫性能的影响，表明丁酸梭菌饲料可显著降低克氏原螯虾病原菌弧菌和气单胞菌的丰度，调节了模拟弧菌诱导的免疫应答基因的表达水平。CHEN X等[44]分析池塘和稻虾养殖模式下克氏原螯虾肠道的基因信息，发现稻虾养殖模式下与人类疾病和免疫相关的基因丰度降低，肠道菌群对养殖环境的变化更为敏感，一个可能的原因是水稻种植的复杂生态环境，以及食物中减少了配合饲料，影响了克氏原螯虾消化道微生物的增殖。研究克氏原螯虾肠道微生物菌群关系，以及在克氏原螯虾生命活动中发挥的作用，调节肠道微生态系统，对克氏原螯虾养殖业具有十分重要的意义。
目前，克氏原螯虾肠道微生物的很多相关功能和作用机制还不清楚，随着克氏原螯虾产业的不断发展和不断深入研究，克氏原螯虾肠道微生物的功能研究将成为未来克氏原螯虾研究的热点。
5 结语
肠道微生物作为克氏原螯虾的重要微生态“器官”，与克氏原螯虾的健康息息相关，在长期的共同演化过程中，肠道微生物与克氏原螯虾逐渐达到了动态平衡，在克氏原螯虾的生命活动中发挥重要作用。弄清克氏原螯虾肠道菌群结构，对于揭示克氏原螯虾肠道微生物功能具有重要意义。然而，克氏原螯虾肠道微生物受到克氏原螯虾食物、生长环境、发育阶段、性别乃至疾病等多种因素的影响。研究这些影响克氏原螯虾肠道菌群改变的因素，通过调整这些影响因素，优化克氏原螯虾肠道菌群结构，改善克氏原螯虾的健康状况，具有较大的应用前景。
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