橄榄（Canarium album），又称青果，是橄榄科橄榄属植物，主要分布在广东、福建、广西等省，具有悠久的食用和药用历史。橄榄富含多酚、类黄酮、膳食纤维、矿物质等营养成分，具有抗氧化[1]、抗神经炎症[2]、调节肠道微生物[3]、防止肥胖症[4]等多种生物活性，逐渐受到食品、医药和保健行业的重视，已被我国卫生健康委员会列入药食同源目录[5]。目前，橄榄产业存在科技创新不足、采后商品化和深加工滞后、市场开发不足、品牌建设乏力等问题[6]，不利于橄榄产业的精深加工开发和全面发展。使用有效的加工技术和方法对橄榄进行加工，在保留橄榄果的营养价值的同时，又能改善产品的功能特性，提升橄榄的加工利用价值，是橄榄加工产业的新热点。
橄榄除了鲜食之外，还可制作成果汁饮料[7-8]、果醋[9]、果酒[10-11]等形式在市场进行销售。其中，果酒可以极大地保留果实中原有的营养物质，具有多种生理活性[12]。因此，利用橄榄果实通过发酵生产橄榄果酒，不仅能有效保留果实中原有的营养物质[13]，而且丰富并增加了其他营养成分及保健功能[14]。对橄榄果酒发酵工艺进行优化，极大地保留橄榄中的多酚类物质、维生素C等生物活性成分[15-18]，同时对其特征成分和风味进行分析，开发一款符合大众口味的低醇度高营养价值的橄榄果酒，一方面可以为橄榄果酒的研究提供理论基础，另一方面可以为橄榄果酒的加工生产及应用提供新的指导方向。
本研究以橄榄果为原料，研制橄榄发酵型果酒。首先筛选出橄榄果酒最适发酵菌种，再通过单因素和正交试验对橄榄果酒的工艺进行优化，并对最优工艺下的橄榄果酒中多酚、维生素C、挥发性风味物质等特征成分进行分析，以期为橄榄果酒的开发与利用提供理论参考，也为橄榄果酒的产业化发展提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
橄榄果（广东檀香1号）：购自潮州市文祠镇；食用小苏打、白砂糖：市售；EX-V果胶酶（活性和广谱边缘酶活性）、DV10酵母：法国拉曼集团；SY酵母、BA酵母、RV171酵母、BV818酵母：安琪酵母股份有限公司；偏重亚硫酸钾、氢氧化钠标准滴定溶液、酚酞指示液（10 g/L）、福林酚、没食子酸标准品、抗坏血酸标准品、二氯靛酚、葡萄糖（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸、氯化钠、碳酸氢钠（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
HH-6同步搅拌水浴锅：上海赫田科学仪器有限公司；BSP生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ZQZY-98CES培养箱：上海知楚仪器有限公司；P901酸度计：上海佑科仪器仪表有限公司；SOP电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；LB50T糖度计：广州速为电子科技有限公司；5977B-8890气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）仪：美国安捷伦科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 橄榄果酒发酵工艺流程及操作要点
橄榄果挑选→橄榄前处理（洗涤、去核、破碎）→调整成分→菌种活化→控温发酵→灭菌→过滤→橄榄果酒
橄榄果挑选：挑选表皮完整、无破损、呈鲜绿或者淡绿色的橄榄果。
橄榄前处理：将橄榄洗净放入容器内，按照一定的料液比添加水，将橄榄破碎到一定程度后，迅速转移至250 mL锥形瓶中。
调整成分：分别加入橄榄与水总质量（或果浆总质量）0.02%的C-MAX果胶酶和0.02%的偏重亚硫酸钾，使用白砂糖调整发酵液糖度为33°Bx，充分搅拌，使用小苏打将待发酵液初始pH调节至4.5。
菌种活化、控温发酵：将DV10酵母和水按照比例1∶10（g∶mL）进行混合，37 ℃活化15 min。再按照一定接种量接种到橄榄果浆中，使用封口膜进行密封，放入恒温培养箱中在一定温度条件下进行发酵，使用糖度计对糖度变化进行监测，待橄榄果酒中糖度不再下降时，即认为橄榄果酒发酵结束。
灭菌、过滤：将发酵好的橄榄果酒75 ℃灭菌5 min，把灭菌好的橄榄果酒使用3～4层121 ℃灭菌15 min后的纱布过滤，收集滤液至锥形瓶中，使用封口膜进行密封，4 ℃冰箱中冷藏。
1.3.2 最优菌种的筛选
选取BV818、SY、DV10 3种酵母作为考察菌种，控制橄榄果破碎程度为90%，料液比为1∶4（g∶mL），3种酵母添加量为0.05%，发酵液糖度为33°Bx，发酵温度24 ℃。通过基础工艺条件制作橄榄果酒，并记录发酵过程中的糖度变化、酒精度和感官评分。
1.3.3 橄榄果酒发酵工艺优化单因素试验
设定橄榄果破碎程度为90%，料液比为1∶4（g∶mL），发酵温度24 ℃为基础条件，改变单一条件，以橄榄果酒酒精度和感官评分作为评价指标，分别考察破碎程度（0、30%（颗粒大小为10 mm×5 mm）、60%（5 mm×2 mm）、90%（＜1 mm×1 mm）），料液比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g∶mL）），发酵温度（16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃）对橄榄果酒发酵的影响。
1.3.4 橄榄果酒发酵工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以橄榄果破碎程度（A）、料液比（B）、发酵温度（C）为因素，以橄榄果酒酒精度和感官评分为评价指标，设计3因素3水平L9（33）正交试验，正交试验因素与水平见表1。
表1 橄榄果酒发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation process optimization of olive wine
水平 A 破碎程度/% B 料液比（g∶mL） C 发酵温度/℃123 30 60 90 1∶3 1∶4 1∶5 20 24 28
1.3.5 测定方法
（1）感官评价
选择10位经过培训并具备食品专业知识的感官评价人员，从外观、香气、口感和典型性4个方面对橄榄果酒进行感官评分，取10人平均分，满分为100分。感官评分标准见表2。
表2 橄榄果酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of olive wine
指标 评分标准 分值/分外观（20分）香气（30分）金黄色、清亮透明、有光泽、无沉淀物禾杆黄色、澄清、透明、无沉淀物浅禾黄色、澄清、无沉淀物浅黄色、微浊、无光泽原果实果香和酒香浓郁、协调和谐果香与酒香协调果香较突出，但无异香香气不足，有异香19～20 16～18 12～15≤11 28～30 23～27 16～22≤15
续表
指标 评分标准 分值/分口感（40分）典型性（10分）口感新鲜、丰满、纯正，后味回甘圆润醇厚、回味绵延口感醇厚、柔和爽口酒体淡薄、略带涩味后味苦涩、有异味典型性突出、风格独特典型性明确有典型性但不明确典型性较差38～40 33～37 26～32 17～25≤16 10 8～9 6～7≤5
（2）理化指标测定
糖度：采用糖度计法；酒精度、总酸、还原糖、维生素C：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精计法、电位滴定法、直接滴定法和2,6-二氯靛酚滴定法；总酚：采用福林酚法[19]并稍作修改，福林酚试剂添加量为1 mL，10%碳酸钠与福林酚用量比例为3∶1，反应时间为30 min。
（3）挥发性风味物质的测定
采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法（headspacesolid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）测定橄榄果酒挥发性风味物质。将萃取针（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）于250 ℃条件下活化10min，备用。吸取7 mL发酵液于15 mL样品瓶中，加入NaCl 1.4 g和磁力转子，盖上铝盖；然后将样品置于磁力搅拌加热器上，45 ℃预热5 min；插入已活化的萃取针，吸附萃取50 min；随即将萃取针插入GC-MS仪器进样口中，250 ℃解吸5 min。
GC条件：采用DB-WAX UI色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。进样口温度250 ℃，进样模式为不分流，以高纯氦气（He）作为载气。柱温箱升温程序：起始温度40 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升温至100 ℃，保持10 min；以10 ℃/min升温至200 ℃，保持10 min。
MS 条件：电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；采集模式为全扫描；质量扫描范围50～550 m/z。
定性定量方法：选取匹配度≥70%的物质，通过美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）14谱库与挥发性化合物谱图进行比对，结合相关资料及文献进行分析和鉴定进行定性；采用面积归一法进行定量[20]。
1.3.6 数据分析
试验结果以“平均值±标准差”（n=3）的形式表示。采用JMP13进行数据显著性分析，P＜0.05表示具有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 酵母菌种类型对橄榄果酒发酵的影响
酵母菌菌种类型对橄榄果酒发酵的影响见表3。由表3可知，3种酵母菌发酵制备的橄榄果酒酒精度及残糖均符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中规定的范围；DV10酵母发酵制备的橄榄果酒感官评分最高（74.53分）且较另外两种酵母发酵周期缩短，表现出最高的活性，因此后续试验将选用DV10酵母发酵橄榄果酒。
表3 酵母菌种类型对橄榄果酒发酵的影响
Table 3 Effect of yeast type on the fermentation of olive wine
菌种类型 发酵停止时间/d 残糖/°Bx 酒精度/%vol 感官评分/分BV818 SY DV10 20 20 17 9.67±0.58 7.00±0.01 6.67±0.29 13.07±0.64 12.90±0.52 15.13±0.64 70.33±2.01 71.00±3.36 74.53±3.72
2.2 橄榄果酒发酵工艺优化单因素试验
2.2.1 破碎程度对橄榄果酒发酵的影响
由图1可知，随着橄榄果破碎程度的提高，橄榄果酒酒精度、感官评分均呈先上升后趋于平缓的趋势。橄榄果破碎程度为90%时，橄榄果酒的酒精度、感官评分均最高，分别（13.43±0.47）%vol和（62.67±1.53）分。可能是因为当橄榄果为破碎程度为90%时，橄榄果肉中的风味物质更容易析出到酒体中，丰富了橄榄果酒的风味成分，从而提高了橄榄果酒的感官效果。因此选择橄榄果的最佳破碎程度为90%。
图1 破碎程度对橄榄果酒品质的影响
Fig.1 Effect of crushing degree on the quality of olive wine
2.2.2 料液比对橄榄果酒发酵的影响
由图2可知，随着料液比的增加，橄榄果酒酒精度、感官评分均呈先下降后上升再下降的趋势。当料液比为1∶4（g∶mL）时，橄榄果酒的酒精度、感官评分均达到最高，分别为（16.00±0.17）%vol、（75.60±2.31）分；在料液比为1∶2～1∶4（g∶mL）时，随着果肉的减少，橄榄果肉本身的涩味减少，果香味趋于合适，使得果酒口感得到提升，因此感官评分呈上升趋势；料液比在1∶4（g∶mL）之后，随着果肉减少，橄榄果本身的特殊风味被淡化，影响橄榄果酒的整体风味，使得感官评分下降；当料液比为1∶6（g∶mL）时，感官评分呈现出一定的上升趋势，但该料液比下的橄榄特征风味淡薄，酒香掩盖了果香，无果酒本身的清爽口感。因此选择最佳料液比为1∶4（g∶mL）。
图2 料液比对橄榄果酒品质的影响
Fig.2 Effect of solid and liquid ratio on the quality of olive wine
2.2.3 发酵温度对橄榄果酒发酵的影响
由图3可知，随着发酵温度的升高，橄榄果酒酒精度、感官评分均呈先上升后下降的趋势，在发酵温度为24 ℃时，橄榄果酒的酒精度、感官评分均达到最高，分别为（15.13±0.64）%vol、（74.53±3.72）分；在发酵温度为16～24 ℃时，随着发酵温度的升高，酒精度与感官评分都与温度呈现正相关关系，此时酵母在低温下生长速度较慢，导致发酵不彻底，因此酒精度不高；当温度超过24 ℃时，随着温度的升高，橄榄果酒的酒精度与感官评分都呈现快速下降的趋势。综上，认为发酵温度对橄榄果酒的发酵品质具有较大的影响，最佳发酵温度为24 ℃。
图3 发酵温度对橄榄果酒品质的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of olive wine
2.3 橄榄果酒发酵工艺优化正交试验
由表4可知，在3种影响橄榄果酒发酵的因素中，按照各因素对感官评分的影响，从大到小依次是破碎程度（A）＞发酵温度（C）＞料液比（B）。通过计算K值，可知最优发酵工艺组合为A3B1C3，即橄榄果酒最优工艺参数为破碎程度为90%、料液比为1∶3（g∶mL）、发酵温度为28 ℃。
表4 橄榄果酒发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation process optimization of olive wine
试验号 A B C 感官评分/分1 2 3 4 5 1 1 1 2 2 1 2 3 1 2 1 2 3 2 3 70.83±0.29 70.50±5.37 79.83±0.33 64.89±0.84 55.94±0.54
续表
试验号 A B C 感官评分/分6 7 8 9 K1 2 3 3 3 3 1 2 3 1 3 1 2 51.83±0.50 91.17±0.67 86.78±0.79 88.22±0.54 K2 K3 k1 k2 k3R 221.16 172.66 266.17 73.72 57.55 88.72 31.17 226.89 213.22 219.88 75.63 71.07 73.29 4.56 209.44 223.61 226.94 69.81 74.54 75.65 5.84
2.4 验证试验及果酒品质分析
为验证所得结果的正确性，在最优工艺参数组合下进行3次重复试验。结果表明，在最优工艺下酿造的橄榄果酒感官评分为（91.83±0.67）分，具有较浓郁的橄榄果香与酒香，色泽金黄，清亮透明，口感圆润醇厚、回味绵延。经测定，橄榄果酒酒精度为（15.03±0.4）%vol，总酚含量为（27.76±0.36）g/L，总酸含量为（5.00±0.13）g/L，还原糖含量为（2.53±0.09）g/L，维生素C含量为（30.49±3.10）mg/L，符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》要求。
2.5 橄榄果酒挥发性风味物质分析
通过HS-SPME-GC-MS测定橄榄果酒中挥发性风味物质，结果见表5。由表5可知，从橄榄果酒中共检测出38种挥发性物质，包括9种醇类，相对含量为46.48%；酯类13种，相对含量为4.01%；醛类5种，相对含量为1.79%；酮类1种，相对含量为0.11%；酸类2种，相对含量为0.57%；酚类2种，相对含量为2.06%；烃类1种，相对含量为0.18%；烯烃类3种，相对含量为0.13%；萜烯1种，相对含量为0.32%；其他类型挥发性风味物质1种，相对含量为0.15%。其中，橄榄果酒中主要的挥发性风味物质为醇类和酯类，共同构成橄榄果酒特殊风味的基础[21-23]。
表5 橄榄果酒挥发性风味物质检测结果
Table 5 Determination results of volatile flavor components in olive wine
序号 类别 化合物 相对含量/%1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0醇类11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38酯类醛类酮类酸类酚类烃类烯类萜烯其他正戊醇异戊醇正辛醇（-）-4-萜品醇α-松油醇（1R,5S）-rel-香芹醇苯甲醇苯乙醇2-甲基-1-丁醇乙酸异戊酯辛酸乙酯8-甲基壬酸乙酯癸酸乙酯安息香酸乙酯水杨酸乙酯乙酸苯酯十八烷酸乙酯甲酸辛酯2-糠酸乙酯十六酸乙酯乙酸乙酯邻苯二甲酸双庚酯壬醛苯甲醛3,4-二甲基苯甲醛2,4-二甲基苯甲醛癸醛苯乙酮6-苯酰己酸辛酸2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚2,4-二叔丁基酚P-伞花烃（4-异丙基甲苯）1-（2,3,6-三甲基苯基）丁-1,3-二烯α-甘蔗烯1,2,3,4-四甲基-5-亚甲基环戊-1,3-二烯松油烯α-榄香2.13±0.08 17.90±4.59 0.21±0.01 0.92±0.11 0.37±0.05 0.07±0.01 0.04±0.01 19.43±3.95 5.41±1.85 0.19±0.17 1.10±1.48 0.06±0.01 0.11±0.09 0.73±0.08 0.02±0.01 0.03±0.01 0.02±0.01 0.14±0.01 0.09±0.03 0.15±0.06 1.33±0.01 0.04±0.01 0.40±0.08 0.37±0.13 0.05±0.01 0.35±0.10 0.62±0.13 0.11±0.02 0.10±0.02 0.47±0.21 0.59±0.08 1.47±0.62 0.18±0.02 0.04±0.01 0.06±0.02 0.03±0.01 0.32±0.16 0.15±0.03
醇类物质为橄榄果酒中含量最高的挥发性风味物质。这些醇类物质可赋予橄榄果酒不同的香味，如苯乙醇能赋予橄榄果酒清甜的玫瑰花香、蜂蜜味与蔷薇花香，能赋予橄榄果酒独特的香气，对酒的香气形成具有积极作用[24-25]；异戊醇微甜带苦，能赋予橄榄果酒独特的苦杏仁味[26]；辛醇能赋予果酒茉莉与柠檬的香味[27]。各种高级醇相互协调，使得橄榄果酒的口感更加丰满，丰富了橄榄果酒的酒香。
酯类物质为橄榄果酒中种类最丰富的挥发性风味物质，这类物质既呈香又呈味，是橄榄果酒中重要的挥发性风味物质。本研究共检测出13种酯类物质，其中，乙酸乙酯的浓度最高，其次是辛酸乙酯。这些酯类物质可赋予果酒不同香味，如辛酸乙酯可赋予橄榄果酒令人愉快的花果香气及白兰地酒香气[28]；癸酸乙酯可赋予果酒李子花香和果香[29]。各种酯类物质的香味相互协调、融合，丰富了橄榄果酒的风味。
醛类、酚类、酮类和酸类物质在橄榄果酒中的含量较少。其中，苯甲醛可赋予橄榄果酒樱桃与坚果香，这种物质也同样存在于白兰地中，是重要的香气物质[30]；辛酸可赋予橄榄果酒草莓味、桃子味等多种果味。这些物质对于橄榄果酒风味的形成具有促进作用，丰富了橄榄果酒整体的风味。
3 结论
本研究以橄榄鲜果为原料，对橄榄果酒的工艺、品质及风味进行探究，分析了酵母菌种、破碎程度、发酵温度及料液比对橄榄果酒的影响，通过正交试验得到橄榄果酒最佳发酵工艺条件为破碎程度90%、料液比为1∶3（g∶mL）、发酵温度为28 ℃。在最优工艺条件下得到的橄榄果酒，感官评分为（91.83±0.67）分，色泽呈现出金黄色、清亮透明，果香与酒香协调，口感圆润醇厚、回味绵延，具有橄榄的典型风味。橄榄果酒中总酚含量为（27.76±0.36）g/L、总酸含量为（5.00±0.13）g/L、还原糖含量为（2.53±0.09）g/L、维生素C含量为（30.49±3.10）mg/L，共检测出38种挥发性风味物质，赋予了橄榄果酒特殊的果酒风味。本研究在橄榄果酒发酵工艺参数方面具有一定的创新性和实用价值，研究结果为橄榄果酒的研发、加工与生产提供了新的指导方向，为橄榄精深加工产品开发提供思路。
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