啤酒发酵过程是啤酒酵母在一定的条件下，利用麦汁中的可发酵性物质而进行的正常生命活动，其代谢的产物就是啤酒。由于酵母类型的不同，发酵的条件和产品要求、风味不同，发酵的方式也不相同。根据酵母发酵类型不同可把啤酒分成上面发酵啤酒（拉格啤酒）和下面发酵啤酒（艾尔啤酒）。上面发酵啤酒采用上面发酵酵母（艾尔酵母），发酵温度高，发酵速度快，对乙醛、双乙酰、硫化氢等不良风味物质的还原速度快，产酯能力强，酯香浓郁，香蕉味等水果香气突出，口感醇厚。下面发酵啤酒采用下面发酵酵母（拉格酵母），发酵温度低，发酵周期长，发酵度高，口感清爽纯净，柔和，麦芽香味明显[1-2]。硫化物是影响啤酒风味的一类重要化合物，在啤酒中适量存在，能使酒体丰满圆润、香味协调；过量硫化物存在，当啤酒受到光照或氧化时，硫化物不仅使啤酒口味变差，而且使啤酒发生雾浊[3-4]。啤酒中的硫化物按物理性质可分为非挥发性硫化物（nonvolatile sulfur compounds，N-VSCs）和挥发性硫化物（volatile sulfur compounds，VSCs），N-VSCs约占94%，对啤酒风味影响较小，然而VSCs虽仅约占6%，但对啤酒风味影响较大。挥发性含硫化合物的感官阈值较低，在啤酒微量组成成分中占有重要的地位[5]。
挥发性硫化物（VSCs），如硫化氢、二氧化硫、硫醇、硫酯和硫醚等，啤酒中VSCs的形成与酿造工艺密切相关，是啤酒质量控制的关键指标之一[6]。VSCs的存在影响了啤酒的感官品质，其代谢受到麦汁组分和酵母类型的影响[7]。从这个意义上说，一些VSCs的代谢积累与麦汁中游离氨基酸态氮的水平和特定的氨基酸含量有关[7-9]，对啤酒的风味与质量势必产生影响。
麦芽是酿造啤酒的主要原料。作为“啤酒的骨架”，麦芽的成分和质量关乎啤酒风味和品质。同时，近年来伴随着中国啤酒产量的显著增加，原产大麦的品质和产量却逐年降低，加剧了国内啤酒行业对高品质原料的需求。而关于麦芽对啤酒品质影响的研究，目前主要集中在过滤性能[10-12]、蛋白质[12]、β-葡聚糖[13-14]、常规理化指标、代谢风味（醇醛酯等）[15]等方面，而从麦芽角度上，对拉格啤酒VSCs形成的影响研究相对较少。
麦汁中的含硫化合物主要可以分为2大类：一类是无机硫，主要是硫酸根离子（SO42-）；另一类是有机含硫化合物，主要是含硫氨基酸[9，17]。本研究围绕麦芽对含硫化合物（SO42-和含硫氨基酸）来源及代谢的影响进行分析，以不同种类麦芽为研究对象，通过实验室啤酒模拟发酵，接种拉格酵母制备啤酒，从含硫化合物代谢的角度，研究不同种类麦芽对拉格啤酒VSCs形成的影响，以期为拉格啤酒VSCs的控制提供一定的理论参考，减少下面拉格酵母发酵过程中VSCs的形成，提高啤酒的风味质量，缩短生产周期。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
下面发酵啤酒酵母—拉格酵母：北京燕京啤酒有限公司。
1.1.2 麦芽
本研究所用8种麦芽，分别编号为1#～8#，其详细信息见表1。
表1 实验所用麦芽信息
Table 1 Information of malts used in the experiment
编号 麦芽品种 麦芽生产厂麦芽1#麦芽2#进口-普拉奈特进口-普拉奈特a b
续表
编号 麦芽品种 麦芽生产厂麦芽3#麦芽4#麦芽5#麦芽6#麦芽7#麦芽8#进口-麦特卡夫进口-麦特卡夫进口-麦特卡夫进口-卡普兰德国产-大麦麦芽国产-小麦麦芽a b c a a c
1.1.3 化学试剂
硫化氢、甲硫醇、二甲基硫、二甲基二硫、S-甲基硫代乙酸酯、二甲基亚砜、蛋氨酸、半胱氨酸（均为色谱纯）：美国Sigma-Aidrich公司；甲醇、无水乙醇、NaCl、KOH（均为色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；SO42-标准贮备溶液：国家标准物质中心。
1.2 仪器与设备
GC7890B气相色谱（gas chromatography，GC）仪（配8355Sulfur检测器）、1260 Infinity II液相色谱（liquid chromatography，LC）仪：美国安捷伦公司；DB-SULFUR SCD型色谱柱（60 m×0.32 mm×4.2 μm）、DX-320离子色谱仪：美国戴安公司；A300 全自动氨基酸分析仪：德国曼默博尔公司；MIR-253型生化培养箱：日本三洋公司；BX53光学显微镜：日本OLYMPUS公司；IY1200自动细胞计数仪：上海睿钰生物科技有限公司；UVmini-1280紫外分光光度计：日本岛津公司；FE28 pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PBA 5001全自动啤酒分析仪：奥地利安东帕公司；BGT-12糖化仪：香港赛维斯公司。
1.3 方法
1.3.1 实验室模拟啤酒发酵实验
麦汁制备：依据QB/T 1686—2008《啤酒麦芽》中的协定法对麦汁进行糖化。取一定量于高压灭菌锅内模拟进行煮沸（102 ℃、60 min），不添加酒花，煮沸后快速水冷却至常温，倒瓶去除热凝固物，上清液转移于无菌三角瓶中，留样检测，然后接种啤酒酵母进行发酵。
啤酒发酵：接种下面发酵啤酒酵母，接种量按照（1.6～2.0）×107个/mL，安装发酵栓，于12 ℃条件下进行发酵，每日称质量，质量损失＜0.2 g即主发酵结束，然后4 ℃静置后发酵7 d，送至国家级品酒师处进行双乙酰判定，至酒体中无双乙酰气味时表明发酵成熟，即得啤酒成品。
1.3.2 分析检测
（1）麦芽理化指标
水分、浸出物（以干基计）、α-氨基酸态氮、总氮、库尔巴哈值测定：依据QB/T 1686—2008《啤酒麦芽》；总酸测定：依据GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》。
（2）啤酒理化指标
原麦汁浓度、酒精度、真实浓度、真实发酵度测定：依据GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》。
（3）氨基酸
采用全自动氨基酸分析仪，依据国标GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》。
（4）硫酸根离子
硫酸根离子测定采用液相色谱（LC）法。
样品制备：待测样品恒定至室温，用单层滤纸过滤，弃掉前30 mL溶液，移取5 mL过滤好的待测样至50 mL容量瓶中，用去离子水定容。稀释好的待测样品溶液经过0.45 μm过滤柱过滤后放进样品瓶中待测。
液相色谱条件：流动相为氢氧化钾溶液；柱温30 ℃；流速1.1 mL/min；电流87 mA；进样量25 μL；淋洗程序为0～16 min、KOH浓度1.1 mmol/L，16～29 min、KOH浓度1.1～16.5 mmol/L，29～35 min、KOH浓度16.5～20 mmol/L，35～39 min、KOH浓度20～35 mmol/L，39～41 min、KOH浓度35 mmol/L，41～47 min、KOH浓度35～50 mmol。
（5）挥发性硫化物
挥发性硫化物测定采用气相色谱（GC）法。
样品制备：称取1.0 gNaCl于20 mL顶空瓶中，加入5.0mL经冷藏的啤酒，放转子后压盖密封。在恒温搅拌器上室温涡旋10 min后，放入自动进样器，在顶空进样器中保温，其后进入GC分析。
GC条件：进样口温度250 ℃；柱温：起始温度为35 ℃，保持3 min，以10 ℃/min程序升温到230 ℃，保持5 min；采用分流进样，分流比为10∶1。
定性定量分析：根据保留时间进行定性，外标法定量。
1.3.3 数据处理与分析
数据采用Excel 2020进行表格制作，利用统计软件SPSS 22.0进行数据分析和Pearson相关性分析。
2 结果与分析
2.1 不同种类麦芽常规理化指标的结果分析
对麦芽常规理化指标进行检测分析，结果见表2。水分在一定程度上能够反映麦芽的出炉水分，影响啤酒麦芽的理化性质的稳定性，一般情况下要求水分＜5.0%[16]。由表2可知，麦芽8#水分最高，麦芽5#水分最低，在水分指标上，不同种类的麦芽存在显著差异（P＜0.05）。麦芽浸出率一定程度上反映了大麦籽粒发芽过程中干物质的损耗以及成品麦芽内容物含量的高低[16]。由表2可知，麦芽8#浸出物含量最高，高达（83.8±0.03）%，这与麦芽8#是小麦麦芽有关，小麦无壳，一般情况下，小麦麦芽的浸出物高于大麦麦芽。麦芽3#浸出物最低，为（80.7±0.03）%。同一品种的麦芽1#和麦芽2#，虽然来源于不同制麦厂，但是浸出物较一致；但是同一品种的麦芽3#、麦芽4#和麦芽5#存在显著差异（P＜0.05），鉴于制麦工艺的影响，可能导致制麦过程中浸出物不同程度的损失。麦芽总酸影响麦汁或啤酒酸度，适当的酸度会增加口感的柔和性，总酸过高，会提高啤酒的酸度，引起口感不协调，总酸过低，对口感的丰满度有影响[16]。由表2可知，麦芽3#总酸最高，麦芽2#最低，在总酸上，不同种类的麦芽存在显著差异（P＜0.05）。啤酒麦芽的库尔巴哈值反映了制麦过程中蛋白质的溶解程度，此值愈高，说明蛋白质分解愈完全。总氮反映了麦芽中蛋白质的含量，α-氨基酸态氮反映了麦芽中蛋白质的分解程度[16]。由表2可知，麦芽8#库尔巴哈值最高，为（51.1±0.2）%，麦芽2#最低，为（42.7±0.3）%；麦芽8#总氮和α-氨基酸态氮含量最高，分别为（2.39±0.03）%、（176.0±1.0）mg/100 g，麦芽2#总氮和α-氨基酸态氮含量最低，分别为（1.73±0.01）%和（160±0.6）mg/100 g。总氮含量的差异性主要与麦芽品种相关，α-氨基酸态氮亦取决于制麦过程中蛋白质的溶解度。作为麦汁的功能性成分，可溶性氮的含量更为重要，影响麦汁中氨基酸的种类与含量，对啤酒酵母的发酵代谢产生影响。
表2 不同种类麦芽常规理化指标测定结果
Table 2 Determination results of conventional physicochemical indexes of different types of malts
注：不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
麦芽种类 水分/% 浸出物/% 总酸/（mL·100 mL-1） 库尔巴哈值/% 总氮/% α-氨基酸态氮/（mg·100 g-1）麦芽1#麦芽2#麦芽3#麦芽4#麦芽5#麦芽6#麦芽7#麦芽8#167.0±0.6d 160.0±0.6e 168.0±0.6c 171.0±0.6b 168.0±0.3c 166.0±0.3d 166.0±0.6d 176.0±1.0a 3.97±0.03e 4.70±0.06c 4.90±0.06b 4.27±0.03d 3.77±0.03f 4.67±0.03c 4.27±0.03d 5.03±0.03a 80.9±0.03e 80.8±0.03e 80.7±0.03f 81.5±0.06c 81.1±0.03d 82.3±0.03b 81.6±0.03c 83.8±0.03a 1.03±0.01d 1.00±0.00f 1.13±0.00a 1.11±0.01b 1.11±0.01b 1.05±0.00c 1.01±0.00e 1.06±0.01c 44.0±0.6bc 42.7±0.3e 43.0±0.6de 45.4±0.1b 45.0±0.3bc 44.2±0.4cd 43.0±0.3de 51.1±0.2a 1.76±0.01b 1.73±0.01b 1.90±0.01b 1.86±0.02b 1.80±0.01b 1.89±0.02b 1.90±0.02b 2.39±0.03a
综上，8种不同种类的麦芽在理化指标上具有显著差异，尤其是麦芽3#、麦芽4#、麦芽5#、麦芽6#、麦芽8#的库尔巴哈值、总氮和α-氨基酸态氮高于麦芽1#、麦芽2#，能够提供更多的营养物质，会体现在氨基酸的组分和含量上，对啤酒的风味代谢产生影响[7-9]。
2.2 不同种类麦芽对含硫化合物来源及代谢的影响
2.2.1 对SO42-的来源及代谢的影响
相关研究表明，硫酸盐是酵母代谢形成二氧化硫的唯一底物，向11.5°P麦汁加入0～200 mg/L SO42-，经酵母发酵后发酵液中SO2含量与SO42-添加量呈明显正相关，特别是添加量100 mg/L以下时近乎呈现线性相关，SO42-添加量为100～200 mg/L时二氧化硫增量放缓[18]。传统生产工艺中，添加硫酸钙、硫酸锌等含SO42-的加工助剂后，11～14 °P麦汁中的SO42-含量一般为150～200 mg/L，原料和加工助剂是麦汁中SO42-的重要来源[19]。因此麦芽作为酿造主要原料，其SO42-含量可能会对硫代谢产生影响。
不同种类麦芽制备麦汁及啤酒中的SO42-含量测定结果见表3。由表3可知，麦芽3#、4#、7#和8#中SO42-含量高于平均水平，麦芽1#、2#、5#和6#中SO42-含量低于平均水平，其中麦芽3#和7#SO42-含量均＞40 mg/L，麦芽6#SO42-含量最低，＜30 mg/L。针对于同一品种麦芽（麦芽1#和2#为普拉奈特，麦芽3#、4#和5#为麦特卡夫）而言，所制备麦汁SO42-含量上有一定的差异，可能与不同制麦厂的制麦工艺、制麦用水SO42-含量相关。不同品种麦芽所制备麦汁SO42-具有显著性的差异，这与品种、种植、气候、土壤，以及制麦工艺相关[20]。
表3 不同种类麦芽制备的麦汁及啤酒中SO42-含量测定结果
Table 3 Determination results of SO42-content in wort and beer produced by different types of malts
注：代谢量=发酵前SO42-含量-发酵后SO42-含量，代谢率=代谢量/发酵前SO42-含量×100%。下同。
项目 麦芽1# 麦芽2# 麦芽3# 麦芽4# 麦芽5# 麦芽6# 麦芽7# 麦芽8#麦汁/（mg·L-1）啤酒/（mg·L-1）代谢量/（mg·L-1）代谢率/%39.3±0.6 36.3±0.4 3.0 7.63 35.8±0.3 34.3±0.2 1.5 4.19 33.2±0.3 31.4±0.2 1.8 5.42 43.7±0.5 42.9±0.3 0.8 1.83 37.5±0.3 36.1±0.1 1.4 3.73 35.5±0.3 34.7±0.2 0.8 2.25 28.8±0.4 27.4±0.2 1.4 4.86 43.5±0.5 40.8±0.2 2.7 6.21
由表3可知，麦芽8#和7#发酵前后SO42-代谢量处于前列，分别为3.0 mg/L和2.7 mg/L，相应的代谢率分别为7.63%和6.21%。麦芽3#和5#处于最后，均为0.8 mg/L，相应的代谢率分别为1.83%、2.25%。说明经拉格酵母发酵后，不同种类麦芽所制备麦汁中进入硫代谢的SO42-数量差异明显，存在麦芽3#麦汁SO42-含量高，进入代谢的数量少；或者麦芽2#麦汁SO42-含量低，进入代谢的数量多的结果，说明拉格酵母对麦汁SO42-的代谢存在一定的调控作用。在酵母对SO42-代谢上，体现出麦芽至关重要的作用。
2.2.2 对含硫氨基酸的来源及代谢的影响
相关研究表明，酵母生物合成蛋氨酸（methionine，Met）及半胱氨酸（cysterine，Cys）时的硫来自于酵母对SO42-还原生产的硫，酵母对SO42-的还原受到麦汁中蛋氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸的反馈调节[21]。此外，蛋氨酸是酵母细胞生长所需的含硫氨基酸之一，麦汁中蛋氨酸含量较高，一般情况下＞50 mg/L。蛋氨酸可抑制细胞内SO42-还原途径中基因的表达，从而影响啤酒酵母代谢生成SO2[7-8]。由此可见，研究麦芽对含硫氨基酸的来源及其代谢的影响显得尤为重要。
采用氨基酸分析仪对不同种类麦芽所制备麦汁和啤酒中的与硫代谢相关的蛋氨酸和半胱氨酸含量进行检测，结果分别见表4和5。
表4 不同种类麦芽制备的麦汁及啤酒蛋氨酸含量测定结果
Table 4 Determination results of methionine content in wort and beer produced by different types of malts
项目 麦芽1# 麦芽2# 麦芽3# 麦芽4# 麦芽5# 麦芽6# 麦芽7# 麦芽8#麦汁/（mg·L-1）啤酒/（mg·L-1）代谢量/（mg·L-1）代谢率/%30.0±1.0 2.0±0.0 28.0 93.3 28.0±0.7 3.0±0.3 25.0 89.3 39.0±1.0 8.0±0.5 31.0 79.5 37.0±0.3 7.0±0.5 30.0 81.1 41.0±1.0 9.0±0.5 32.0 78.0 36.0±0.7 6.0±0.5 30.0 83.3 38.0±1.0 7.0±0.5 31.0 81.6 28.0±0.3 3.0±0.2 25.0 89.3
由表4可知，蛋氨酸代谢量依次为麦芽5#（32 mg/L）、麦芽3#（31 mg/L）、麦芽7#（31 mg/L）、麦芽4#（30 mg/L）、麦芽6#（30 mg/L）、麦芽1#（28 mg/L）、麦芽2#（25 mg/L）和麦芽8#（25 mg/L）；代谢率依次为麦芽1#（93.3%）、麦芽2#（89.3%）、麦芽8#（89.3%）、麦芽6#（83.3%）、麦芽7#（81.6%）、麦芽4#（81.1%）、麦芽3#（79.5%）和麦芽5#（78.0%）。由此可见，不同类型麦芽，经过拉格酵母代谢后，蛋氨酸的代谢量与代谢率存在差异。
由表5可知，相比于蛋氨酸含量，不同种类麦芽所制备麦汁中半胱氨酸含量较少，经过拉格酵母代谢后，半胱氨酸没有表现出明显的差异，这也可能与含量低以及检测误差（约10%）有关。麦汁中半胱氨酸含量在3.0～6.0 mg/L之间，其中麦芽8#含量最高为6.0 mg/L，麦芽3#最低为3.0 mg/L；在发酵后仅有麦芽1#、2#、8#代谢量为1.0 mg/L，代谢率依次为25.0%、20.0%和16.7%。其余种类麦芽代谢前后半胱氨酸含量一致。
表5 不同种类麦芽制备的麦汁及啤酒半胱氨酸含量测定结果
Table 5 Determination results of cysteine contents in wort and beer produced by different types of malts
项目 麦芽1# 麦芽2# 麦芽3# 麦芽4# 麦芽5# 麦芽6# 麦芽7# 麦芽8#麦汁/（mg·L-1）啤酒/（mg·L-1）代谢量/（mg·L-1）代谢率/%4.0±0.3 3.0±0.3 1.0 25.0 5.0±0.3 4.0±0.6 1.0 20.0 3.0±0.3 3.0±0.3 0.0 0.0 4.0±0.3 4.0±0.3 0.0 0.0 4.0±0.3 4.0±0.3 0.0 0.0 4.0±0.3 4.0±0.3 0.0 0.0 4.0±0.3 4.0±0.3 0.0 0.0 6.0±0.6 5.0±0.3 1.0 16.7
从不同种类麦芽对含硫氨基酸的来源及代谢的影响结果来看，8种不同种类的麦芽，在发酵过程中，蛋氨酸的代谢量及代谢率较高，代谢量＞25.0 mg/L，代谢率＞75%，而半胱氨酸的代谢可能处于动态平衡的过程，没有发生显著的变化。其中同一品种（麦特卡夫）的麦芽3#、麦芽4#和麦芽5#具有蛋氨酸代谢量高，蛋氨酸代谢率低的特点，在一定程度上减少酵母对SO42-的代谢。
2.3 不同种类麦芽对啤酒常规理化指标及挥发性硫化物的影响
2.3.1 啤酒常规理化指标分析
不同种类麦芽制备啤酒常规理化指标（原麦汁浓度、酒精度、真实浓度和真实发酵度）检测结果见表6。由表6可知，麦芽7#原麦汁浓度和真实浓度最高、麦芽4#酒精度最高、麦芽3#真实发酵度最高。原麦汁浓度在8.60～9.04°P，酒精度在3.80%vol～3.97%vol，发酵度保持在67.4%～69.9%，主要可能是麦芽品种或制麦工艺对浸出率、糖化力的影响，导致原麦汁浓度以及糖组分的差异，对发酵度产生了一定的影响，因此也对应的体现在酒精度和真实浓度上。
表6 不同种类麦芽制备啤酒的常规理化指标测定结果
Table 6 Determination results of conventional physicochemical indexes of beer produced by different types of malts
项目 麦芽1# 麦芽2# 麦芽3# 麦芽4# 麦芽5# 麦芽6# 麦芽7# 麦芽8#原麦汁浓度/°P酒精度/%vol真实浓度/°P真实发酵度/%8.60 3.80 2.69 69.7 8.93 3.95 2.81 69.5 8.86 3.94 2.75 69.9 9.03 3.97 2.88 69.1 8.97 3.86 2.99 67.7 8.76 3.78 2.9 67.9 9.04 3.88 3.03 67.5 8.98 3.85 3.03 67.4
通过不同种类麦芽制备啤酒常规理化指标检测结果可知，不同类型麦芽所制备麦汁接种酵母后，没有表现出发酵异常或中止的情况，表明均能够正常完成发酵，因此进一步对啤酒风味进行分析。
2.3.2 啤酒挥发性硫化物指标分析
啤酒中的挥发性硫化物大都是在发酵过程中形成的。目前报道啤酒中挥发性硫化物主要有二氧化硫、硫化氢、二甲基硫（dimethyl sulfur，DMS）、二乙基硫（diethyl sulfur，DES）、甲硫醇（methyl mercaptan，MeSH）、乙硫醇、二甲基二硫（dimethyldisulfide，DMDS），二甲基三硫（dimethyl trisulfide，DMTS）、二硫化碳等[6，22]。酵母对硫化物的代谢作用首先是利用有机硫化物，在可代谢的有机硫化物存在下，硫酸根离子很少被利用，因为无机硫的摄入需要能量和氮源[7]。硫化氢的形成大部分来自酵母对半胱氨酸、硫酸盐和亚硫酸盐的同化作用及酵母合成蛋氨酸受抑制时的中间产物。蛋氨酸是许多代谢途径的中心，因此如果其他途径能利用较多的蛋氨酸，就能减少由蛋氨酸产生的甲硫醇的含量[7，23]。从硫化物形成机理可以看出，参与硫代谢的不外乎如下三因素：①含硫氨基酸；②无机硫；③酵母。
本研究中的挥发性硫化物以硫化氢、甲硫醇、二甲基硫、S-甲基硫代乙酸酯、二甲基二硫进行评价，其检测结果见表7。
表7 不同种类麦芽制备的啤酒中挥发性硫化物含量测定结果
Table 7 Determination results of volatile sulfur compounds contents in beer produced by different types of malts μg/L
类型 风味描述 麦芽1# 麦芽2# 麦芽3# 麦芽4# 麦芽5# 麦芽6# 麦芽7# 麦芽8#硫化氢甲硫醇二甲基硫S-甲基硫代乙酸酯二甲基二硫合计臭鸡蛋味烂菜味煮玉米味煮玉米味烂菜味3.7±0.2 4.4±0.2 40.7±1.8 1.8±0.2 17.6±2.0 68.2 3.2±0.2 5.0±0.1 44.6±1.5 3.0±0.1 13.0±1.2 68.8 2.8±0.2 3.8±0.2 44.2±2.0 2.1±0.1 14.7±1.5 67.6 2.5±0.3 3.8±0.1 30.8±0.8 3.5±0.1 15.7±0.5 56.3 1.8±0.3 4.5±0.1 25.6±1.4 3.0±0.2 30.3±2.0 65.2 2.0±0.2 4.8±0.2 37.2±1.0 2.4±0.1 11.7±0.8 58.1 3.4±0.3 4.7±0.1 40.8±1.2 3.1±0.1 19.2±0.6 71.2 1.8±0.3 4.8±0.2 27.1±1.5 1.7±0.1 12.0±0.8 47.4
啤酒发酵过程中酵母的硫代谢会产生痕量的H2S，一定含量的H2S能产生臭鸡蛋等令人极为不愉悦的风味，酵母可以利用硫酸盐等无机硫以及半胱氨酸、蛋氨酸和谷胱甘肽等有机硫源生成H2S[17-18]。由表7可知，在硫化氢上，麦芽1#含量最高，为3.7 μg/L，其次是麦芽7#、麦芽2#、麦芽3#，分别为3.4 μg/L、3.2 μg/L、2.8 μg/L，麦芽5#和麦芽8#含量最低，均为1.8 μg/L。
在硫代谢中，酵母可以将蛋氨酸转化生成甲硫醇、乙硫醇和3-甲硫基丙醇等。甲硫醇在啤酒中的阈值是2.0 μg/L，甲硫醇极易氧化为二甲基二硫，然后再进一步不成比例地氧化为二甲基硫与二甲基三硫[24]。由于甲硫醇极易氧化，因此在风味分析中二甲基二硫、二甲基三硫、二甲基硫与甲硫醇可能会结伴出现。在甲硫醇上，麦芽2#样品含量最高，为5.0 μg/L，其次是麦芽8#、麦芽6#和麦芽1#，含量为4.4～4.8 μg/L，麦芽3#和麦芽4#含量低，均为3.8 μg/L。
在二甲基硫（DMS）上，麦芽2#样品含量最高，为44.6μg/L，其次是麦芽3#、麦芽7#和麦芽1#，均＞40.0 μg/L，再次是麦芽6#、麦芽4#和麦芽8#，含量分别为37.2 μg/L、30.8 μg/L、27.1 μg/L，麦芽5#含量最低，为25.6 μg/L。二甲基硫是对啤酒风味影响较大的挥发性硫化物[24]，当其含量较低时，对啤酒的风味是有利的，但是达到一定含量后会产生“腐烂蔬菜味”、“烤玉米味”等风味缺陷，严重影响啤酒的风味质量。
在S-甲基硫代乙酸酯上，麦芽4#样品含量最高，为3.5μg/L，其次是麦芽7#、麦芽2#、麦芽5#，含量为3.0～3.1μg/L，麦芽8#含量最低，为1.7 μg/L。
在二甲基二硫上，麦芽5#样品含量最高，为30.3 μg/L，其次是麦芽7#和麦芽1#，分别为19.2 μg/L、17.6 μg/L，麦芽6#含量最低，为11.7 μg/L。二甲基二硫是一个重要的二硫醚化合物，在啤酒、葡萄酒、白酒、黄酒、苹果酒等众多酒类中检测到，呈大蒜、烂菜味的风味特点[24-26]。
结果表明，麦芽1#、麦芽2#和麦芽7#挥发性硫化物总量处于前列，为68.2～71.2 μg/L，不同麦芽对挥发性硫化物种类以及含量的影响有一定的差异性，这应该与麦芽所制备麦汁的营养组分具有一定的相关性[3]。麦芽8#（国产小麦芽）表现最佳，挥发性硫化物总量最低，为47.4 μg/L，然而其SO42-代谢量和代谢率高于其他大麦麦芽，与大麦麦芽具有显著差异，在理化指标上，麦芽8#的库尔巴哈值、总氮与α-氨基酸态氮均高于其他品种，那么在麦汁组分上与大麦麦芽具有显著性的差异，可能体现在其他氨基酸上，如：苏氨酸或天冬氨酸，以及其他影响酵母活性的成分上，如：不饱和脂肪酸，生长因子等[27]。对于挥发性硫化物，在大麦麦芽中，麦特卡夫（麦芽3#、4#和5#）和卡普兰德（麦芽6#）优于普拉奈特（麦芽1#、2#）和国产大麦芽（麦芽7#），这个结果与麦汁中蛋氨酸相对应，影响酵母SO42-代谢量和代谢率，导致生成挥发性硫化物的差异。
2.4 相关性分析
蛋氨酸是硫代谢途径的中心，能够反馈调节酵母对SO42-的还原代谢，影响硫化物的代谢[5，20]。因此，对库尔巴哈值、总氮、α-氨基酸态氮、SO42-、蛋氨酸、代谢量/率与挥发性硫化物进行了Pearson相关性分析，结果见表8。
表8 Pearson相关性分析结果
Table 8 Results of Pearson correlation analysis
注：“**”表示相关性极显著（P＜0.01）；“*”表示相关性显著（P＜0.05）。
类型 库尔巴哈值 总氮 α-氨基酸态氮麦汁SO42-啤酒SO42-SO42-代谢量SO42-代谢率麦汁Met啤酒Met Met代谢量代谢率 硫化氢 甲硫醇 二甲基硫Met S-甲基硫代乙酸酯二甲基二硫库尔巴哈值总氮α-氨基酸态氮麦汁SO42-啤酒SO42-SO42-代谢量SO42-代谢率麦汁Met啤酒Met Met代谢量Met代谢率硫化氢甲硫醇二甲基硫S-甲基硫代乙酸酯二甲基二硫1 0.891**0.858**0.047-0.036 0.515 0.517-0.366-0.273-0.435 0.235-0.618 0.199-0.740*-0.410-0.158 1 0.806*0.294 0.195 0.657 0.609-0.295-0.192-0.377 0.138-0.513 0.198-0.476-0.488-0.349 1 0.344 0.303 0.312 0.214 0.014 0.051-0.023-0.062-0.538-0.266-0.709*-0.374-0.036 1 0.987**0.257-0.033 0.263 0.283 0.227-0.273 0.263-0.439 0.110-0.057 0.118 1 0.100-0.191 0.351 0.364 0.318-0.346 0.261-0.541 0.132-0.040 0.179 1 0.954**-0.492-0.442-0.511 0.390 0.056 0.537-0.119-0.108-0.349 1-0.616-0.564-0.629 0.502-0.019 0.678-0.113-0.129-0.465 1 0.969**0.971**-0.937**-0.238-0.515-0.165 0.437 0.583 1 0.882**-0.993**-0.369-0.471-0.233 0.497 0.539 1-0.829*-0.097-0.527-0.09 0.354 0.590 1 0.415 0.444 0.238-0.526-0.462 1-0.095 0.779*0.024-0.115 1-0.041-0.106-0.082 1-0.073-0.415 1 0.336 1
由表8可知，库尔巴哈值、总氮和α-氨基酸态氮三者之间均呈极显著的正相关（P＜0.01），库尔巴哈值、总氮与SO42-代谢量/率呈正相关，库尔巴哈值、总氮和α-氨基酸态氮与硫化氢呈负相关，库尔巴哈值和α-氨基酸态氮与二甲基硫呈极显著的负相关（P＜0.01）。SO42-代谢量与SO42-代谢率、麦汁Met与Met代谢量、硫化氢与二甲基硫均呈现极显著的正相关（P＜0.01）。麦汁Met与Met代谢率、Met代谢量与Met代谢率均呈现极显著的负相关（P＜0.01）。说明麦汁Met含量越高，其发酵代谢量越高，上述中Met代谢率均高于78%，说明大部分蛋氨酸参与了发酵过程中的生物代谢。然而麦汁Met含量越高，其代谢率越低，说明参与发酵过程的更少，对应的含量低时，其参与发酵过程中的更多，意味着生物代谢过程中，需要满足一定量的蛋氨酸，当蛋氨酸不足或过多的时候，对蛋氨酸的代谢产生对应的影响。SO42-代谢量、SO42-代谢率与麦汁Met、Met代谢量呈负相关，说明SO42-受到Met的调控影响，这也与上述结果保持一致。SO42-代谢量、SO42-代谢率与甲硫醇呈正相关，说明在发酵过程中，参与代谢的SO42-数量越多，那么会促进拉格酵母代谢生成更多的甲硫醇。麦汁Met、Met代谢量与硫化氢、甲硫醇和二甲基硫呈负相关，与S-甲基硫代乙酸酯和二甲基二硫呈正相关，对应的Met代谢率与硫化氢、甲硫醇和二甲基硫呈正相关，与S-甲基硫代乙酸酯和二甲基二硫呈负相关。由此可见，蛋氨酸在拉格酵母发酵过程中对含硫化物的代谢起到关键作用。
3 结论
本研究通过对8种不同种类麦芽的浸出率、库尔巴哈值、总氮和α-氨基酸态氮等理化指标，以及所制备麦汁经拉格酵母发酵前后SO42-和含硫氨基酸、啤酒挥发性硫化物的分析，以及Pearson相关性分析。结果表明，麦芽在库尔巴哈值、总氮和α-氨基酸态氮上差异显著，经酵母发酵代谢后，在SO42-代谢量/率、蛋氨酸的代谢量/率上表现不同，导致生成挥发性硫化物的差异。Pearson相关性分析表明库尔巴哈值、总氮与SO42-代谢量/率呈正相关，库尔巴哈值、总氮和α-氨基酸态氮与硫化氢呈负相关，库尔巴哈值、α-氨基氮与二甲基硫呈负相关，蛋氨酸与其代谢量呈极显著的正相关（P＜0.01），与其代谢率呈极显著的负相关（P＜0.01），蛋氨酸与SO42-代谢量/代谢率之间呈负相关，说明提高麦汁高蛋氨酸含量能够降低拉格酵母对SO42-的代谢，减少代表性挥发性硫化物（硫化氢、甲硫醇和二甲基硫等）的形成。整体而言，在理化指标库尔巴哈值、总氮和α-氨基酸态氮上，麦特卡夫和卡普兰德高于普拉奈特，在蛋氨酸指标上，麦特卡夫和卡普兰德高于普拉奈特，据此，可以通过不同品种麦芽的复配提高麦汁蛋氨酸含量，达到降低拉格酵母对SO42-的代谢，减少挥发性硫化物的生产，提高啤酒风味质量，以及缩短成熟周期的目的。
此外，研究中发现拉格酵母对小麦麦芽在挥发性硫化物的代谢上与大麦麦芽不一致，鉴于小麦麦芽的独特性，未来对小麦麦芽在该方向上开展进一步研究。
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