纳豆（Natto）起源于中国古代，具有黏性，气味较臭，味道微甜，富含纳豆激酶、维生素、异黄酮和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等活性物质，是一种具有良好营养保健功能的优质食品资源[1-2]。纳豆激酶（Nattokinase，NK）是一种安全溶栓的天然物质，具有抑制血小板凝固的作用，其半衰期长、特异性强、副作用小、可直接口服，在预防和治疗心脑血管栓塞症等方面起到积极作用[3-4]。我国现有心血管疾病患病人数约为3.3亿人，其中血栓是引起心血管疾病人群死亡和致残的首要原因[5-6]，因此开发以纳豆激酶为核心的保健食品，扩大其临床和商业的应用是符合《国民营养计划（2017—2030）》，为改善我国居民营养状况、提高人群整体健康水平提供重要政策支撑和保障[7]。
低温核桃粕是核桃油冷榨生产工艺过程中产生的一种副产物[8-9]，具有核桃清香味，是一种良好的植物蛋白资源，蛋白质含量高达30%～40%，还富含矿物质、膳食纤维及多酚等营养物质[10]，可以为发酵菌株提供充足的氮源和碳源，因此在食品固态发酵研究中应用广泛。王宸轩等[11]以核桃粕为原料，研究了核桃粕固态发酵酱油的最佳工艺；高瑞雄等[12]以冷榨核桃粕为原料，研究了固态发酵制备纳豆激酶的最佳工艺。但目前关于低温核桃粕纳豆发酵研究还鲜有报道。
本研究以核桃粕与黄豆为原料，采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵制备核桃粕纳豆，采用单因素及响应面试验对固态发酵工艺进行优化，不仅有利于传统纳豆的风味改良和质量提升，而且为核桃粕和黄豆深加工提供了新方向，对核桃粕和黄豆资源开发和利用十分有意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
低温核桃粕：甘肃陇小南电子商务有限公司；黄豆：市售；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：陇南师专农林技术学院实验室；尿激酶（10 000 U/mg）、凝血酶（2 000 U/mg）、纤维蛋白原（牛血）等试剂：黑龙江迪龙制药有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
7890A-5975C型气质联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）：美国安捷伦科技有限公司；UV2600紫外可见分光光度计：岛津国际贸易（上海）有限公司；LS-35L立式压力蒸汽灭菌机：山东创美机械科技有限公司；DH3600电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 核桃粕纳豆加工工艺流程及操作要点
操作要点：选取粒径约6 mm左右的小粒黄豆和完整低温核桃饼粕，剔除有破损、霉变和虫蛀的不完整豆粒和核桃粕，用流水冲洗附着在豆皮上和核桃粕上的杂质，分别按质量比1∶3加水浸泡过夜，沥干水分。为了使核桃粕发酵充分，片状或块状核桃粕还需粉碎，过100目筛。将上述处理过的黄豆和核桃粕，分别放入发酵瓶中，于121 ℃蒸煮30 min。将枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，放置于37 ℃、170 r/min摇床培养24 h，即得发酵菌液。按照一定比例将蒸煮好的核桃粕均匀平铺于培养皿底部，上面以黄豆覆盖，冷却至40 ℃左右，接入发酵菌液，晃动培养皿使黄豆和核桃粕均匀的裹上菌液。放入培养箱发酵24 h，取出置于冰箱后熟18 h，即得成品核桃粕纳豆。
1.3.2 核桃粕纳豆发酵工艺优化单因素试验设计
通过单因素试验设计，以综合评价分为考察指标，分别考察核桃粕添加量（16%、18%、20%、22%、24%）、枯草芽孢杆菌接种量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、发酵温度（31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃）、发酵时间（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h）和后熟时间（12 h、16 h、20 h、24 h、28 h）对核桃粕纳豆品质的影响。
1.3.3 核桃粕纳豆发酵工艺优化响应面试验设计
在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken中心组合试验设计法，以核桃粕添加量（A）、接种量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）为4个考察因素，以综合评价分（Y）为响应值，设计4因素3水平响应面试验，优化核桃粕纳豆发酵工艺。响应面试验因素与水平见表1。
表1 核桃粕纳豆发酵工艺优化响应面试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of walnut meal natto
因素A 核桃粕添加量/%B 接种量/%C 发酵温度/℃D 发酵时间/h-1编码水平0 1 18 0.5 37 12 20 1.0 40 24 22 1.5 43 36
1.3.4 测定方法
感官评价：由10名感官培训人员组成评价小组，对核桃粕纳豆从拉丝、气味、色泽和口感四个方面进行感官评价，并取其平均值。核桃粕纳豆感官评价标准见表2（满分100分）。
表2 核桃粕纳豆感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standard of walnut meal natto
项目 评价标准 分值/分拉丝（25分）气味（25分）色泽（25分）口感（25分）拉丝20 cm以上，黏液量丰富拉丝16～20 cm左右，黏液量较多拉丝11～15 cm左右，黏液量一般拉丝6～10 cm左右，黏液量少拉丝0～5 cm左右，无黏液无氨味，有核桃和纳豆的特殊香味无氨味，略有核桃和纳豆的香味稍有氨味氨味较重氨味刺鼻鲜亮、有光泽、呈黑褐色，色泽均匀稍有光泽，色泽均匀色泽不均匀色泽暗淡无光泽，色泽暗淡口感绵软、湿润较绵软、湿润较绵软、较湿润较绵软、较干不绵软、较干20～25 15～20 10～15 5～10＜5 20～25 15～20 10～15 5～10＜5 20～25 15～20 10～15 5～10＜5 20～25 15～20 10～15 5～10＜5
综合评价：参照付文静[13]的综合评价法，感官评分和纳豆激酶酶活两指标各占50%权重。其计算公式如下：
感官指标分析：参照SB/T 10528—2009《纳豆》[14]和T/CNLIC 0036—2021《纳豆》[15]对核桃粕纳豆进行感官分析。
核桃粕纳豆水分、蛋白质、氨基酸态氮和纳豆激酶活力的测定：参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[16]、GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[17]、GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》[18]及分光光度法[13]。
挥发性物质测定：
样品预处理：称取均匀研碎的核桃粕纳豆样品3.00 g于15 mL顶空瓶中，加入1 g NaCl和6 mL超纯水，插入已老化的固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）纤维头，在温度50 ℃，转速500 r/min的条件下预热样品15 min，将萃取头插入进样口于250 ℃解吸3 min。
GC条件：载气为氦气（He），流速1.0 mL/min，不分流进样；气化室温度250 ℃；传输线温度280 ℃；升温程序：初始温度40 ℃，恒温2 min，以5 ℃/min的升温速率升高到150 ℃，再以10 ℃/min的速度升至260 ℃，保持5 min[19-20]。
MS条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子轰击能量70 eV；气质接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃[21]。
定性定量方法：对检测出的成分采用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）11数据库自动检索化合物的质谱数据，参考标准光谱图进行定性分析；采用面积归一化法定量。
1.3.5 数据统计与分析
采用Microsoft office Excel 2016软件和Design Expert 10软件对数据进行分析处理，每组试验平行测定3 次。
2 结果与分析
2.1 核桃粕纳豆发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 核桃粕添加量对纳豆品质的影响
由图1可知，随低温核桃粕添加量的增加，核桃粕纳豆综合评价分呈先升高后降低的趋势。当核桃粕添加量为20%时，综合评价达到最大值，为81.3分。这可能是因为随着核桃粕添加量的不断增加，核桃粕特有的清香味，在一定程度上提升了纳豆的感官品质；但当核桃粕添加量过高时，因其颗粒度较小，会附着在黄豆表面，减少枯草芽孢杆菌与黄豆的直接接触，导致纳豆激酶活力降低。因此，选择最佳核桃粕添加量为20%。
图1 核桃粕添加量对核桃粕纳豆品质的影响
Fig.1 Effect of walnut meal addition on the quality of walnut meal natto
2.1.2 枯草芽孢杆菌接种量对纳豆品质的影响
由图2可知，随枯草芽孢杆菌接种量的增加，核桃粕纳豆综合评价分呈先升高后缓慢降低的趋势。当接种量＜1%时，核桃粕纳豆表面附着的白膜少、拉丝短，纳豆激酶酶活低，这可能是因为接种量不足导致底物发酵不彻底造成的；当接种量为1%时，纳豆表面附着的白膜增多、拉丝变长，纳豆激酶酶活也显著增高，综合评价达到最大值，为80.3分；当接种量＞1%时，随着接种量的增加，纳豆表面附着的白膜不再增多，拉丝不再变长，且纳豆表面失水出现褶皱现象，导致纳豆感官品质下降，这可能是因为接种量越高，枯草芽孢杆菌繁殖越快，底物消耗力度大，发酵时间就会缩短，枯草芽孢杆菌生长到一定阶段，菌体原生质失水形成椭圆形倒柱状的内生孢子，出现褶皱现象。因此，选择最佳枯草芽孢杆菌接种量为1%。
图2 枯草芽孢杆菌接种量对核桃粕纳豆品质的影响
Fig.2 Effect of Bacillus subtilis inoculum on the quality of walnut meal natto
2.1.3 发酵温度对纳豆品质的影响
由图3可知，随发酵温度的升高，核桃粕纳豆综合评价分呈先升高后降低的趋势。随着发酵温度的不断提高，纳豆表面附着的白膜逐渐增多，纳豆激酶活力不断升高；当发酵温度达到40 ℃时，综合评价分达到最大值，为96.0分；继续升高发酵温度，纳豆表面附着的白膜不再增多反而减少，纳豆激酶活力也开始下降。这可能是因为在适宜的温度条件下，枯草芽孢杆菌生长旺盛，利于纳豆发酵。当发酵温度过低或过高时，都会影响枯草芽孢杆菌的生长繁殖[22]。因此，选择最佳发酵温度为40 ℃。
图3 发酵温度对核桃粕纳豆品质的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of walnut meal natto
2.1.4 发酵时间对纳豆品质的影响
由图4可知，随着发酵时间的延长，核桃粕纳豆综合评价分呈先升高后降低的趋势。当发酵时间为24 h时，综合评价分达到最大值，为96.0分。当发酵时间较短时，枯草芽孢杆菌活菌数不足，纳豆表面白膜较少，纳豆激酶活力低，发酵不充分；当发酵时间过长时，营养物质减少，环境的载菌量不足以承受较多的芽孢，枯草芽孢杆菌菌体逐渐进入衰亡期，亦不利于发酵[23]。因此，选择最佳发酵时间为24 h。
图4 发酵时间对核桃粕纳豆品质的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of walnut meal natto
2.1.5 后熟时间对纳豆品质的影响
由图5可知，随着后熟时间的延长，核桃粕纳豆综合评价分呈先上升后缓慢下降的趋势。当后熟时间为20 h时，综合评价分达到最大值，为90.5分。这可能是因为纳豆激酶极不稳定，会随着后熟时间的延长发生转化或降解；亦或是后熟过程中产生了特殊的活性物质，对纳豆激酶的活性产生了抑制作用所致[24]。因此，选择最佳后熟时间为20 h。
图5 后熟时间对核桃粕纳豆品质的影响
Fig.5 Effect of post ripening time on the quality of walnut meal natto
2.2 核桃粕纳豆发酵工艺优化响应面试验结果
2.2.1 响应面试验设计及结果
根据单因素试验结果分析，运用Box-Behnken响应面优化方法，对表3试验数据进行多元非线性拟合，拟合回归方程为：
表3 核桃粕纳豆发酵工艺优化响应面试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of response surface tests for fermentation process optimization of walnut meal natto
试验号 A 核桃粕添加量 B 接种量 C 发酵温度D 发酵时间Y 综合评价/分1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0 1 0 --1-1-1 1 0 0 0 0 -0 0 0 -0 0 0 -1 1 -1 0 0 0 1 0 0 -1 0 1 0 0 --1 0 0 -11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1 0 0 0 1 1 0 -1 0 1 0 1 0 -1 0 0 0 1 0 0 0 -1 0 -1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 -1 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 -1 1 0 0 --1 1 0 0 1 1 0 -1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 -1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 -1 65.0 81.1 92.0 71.2 79.0 85.1 79.0 93.0 61.2 68.7 95.0 91.0 87.1 85.1 93.0 68.2 87.0 79.0 80.0 78.1 83.1 75.0 71.0 62.2 90.0 88.0 80.0 79.0 65.3
2.2.2 回归模型方差分析
由表4可知，模型F值为23.35，P值＜0.000 1，模型极显著，失拟项（P=0.075 1＞0.05）不显著，说明模型选择准确。决定系数R2=0.958 9，调整决定系数R2Adj=0.917 9，说明此模型和实际实验拟合较好。预测的核桃粕纳豆最佳发酵工艺为核桃粕添加量20.5%、接种量1.2%、发酵温度40.9 ℃、发酵时间27 h和后熟时间20 h。此条件下的核桃粕纳豆综合评价预测值为95.0分。在此条件下进行3次平行验证试验，试验测得综合评价实际值为94.3分，二者数值接近，说明模型预测所得最佳发酵工艺可用于核桃粕纳豆实际生产。
表4 Box-Benhnken试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of Box-Benhnken tests results
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值模型14 ABCDA B**********AC AD BC BD 2 609.85 337.08 364.10 348.84 154.08 5.76 40.96 25.00 4.00 0.42 1 1 1 1 1 1 1 1 1 186.42 337.08 364.10 348.84 154.08 5.76 40.96 25.00 4.00 0.42 23.35 42.23 45.61 43.70 19.30 0.72 5.13 3.13 0.50 0.053 P 值 显著性＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.000 6 0.409 9 0.039 9 0.098 5 0.490 6 0.821 4*
续表
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著
（P＜0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值CD A2 B2 C2 D2 17.59 98.62 64.79 23.95 31.15 P 值 显著性0.000 9＜0.000 1＜0.000 1 0.000 2＜0.000 1**********残差失拟项纯误差总回归140.42 787.25 517.17 191.19 248.67 111.76 102.96 8.80 2 721.61 1 1 1 1 1 1 4 10 4 28 140.42 787.25 517.17 191.19 248.67 7.98 10.30 2.20 4.68 0.075 1
2.2.3 响应面分析
对核桃粕添加量（A）、接种量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）4个因素两两作交互作用分析，对其作响应曲面及等高线，结果见图6。响应曲面越陡峭，说明影响越显著；曲面越平坦，说明影响越小[25-27]。由图6可知，核桃粕添加量与发酵温度之间（AC）、发酵温度与发酵时间（CD）之间的交互作用强，响应曲面呈凸形，抛物面更陡峭。
图6 各因素间交互作用对核桃粕纳豆综合品质影响的响应曲面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the comprehensive quality of walnut meal natto
2.3 产品品质分析
2.3.1 感官指标分析
依据SB/T 10528—2009《纳豆》和T/CNLIC 0036—2021《纳豆》感官要求对产品进行检验，结果表明核桃粕纳豆色泽呈茶褐色，表面均匀覆盖一层白色菌膜，具有纳豆特有气味，搅拌时有黏性强，拉丝长，且豆粒完整，软硬适当。
2.3.2 理化指标分析
由表5可知，各项理化指标均符合纳豆商业标准要求。
表5 核桃粕纳豆理化指标检测结果
Table 5 Physicochemical indexes determination results of walnut meal natto
项目 水分含量/% 蛋白质含量/% 氨基酸态氮/（g·100 g-1） 纳豆激酶活力/U 枯草芽孢杆菌活菌数/（CFU·g-1）核桃粕纳豆市售纳豆SB/T 10528—2009《纳豆》和T/CNLIC 0036—2021《纳豆》59.8±0.01 60.4±0.02≤65 18.2±0.29 17.6±0.50≥14 0.18±0.02 0.15±0.03≥0.3 1 698±0.06 1 380±0.12-1.8×108 1.2×109≥1×108
2.3.3 挥发性物质测定
由表6可知，核桃粕纳豆由HS-SPME-GC-MS分析鉴定出的挥发性物质主要有烃类22种（24.8%）、醇类9种（36.0%）、酯类8种（36.0%）、醚类1种（1.9%）、酮类1种（0.7%）、杂环化合物2种（0.6%）。上述挥发性物质共同构成了核桃粕纳豆独特的风味。核桃粕纳豆中主要的挥发性风味物质有2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯（31.3%）、芳樟醇（19.5%）、4-萜烯醇（9.1%）、石竹烯（4.4%）等。2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯属于酯类化合物，具有花椒油的气味[28]；芳樟醇属于链状萜烯醇类，具有铃兰特征的花香气味[29]；4-萜烯醇属于天然单萜类化合物，具有较淡的泥土香和陈腐的木材气味[30]；石竹烯属于双环倍半萜类化合物，具有辛香、木香、柑橘香、樟脑香及温和的丁香香气[31]。与传统纳豆风味相比，川芎嗪（0.34%）等具有特殊异臭味的挥发性物质相对减少[32]，核桃粕与黄豆共发酵起到了改善不良风味的作用，这可能是因为核桃粕原料本身或二者共发酵相互作用所致。
表6 核桃粕纳豆挥发性物质分析
Table 6 Analysis of volatile substances in walnut meal natto
类别 序号 化合物 保留时间/min 分子质量 相对含量/%烃类醇类1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31甲苯-D8甲苯四氯乙烯4-亚甲基-1-（1-甲基乙基）双环[3.1.0]2-己烯6,6-二甲基-2-亚甲基-二环[3.1.1]-庚烷/β-蒎烯β-月桂烯八甲基环四硅氧烷（+）-3-癸烯（+）-4-癸烯伞花烃D-柠檬烯1,8-环氧对孟烷β-罗勒烯γ-萜品烯1-甲基-4-（1-甲基亚乙基）环己烯十甲基环五硅氧烷对甲氧基苯丙烯十二甲基环六硅氧烷（3R-反式）-4-乙烯基-4-甲基-3-（1-甲基乙烯基）-1-（1-甲基乙基）-环己烯石竹烯葎草烯Alpha-荜澄茄油烯3-甲基-1-丁醇1-辛烯-3-醇/蘑菇醇3-辛醇1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）环己醇芳樟醇苯乙醇4-（1-甲基乙基）环己醇4-甲基-1-（1-甲基乙基）-3-环己烯-1-醇/4-萜烯醇α-萜烯醇1.50 1.61 3.01 9.21 9.28 9.91 10.35 10.50 10.74 11.02 11.15 11.23 11.88 12.20 13.18 15.53 16.61 20.34 20.57 22.76 23.62 21.61 0.80 9.50 10.07 12.46 13.59 13.95 14.71 15.97 16.37 100.11 92.06 163.88 136.12 136.12 136.12 296.07 136.12 136.12 134.11 136.12 154.14 136.12 136.12 136.12 370.09 148.09 444.11 204.19 204.19 204.19 204.19 88.09 128.12 130.14 154.14 154.14 122.07 142.14 154.14 154.14 0.36 0.46 0.37 0.65 0.32 1.09 1.26 0.97 1.51 0.66 2.28 3.67 0.65 2.50 0.74 0.23 0.42 0.27 0.35 4.16 0.27 0.28 0.34 1.72 0.27 2.43 18.39 0.57 0.30 8.52 1.49
续表
类别 序号 化合物 保留时间/min 分子质量 相对含量/%酯类乙酸异丁酯3-甲基-1-丁醇乙酸酯亚砷酸三（三甲基硅烷基）酯2-（5-甲基-5-乙烯基四氢呋喃-2-基）丙-2-基碳酸乙酯2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯α,α-4-三甲基-3-环己烯-1-甲醇乙酸酯顺-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇乙酸酯5-甲基-2-（1-甲基乙烯基）-4-己烯-1-醇乙酸酯杂环化合物醚类酮类32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 1,5-二甲基-2（1H）-吡啶硫酮川芎嗪茴香脑3-辛酮1.92 5.72 5.82 12.67 18.30 20.87 21.25 21.75 14.22 13.12 19.12 9.76 116.08 130.10 342.05 242.15 273.17 196.15 196.15 196.15 139.05 136.10 148.09 128.12 0.64 1.42 0.25 0.30 29.16 1.60 0.22 0.39 0.21 0.32 1.79 0.65
3 结论
以核桃粕和黄豆为原料，选取枯草芽孢杆菌为发酵菌种制备核桃粕纳豆。采用单因素和Box-Behnken试验得到最佳发酵工艺条件为核桃粕添加量20.5%、接种量1.2%、发酵温度40.9 ℃、发酵时间27 h和后熟时间20 h。在此条件下，发酵所得纳豆呈茶褐色，拉丝长，氨味低，纳豆激酶活力高。通过HS-SPME-GC-MS分析核桃粕纳豆挥发性物质成分，结果表明，核桃粕纳豆主要成分为2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯（31.3%）、芳樟醇（19.5%）、4-萜烯醇（9.1%）、石竹烯（4.4%）等，这些化合物共同赋予核桃粕纳豆独特风味，与传统纳豆风味相比，川芎嗪（0.34%）等具有特殊异臭味的挥发性物质也相对减少。本研究在保留纳豆营养价值的基础上，降低了氨臭味，对核桃粕纳豆的工业化生产可以提供一定的参考依据。
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