鱼茶也叫鱼酸，是海南黎族、苗族的一种传统美食[1]。根据加入干饭或稀饭的不同，分为干法鱼茶和湿法鱼茶。其制作工艺简单，先将活鱼处理干净后，切块并加入食盐腌制，而后加入一定量的米饭，密封发酵而成。发酵结束后，鱼茶酸香可口，鱼肉富有弹性且颜色鲜亮，味道独特，深受人们的喜爱[2-3]。鱼茶的营养价值丰富，是动物性蛋白主要来源，富含不饱和脂肪酸、多种游离氨基酸、人体必需维生素矿物质等，经常食用鱼茶还可起到软化血管、补充不饱和脂肪酸、降低胆固醇等功效[4]。
海南鱼茶属于发酵鱼制品的一种。发酵鱼制品是指以新鲜鱼为主要原料，添加盐、糖、酒糟、米粉、米饭等辅料，在微生物发酵作用下，得到的一种风味独特、香气浓郁，且具有良好贮存性能的鱼制品[5-6]。发酵鱼制品主要分布在热带和亚热带地区，因地区和饮食文化的差异，产品品种丰富。通常分为两类，一类是鱼盐混合发酵产品，比如印度尼西亚的bakasam、日本的shiokara、韩国的changran-jeot、湖北的腊鱼、广东的酶香鱼、泰国的Som-fug等。另外一类是在鱼盐混合物中加入米饭或米粉，如韩国的Gajami sikhae、柬埔寨的phaak，菲律宾的burong isda、缅甸的ngangapi等[7-8]。大部分发酵鱼制品根据当地习俗采用自然发酵方法进行，自然环境中的微生物会根据原辅料特性选择性富集，在一定条件下生长代谢，经过较长时间发酵得到特定风味的发酵鱼制品[9-10]。传统方式生产通常规模小，质量不稳定，在存放过程中产品容易二次污染，从而降低发酵鱼制品的安全性和品质[1-13]。
传统发酵鱼制品发酵过程中，在一定条件下进行发酵且发酵周期较长，如果条件控制不得当，可能会有产生毒素的微生物富集，产品的安全性会受到影响，研究者对于传统发酵制品的研究往往集中在温度、加盐量、发酵时间等工艺条件的控制，或者研究发酵过程中产品的微生物变化、品质等[15-17]。也有很多研究者采用加入纯种微生物发酵来改善传统发酵方式的不足，但是由于传统发酵过程中，多种微生物参与代谢，产品的风味较好，加入纯种发酵后的产品风味往往较差[18-20]。研究主要利用微生物发酵技术对传统发酵鱼制品进行广泛研究，ASIEDU M等[21]研究发酵鱼制品Enam Ne-Setaakye，对比了自然发酵和纯种发酵后的产品的化学成分和微生物更替变化进行了深入分析；吕英涛等[22]研究了3种工艺发酵的鱼酱在发酵过程中的生理生化变化，为后续提高产品品质奠定了基础。
海南鱼茶是黎族苗族等少数民族特色发酵鱼制品，目前主要采用传统发酵方式进行，产品质量不稳定。研究主要集中在鱼茶发酵过程中的微生物组成、变化等方面。本研究以草鱼为主要原料，在传统发酵基础上对发酵工艺条件进行系统优化，采用单因素及响应面试验得到海南鱼茶最佳的发酵工艺参数，为海南鱼茶大规模生产提供理论依据和技术指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
草鱼、大米、食盐：购于三亚市荔枝沟市场；氢氧化钠、酚酞等（均为分析纯）：焦作市维联精细化工有限公司。
1.2 仪器与设备
SHP-250生化培养箱：上海培因实验仪器有限公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱：济南童鑫生物科技有限公司；ME104E电子天平：瑞士梅特勒-托利多仪器（中国）有限公司；TMS-PRO质构仪：北京盈盛恒泰科技有限责任公司。
1.3 方法
1.3.1 海南鱼茶品质的感官评价
海南鱼茶感官评价标准如表1所示，参考GB 2726—2016《食品安全国家标准熟肉制品》并加以修改[23]。选取15名具有食品感官评价经验的食品科学专业师生，选取适量样品，按照评价标准考查产品色泽、气味、滋味、质地，得到感官评分，满分100分。
表1 鱼茶感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of Yucha
项目 感官特征描述 评分/分色泽（20分）气味（35分）滋味（35分）鱼肉鲜亮，红肉部分色泽红润红肉部分呈浅红色，稍暗淡色泽暗淡发酵香气浓郁发酵香气一般发酵香气淡酸香可口，无异味酸香味一般酸香味淡，有异味15～20 7～14 0～6 30～35 19～29 0～18 30～35 19～29 0～18
续表
项目 感官特征描述 评分/分质地（10分）肉质紧密肉质较紧密肉质疏松8～10 4～7 1～3
1.3.2 测定方法
总酸的测定：参照GB/T 12456—2021《食品中的总酸测定》中的酸碱滴定法[24]；pH值的测定：参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》[25]。水分含量的测定：采用水分测定仪。
1.3.3 海南鱼茶制备工艺流程及操作要点
操作要点：
预处理：新鲜草鱼去鳞、去头、去内脏，清洗后取肉，切成3 cm×3 cm×1 cm小块，淋干到不流出水为准。
腌制：加盐腌制（初始条件中加盐量为鱼肉的9%），腌制温度和时间分别为20 ℃，60 min。
大米淘洗、蒸饭：选取优质大米淘洗3遍后，隔水蒸15 min，大米通过隔水蒸到米饭熟而不烂为准，冷却至室温。
保温发酵：将腌制好的鱼块和米饭按一定比例装入坛中保温发酵一定时间，即得鱼茶成品。
1.3.4 海南鱼茶发酵工艺优化（1）海南鱼茶发酵工艺优化单因素试验
初始条件：食盐添加量为鱼肉质量的9%；腌制温度为20 ℃；腌制时间选取60 min；米饭添加量为鱼肉质量的50%；发酵温度32 ℃；发酵时间20 d。分别考察食盐添加量（2%、5%、8%、11%、14%）、米饭添加量（30%、35%、40%、45%、50%）、发酵温度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、发酵时间（8 d、13 d、18 d、23 d、26 d）对成品总酸以及感官评分的影响。每组试验进行3次平行，结果以“平均值±标准差”表示。
（2）鱼茶发酵工艺参数优化响应面试验
应用响应面法进一步优化鱼茶的发酵工艺参数，采用Design-Expert 12软件的Box-Behnken试验设计，在单因素试验基础上进一步优化鱼茶发酵工艺参数。以食盐添加量（A）、米饭添加量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为评价因素，以总酸含量（Y）为响应值，进行4因素3水平的试验，-1，0，1分别代表低、中、高3个水平，响应面试验设计因素与水平见表2。
表2 鱼茶发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of Yucha
水平 A 食盐添加量/% B 米饭添加量/% C 发酵温度/℃ D 发酵时间/d-1 01 789 38 40 42 33 35 37 16 18 20
1.3.5 鱼茶成品的质构分析
将发酵后的鱼茶成品切成薄厚均匀的小块，放置质构仪测定其黏附性、弹性、胶黏性、硬度、咀嚼性。每个样品平行测定3次，结果表示为“平均值±标准差”。
1.3.6 数据处理
采用Origin 8.5绘图，使用Design-Expert 12进行响应面试验设计。用Origin 8.5软件进行数据处理，每个试验做3次，所有实验数据结果均以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 海南鱼茶发酵工艺单因素试验
2.1.1 食盐添加量的确定
食盐添加量对海南鱼茶品质的影响见图1。由图1可知，腌制鱼块过程中，随着加盐量的增加，鱼茶经过发酵后品质感官评分呈现先增加后降低的趋势，由于食盐对发酵微生物的抑制作用逐渐增强，发酵能力逐渐降低，总酸呈现逐渐降低的趋势。食盐添加量为2%和5%时，鱼茶成品发酵度较高，色泽光泽度较好，发酵香气浓郁，但是酸味过重，整体香气、滋味不协调，肉质松软。食盐添加量增加到8%时，产品色泽光亮，发酵香气浓郁，且香气和滋味协调性好，口感好，总酸和感官评分分别为4.35 g/L和88分。随着食盐添加量继续增加，产品色泽、香气、滋味不协调，整体品质下降。因此，制作鱼茶的最适食盐添加量为8%。
图1 食盐添加量对海南鱼茶品质的影响
Fig.1 Effect of salt addition on the quality of Hainan Yucha
2.1.2 米饭添加量的确定
在海南鱼茶发酵过程中，添加米饭的目的主要是为微生物发酵提供必要的碳源。米饭添加量对海南鱼茶品质的影响见图2。由图2可知，随着米饭添加量的逐渐增加，鱼茶产酸量和感官评分都呈现先增加后趋于平稳的趋势。米饭添加量从30%增加至35%，鱼茶的产酸量快速增加，说明米饭的添加对于微生物生长及代谢起到重要作用，随着米饭添加量增加到35%后，酸度趋于平稳。发酵后鱼茶的品质也随着米饭量的增加而呈上升的趋势，米饭添加量为40%时，鱼茶感官评分最高，而后略微下降。因此，制作鱼茶的最适米饭添加量为40%。
图2 米饭添加量对海南鱼茶品质的影响
Fig.2 Effect of rice addition on the quality of Hainan Yucha
2.1.3 发酵温度的确定
温度对鱼茶的发酵起到至关重要的作用，考察发酵温度对海南鱼茶品质的影响，结果见图3。由图3可知，随着发酵温度在20～35 ℃范围内的升高，鱼茶的感官评分和总酸都呈现先增加后降低的趋势。可能由于鱼茶发酵是以乳酸菌为主的细菌发酵，35～37 ℃条件适合乳酸菌生长，故此条件下发酵的鱼茶，产品香气浓郁、滋味鲜美，品质达到最优。因此，制作鱼茶的最适发酵温度为35 ℃。
图3 发酵温度对海南鱼茶品质的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of Hainan Yucha
2.1.4 发酵时间的确定
从发酵第8天开始，考察不同发酵时间对鱼茶品质的影响，结果见图4。由图4可知，随着发酵时间的增加，鱼茶的总酸含量逐渐增加，发酵18 d后达到最高值，后续趋于平稳。其原因是参与鱼茶发酵的乳酸菌等微生物经过延滞期后，进入对数生长期，同时产酸量逐渐升高，到达稳定期后产酸量也趋于平稳。同时，鱼茶的感官评分从第8天开始逐渐增加，到第18天时达到最高，超过18 d后产品总体风味不够协调，感官评分略有下降。原因可能是随着产酸逐渐增加，与其他成分共同赋予产品协调的风味。综上所述，鱼茶发酵18 d时，产品品质最优。因此，最佳发酵时间为18 d。
图4 发酵时间对海南鱼茶品质的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of Hainan Yucha
2.2 海南鱼茶发酵工艺条件的响应面优化试验结果
在单因素试验结果的基础上，本研究以食盐添加量（A）、米饭添加量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为考察因素，在单因素考察范围内，总酸和感官评分是呈正比关系的，为提高试验精确度，故以总酸（Y）为响应值，采用Design Expert 12设计响应面试验，试验设计及结果表3，方差分析结果见表4。
表3 鱼茶发酵工艺优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of Yucha
序号 A B C D 总酸/（g·L-1）12345678 91 0-1 1-1-1-1 1 0000 -0 00 0 -1 1 -0 0 0 0 -1-1 1 1 -1-1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 1 1 -11 0000-1 100000000-1 1 -1100 00-1-1 1 1 -1 1 -1-1 1100000 1 1000 0-1 1 -1100000 000-1-1 110 1100000 110 4.68 4.57 5.16 4.43 4.41 4.32 4.77 4.56 4.98 4.26 4.86 4.75 4.38 4.73 4.24 4.66 4.95 4.25 4.74 4.21 4.42 4.82 4.53 4.93 4.83
续表
序号 A B C D 总酸/（g·L-1）26 27 28 29 0000 0000 0000 0000 4.87 4.94 4.88 4.86
表4 回归模型的方差分析
Table 4 Analysis of variance of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方根 F 值 P 值 显著性模式14 ABCDA B***********AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项纯误差总计1.87 0.700 8 0.304 0 0.048 1 0.118 0 0.096 1 0.007 2 0.093 0 0.001 2 0.000 0 0.003 6 0.028 9 0.068 8 0.470 2 0.059 2 0.085 2 0.078 6 0.006 5 1.95 111111111111111 4 21.96 115.21 49.98 7.91 19.40 15.80 1.19 15.29 0.201 4 0.000 0 0.591 8 4.75 11.31 77.30 9.73＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.013 8 0.000 6 0.001 4 0.294 2 0.001 6 0.660 5 1.000 0 0.454 5 0.046 8 0.004 6＜0.000 1 0.007 5*********10 4 28 0.133 6 0.700 8 0.304 0 0.048 1 0.118 0 0.096 1 0.007 2 0.093 0 0.001 2 0.000 0 0.003 6 0.028 9 0.068 8 0.470 2 0.059 2 0.006 1 0.007 9 0.001 6 4.82 0.071 5
采用Design Expert 12设计响应面试验对表3数据进行回归分析，得到多元二次回归方程如下：
从模型的方差分析结果（表4）可以看出，模型的P值＜0.000 1，而失拟项P值是0.071 5，不显著，表明该模型是极显著的，可以有效预测。该模型决定系数R2为0.956 4，表明此模型具有极好的拟合性。
四个因素之间的交互作用的三维响应曲面见图6，结合表4可以看出，二次项A2对结果影响显著（P＜0.05），交互项AB、AD、二次项B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），说明随着米饭添加量（B）的增加，食盐添加量（A）对微生物的抑制作用减弱，即微生物在获得充足的碳源时，能够在一定程度上抵抗食盐的抑制作用。随着发酵时间（D）的增加，食盐添加量（A）对微生物抑制作用呈减弱的趋势。其余交互项之间（AC、BC、BD、CD）交互作用不显著（P＞0.05）。
图6 各因素交互作用对总酸含量影响的响应面和等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factor on total acid content
通过Design-Expert 12软件分析得出，经过响应面试验优化后，得到最佳的工艺参数是：食盐添加量7.1%，米饭添加量41.6%，发酵温度35.5 ℃，发酵时间16.7 d。在此条件下总酸预测值为5.17 g/L。考虑到实际操作条件，将结果进行修正，即食盐添加量7%，米饭添加量42%，发酵温度36 ℃，发酵时间17 d。在此最佳条件下进行3次平行验证试验，测定总酸实际平均值为（5.16±0.03）g/L。测定结果与预测结果相接近，感官评分为（90±1.24）分，进一步证明了模型的可靠性。
2.3 海南鱼茶发酵前后理化指标和质构分析
海南鱼茶发酵前后理化指标和质构的变化见表5。由表5可知，海南鱼茶经过保温发酵后，由于微生物代谢产酸，使得pH值从6.75降低到4.57，不仅起到抑制腐败菌的作用，为鱼茶风味形成奠定基础。经过发酵后，鱼茶的含水量有所降低，从43.65%下降至40.12%，可能由于微生物的作用，使得蛋白质等大分子物质降解，从而鱼肉的持水性降低。因为大分子蛋白质和脂肪在微生物的作用下，部分被分解为游离氨基酸、脂肪酸等小分子物质，鱼茶发酵后的硬度、弹性、胶黏性和咀嚼性均有所下降，分别从23.67 N下降至22.83 N，从1.38 mm下降至1.32 mm，从5.32 N降至5.18 N，从6.87 mJ降至6.31 mJ。随着发酵的进行，pH值呈下降趋势，水溶性蛋白质含量逐渐降低，不溶性蛋白质比例增加，进而形成凝胶网状结构，使得鱼茶发酵后的黏附性从0.48 mJ上升至0.73 mJ。
表5 海南鱼茶发酵前后理化指标和质构的变化
Table 5 Changes of physicochemical indexes and texture before and after fermentation of Hainan Yucha
注：“*”表示差异显著（P＜0.05）。
样品 pH值 水分含量/% 硬度/N 弹性/mm 黏附性/mJ 胶黏性/N 咀嚼性/mJ鱼茶发酵前鱼茶发酵后6.75±0.02 4.57±0.03*43.65±0.13 40.12±0.15*23.67±0.14 22.83±0.18*1.38±0.01 1.32±0.02*0.48±0.02 0.73±0.01*5.32±0.04 5.18±0.02*6.87±0.03 6.31±0.04*
3 结论
通过单因素试验和响应面试验优化得到海南鱼茶的最佳发酵工艺参数为：食盐添加量7%，米饭添加量42%，发酵温度36 ℃，发酵时间17 d。在此优化条件下，总酸含量为5.16 g/L，感官评分为90分。经过发酵后的海南鱼茶pH为4.57，含水量为40.12%。通过质构分析，鱼茶的硬度、弹性、胶黏性和咀嚼性均下降，黏附性有所增强。此时，海南鱼茶的香气浓郁，鲜香可口，肉质紧密，鱼肉色泽鲜亮。
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