‘123’苹果,又名‘金红’小苹果,水分含量为85%,糖含量为10%~14.2%,苹果酸含量为0.38%~0.60%,此外还有蛋白质、抗坏血酸、尼克酸、胡萝卜素、硫胺素、钙、磷、铁等多种营养成分[1]。果酒由水果发酵而成,保留水果的营养,且酒精含量低,风味各异,成为时尚消费品。酵母菌是发酵果酒的主要微生物,是影响果酒口感和香气的重要因素之一。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酒精发酵能力强,但酿酒过程中原料具有的风土特色香气物质难以被释放,产品的特点不突出[2]。非酿酒酵母通过分泌酶降解糖苷键释放芳香化合物,以及通过自身代谢直接合成或调整风味成分,使得果酒气味芬芳,酒体典型性突出[3-6]。利用酿酒酵母与非酿酒酵母共同发酵来改善果酒风味成为研究热点之一。曾朝珍等[7]研究表明,在异常汉逊酵母与酿酒酵母的协同作用下有效促进了苹果白兰地中酯类、醇类物质的合成,降低了脂肪酸的含量。祝霞等[8]研究发现,戴尔凯氏有孢圆酵母与酿酒酵母混菌发酵,可提高贵人香低醇甜葡萄酒中酯类、高级醇以及萜烯类香气物质,赋予了酒样强烈的花香、果香。申静云等[9]利用不同有孢汉逊酵母与酿酒酵母混合发酵威代尔冰葡萄酒,促进了酯类和萜烯类物质的合成,总量分别增加88.61%和21.40%,显著增强花果香和黄油味。LÓPEZ S等[10]筛选出汉逊酵母应用于Muscat葡萄酒的增香酿造,并验证了所产糖苷酶活力及其水解特性。陶永胜等[11]评价了野生胶红酵母的糖苷酶对媚丽新酒中香气糖苷的水解潜力。张曼等[12]使用美极梅奇酵母与商业酿酒酵母间隔48 h顺序接种发酵脆李果酒,结果表明在香气方面,辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、芳樟醇显著提高。因此,酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵成为酿酒行业新的发展趋势。筛选酿造‘123’苹果酒适合非酿酒酵母,优化混菌发酵接种方案,对开发‘123’苹果酒具有积极意义。
本研究利用优选的卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)两株非酿酒酵母分别与一株商业酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)混合发酵‘123’苹果酒,以单菌种发酵为对照,分析不同酒样理化指标、香气成分以及感官香气特征的差异性,确定‘123’苹果酒混合发酵方案,以期为生产风味独特的‘123’苹果酒提供理论依据。
‘123’苹果:2021年9月23日取自内蒙古自治区包头市土右旗,还原糖含量为142 g/L,总酸含量为6.37 g/L。
卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum):均由内蒙古特色果酒系列产品产学研科技创新平台实验室分离筛选并保存;商业酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DS:法国诺盟公司。
酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(yeast extract peptone dextrosemedium,YPD)培养基(生化试剂):青岛海博生物技术有限公司;甲醇、2-辛醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、异丁醇、1-己醇、异戊醇、异戊酸、辛酸、癸酸、苯甲醇、苯乙醇、苯甲醛等香气物质标准品(均为色谱纯):美国Sigma公司。
QP2020 SYSTEM气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)仪:日本岛津公司;BS-1E振荡培养箱:上海高致精密仪器有限公司;SA2202S-CW电子天平:德国赛多利斯公司;2000JP果汁离心机:南通金橙机械有限公司。
1.3.1 酵母培养与计数
将保藏的非酿酒酵母在YPD固体培养基上划线培养,28 ℃条件下培养48 h后重复活化一次。挑取菌落特征明显的菌株接种于200 mL YPD液体培养基中,28 ℃、180 r/min条件下培养24 h,取培养液用无菌生理盐水稀释计数并配制成浓度为1×106 CFU/mL的酵母种子液,将酵母种子液接种于果汁中进行发酵。酿酒酵母DS按照产品说明进行活化后用无菌生理盐水稀释计数配制酵母种子液。发酵过程中每48 h取样,根据酿酒酵母和非酿酒酵母在WL培养基上的菌落形态进行分类计数。
1.3.2‘123’苹果酒酿造工艺流程与操作要点
操作要点:
分选清洗:选择成熟度较好,无腐烂发霉的‘123’苹果,清洗控干水分。
榨汁、糖度调整:‘123’苹果榨汁后添加白砂糖,调整糖度为200 g/L。
灭菌装罐:将苹果汁70 ℃灭菌15 min,分装于用亚硫酸灭菌处理的20 L玻璃发酵罐中,每罐装10 L苹果汁。
接种酵母:将非酿酒酵母和酿酒酵母单菌种和混合培养(混菌接种比例为1∶1)按照总接种量为6%接种到10 L果汁中进行发酵。
酒精发酵:控制发酵温度不超过30 ℃,当糖含量<4 g/L或连续48 h不再变化时视为发酵结束。
倒罐陈酿:发酵结束后将上清酒液倒入空罐中,加入50 mg/L SO2,自然陈酿2个月,取样用于后续分析。每个处理重复3次。
1.3.3 发酵组设计
对照组:设置三个对照组,分别为接种单一酿酒酵母(CK),单一葡萄汁有孢汉逊酵母(HU),单一卡利比克迈耶氏酵母(MC)。
混合发酵组:葡萄汁有孢汉逊酵母与酿酒酵母同时接种发酵(HS1);先接种葡萄汁有孢汉逊酵母,48 h后接种酿酒酵母(HS2);先接种酿酒酵母,48 h后接种葡萄汁有孢汉逊酵母(HS3)。卡利比克迈耶氏酵母与酿酒酵母同时接种发酵(MS1);先接种卡利比克迈耶氏酵母,48 h后接种酿酒酵母(MS2);先接种酿酒酵母,48 h后接种卡利比克迈耶氏酵母(MS3)。
1.3.4 理化指标检测
参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》,测定还原糖、总酸、挥发酸、酒精度[13]。
1.3.5 挥发性香气成分测定
‘123’苹果酒挥发性香气成分检测方法参考尹荐等[14]的方法,采用顶空固相微萃取(head space solid phase microextraction,HS-SPME)-气相色谱-质谱联用技术检测。
样品预处理:取8 mL酒样,2.0 g NaCl,2-辛醇内标(400 μg/L)加入顶空瓶中,在40 ℃水浴中平衡15 min,在40 ℃条件下搅拌吸附萃取30 min,取出插入GC进样口,230 ℃解吸5 min取出。
GC-MS分析条件:进样口温度230 ℃,载气为高纯氦气(99.999%),流速1.5 mL/min,不分流进样。色谱柱为DB-WAXETR(60 m×0.25 mm×0.25 μm),升温程序40 ℃保持5 min,以2 ℃/min的升温速度上升到130 ℃,再以5 ℃/min的速度上升到220 ℃,保持10 min。离子源温度200 ℃,电子能量70 eV,扫描范围35~350 amu,扫描频率0.2 s/次。
定性定量分析:提取挥发性成分质谱图,并根据标准品的保留时间,通过美国国家标准与技术研究院(national institute of standards and technology,NIST)17谱库查询,计算各挥发性成分的保留指数进行定性分析。采用内标法定量。
1.3.6 香气评价
采用定量描述分析法对‘苹果酒的香气进行评价。感官品评小组有8位经过培训的老师和学生组成(4男4女),并从Davis香气轮盘中选取合适的词汇进行香气特征描述确定的感官描述(果香、花香、乙醇味、脂肪味、酸味),按照0~5分对特征香气强烈程度进行评分,无香气特征为0分,香气特征非常弱为1分,香气特征弱为2分,香气特征中等为3分,香气特征强为4分,香气特征非常强为5分。
1.3.7 数据统计分析
运用SPSS 23.0对不同酵母发酵‘123’苹果酒各理化指标和香气物质进行单因素方差分析(one-way analysis of variance,One-way ANOVA)和多重比较分析(multiple com parisonanalysis,MCA),并对香气物质进行主成分分析(principalcomponent analysis,PCA),应用Origin2018作图。
不同接种处理对苹果酒发酵过程中酵母菌生长的影响见图1。
图1 ‘123’苹果酒发酵过程中酵母菌生长变化情况
Fig.1 Growth status of yeast during '123' cider fermentation
由图1a可知,单菌发酵S.cerevisiae在第6天数量达到最大,为7.10×108 CFU/mL,第16天发酵结束仍在106数量级。M. caribbica与H. uvarum单菌发酵均在第6天数量达到最大值,在第20天发酵终止,M. caribbica数量为1.43×103 CFU/mL,H.uvarum数量为2.22×105 CFU/mL。冯文倩等[15]的研究表明,H.uvarum在模拟葡萄汁中21 d完成酒精发酵,与本试验有一致结果。可见,由于非酿酒酵母酒精发酵能力弱,延长了发酵时间,随着营养物质的消耗,以及酒精度的增加,使非酿酒酵母在发酵后期数量下降明显。
由图1b、1c可知,混合发酵处理中,同时接种混合菌种时(HS1和MS1),在发酵第12天后和第10天后检测不到H.uvarum与M.caribbica活菌;在HS2、HS3、MS2、MS3顺序接种处理组中两种非酿酒酵母可以贯穿整个发酵周期,且整个发酵过程中非酿酒酵母数量稳定在(106~107)数量级,但在发酵后期酿酒酵母数量要高于非酿酒酵母数量。尤雅等[16]研究也有相似结果。同时接种相同数量的酿酒酵母和非酿酒酵母,最能反映酵母之间的竞争能力,试验结果表明H.uvarum与S.cerevisiae的竞争力优于M.caribbica。混合发酵中酿酒酵母的代谢产物乙醇、中链脂肪酸、杀伤毒素以及多肽,两种酵母的细胞接触,基质中的营养竞争等都是影响非酿酒酵母生长的因素[17-18]。
由上述结果可知,在‘123’苹果酒酿造过程中,酿酒酵母与非酿酒酵母存在竞争,同时接种方案中非酿酒酵母生长受到明显抑制,而顺序接种中非酿酒酵母在整个发酵进程中能保持一定数量。
发酵结束后‘123’苹果酒基本理化指标见表1。由表1可知,S.cerevisiae参与发酵的处理组还原糖含量均低于4 g/L,酒精发酵完全,酒精度为9.28%vol~10.88%vol。H.uvarum与M.caribbica单菌种发酵的处理组酒精发酵缓慢,发酵结束后酒精度分别较CK低23%和28%,并且还原糖含量较高;混菌发酵处理组酒精度显著低于CK组(P<0.05),有研究表明大多数非酿酒酵母酒精发酵能力较低,H.uvarum约消耗19 g/L糖产生1%vol的酒精[19]。非酿酒酵母的氧化代谢消耗葡萄糖而不形成乙醇,通过其他代谢途径转换为甘油等化合物[20]。
表1 ‘123’苹果酒的基本理化指标
Table 1 Physiochemical indexes of '123' cider
注:同列不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。
处理组 酒精度/%vol 还原糖/(g·L-1) 总酸/(g·L-1) 挥发酸/(g·L-1)CK HU MC HS1 HS2 HS3 MS1 MS2 MS3 0.36±0.02d 0.49±0.02a 0.41±0.02bc 0.43±0.01b 0.47±0.02a 0.38±0.01cd 0.41±0.01bc 0.43±0.03b 0.39±0.01c 10.88±0.07a 8.43±0.12f 7.78±0.08g 10.06±0.05c 9.46±0.04d 10.39±0.04b 10.05±0.07c 9.28±0.06e 10.27±0.09b 3.17±0.08c 10.55±2.61b 13.47±1.35a 3.37±0.18c 3.48±0.07c 3.65±0.07c 3.53±0.09c 3.62±0.24c 3.79±0.07c 6.99±0.26b 6.89±0.37bc 7.98±0.24a 6.60±0.06bc 5.93±0.28d 6.45±0.29c 6.99±0.16b 7.50±0.18a 6.82±0.60bc
总酸检测结果表明,MC与MS2处理组总酸含量显著高于其他组(P<0.05),可能与M.caribbica代谢产生酸类物质有关。本试验所有处理组的挥发酸含量均符合GB 15037—2006《葡萄酒》规定(<1.2 g/L)[21],非酿酒酵母发酵酒样挥发酸含量均高于对照组,其中HU组最高,较CK增加了36%,提前接种非酿酒酵母处理组HS2与MS2挥发酸含量也显著高于CK。夏鸿川等[22]同样发现提前接种H.uvarum会增加酒样中挥发酸含量。
混菌发酵过程中,由酿酒酵母主导酒精发酵,同时接种和先接种酿酒酵母的发酵酒样均获得较高的酒精度;M.caribbica使果酒中总酸含量增加;两种非酿酒酵母发酵增加了果酒中挥发酸含量。
2.3‘123’苹果酒香气成分分析
发酵结束的各酒样中香气成分测定结果见表2。由表2可知,共检出挥发性香气成分56种,包括品种香气成分11种、发酵香气成分45种,有高级醇11种、酯类化合物20种、脂肪酸类化合物7种、其他香气化合物7种。其中,香气化合物浓度与嗅觉阈值的比值,即香气活力值(odor active value OAV)>1的有10种,OAV为0.1~1.0的香气化合物有11种。HS2酒样中香气物质总含量最高,为9 302.20 μg/L;单菌发酵处理组也有较高的香气物质,HU酒样香气物质总含量(9 259.37 μg/L)显著高于CK(P<0.05),MC酒样香气物质总含量与CK没有显著差异(P>0.05);在混菌发酵中,先接种非酿酒酵母的酒样中香气物质总含量显著高于同时接种和后接种非酿酒酵母的处理组(P<0.05)。
表2 ‘123’苹果酒香气成分测定结果
Table 2 Determination results of volatile aroma components of '123' cider
-1)香气成分含量/(μg·L香气描述OAV阈值MS3 MS2 MS1 HS3 HS2 HS1 MC HU CK花香、水果香、青草香<0.1 8000 512.41±21.24d 354.56±12.68d 598.40±17.27c 531.86±10.52d 767.33±24.94a 683.79±11.80b 669.79±22.27b 757.56±29.90a 593.25±12.35c玫瑰、青柠檬花香、麝香、薰衣草香0.1~1 0.1~1 100 2 5 0±0d 12.39±0.34c 12.59±0.18c 0±0d 0±0d 13.04±0.25b 0±0d 13.12±0.64b 18.75±1.14a 0±0d 19.22±0.37a 0±0d 15.83±1.17b 0±0d 0±0d 0±0d 0±0d 14.35±0.41a蜂蜜、玫瑰、丁香花14000<0.1 305.97±30.69b 195.01±13.09d 235.51±12.54c 342.68±14.07a 305.00±30.32b 288.48±5.17b 278.93±21.66b 275.91±5.78b 311.15±3.67ab丁子花香、木香、辛香酚——— ———酒精味,苦味,指甲油0.1~1>1<0.1 500 200—— ————30000 101.53±19.28e 134.14±15.95de 1128.36±89.81f 1748.20±158.17d 1096.63±130.67de 221.57±18.43d 272.92±25.94c 1331.03±73.41e 1524.41±228.05g 1167.01±202.06cd 103.60±9.49c 118.21±17.07de 1129.96±58.56f 1501.06±80.83g 888.95±26.28f 90.07±10.90e 148.05±13.63d 1191.80±53.01f 1690.74±67.89e 1114.15±39.08de 325.42±17.12ab 363.09±45.98a 1902.82±130.23a 1851.28±93.13c 1347.02±71.52bc 309.18±23.57bc 346.14±20.62ab 1755.91±72.55c 1587.35±71.83f 974.27±30.81ef 292.63±3.56c 299.18±56.31bc 1664.44±112.03d 1753.31±42.04d 1401.45±24.46ab 345.80±12.48a 353.40±9.19ab 1835.21±61.5b 2169.48±86.75a 1581.17±44.99a 98.08±1.90e 86.73±1.54e 1164.44±21.82f 2107.96±110.06b 1501.31±84.66ab柠檬,橘子柑橘、玫瑰0.1~1>1 200 4 0 25.13±1.74d 50.95±3.98e 10.68±1.41f 37.03±1.63f 27.32±1.46c 55.05±0.70de 36.33±4.19b 58.09±7.56cd 15.48±0.13e 64.13±2.24bc 31.10±2.58c 57.73±0.76cd 19.04±0.46e 64.04±3.78bc 38.54±1.36b 68.11±0.62ab 18.12±1.14e 72.62±1.34a 717.58±31.56g 1276.06±73.47c 1128.30±79.05d 957.01±57.29e 1436.21±29.74b 991.90±58.73e 1160.93±93.32d 1533.07±95.25a 891.86±51.44f水果香、甜味、指甲油0.1~1 7500 473.18±14.79e 568.98±30.10d 393.79±9.53f 553.36±33.13d 899.16±12.82b 728.54±29.71c 780.46±56.51c 1031.39±63.18a 416.58±28.07ef水果香,梨,樱桃0.1~1 1500 46.16±2.57e 163.53±15.91c 262.47±34.01ab 73.91±5.95de 284.58±10.45a 82.59±6.62d 166.29±11.78c 165.70±10.49c 239.76±13.35b果香,鲜香蕉花香,水果香,木香>1 0.1~1 30 2 50 167.11±10.90d 23.83±3.10e 426.24±19.10b 63.09±3.74a 437.84±33.91a 29.86±1.38de 248.61±16.32b 66.07±1.03a 207.21±3.63c 34.99±2.55bcd 123.89±12.20e 41.17±9.51b 170.00±22.19d 32.18±2.31cd 278.99±18.56b 39.74±1.67bc 194.86±7.55cd 30.70±1.69de———草莓、苹果、香蕉青苹果、果香、草莓菠萝、果香菠萝、梨、花香水果香、脂肪、腊味>1>1<0.1>1>1—— 2014 2 20 5 2 00—1481.02±96.65f 19.46±0.84c 656.60±22.51cd 8.54±0.29a 437.19±37.19f 245.95±27.05de 1386.14±86.97g 12.01±0.30d 593.52±41.04d 1.95±0.10d 549.35±28.45e 173.52±13.82f 1255.30±107.74h 47.13±3.43b 434.97±40.87f 2.28±0.18d 475.34±37.84f 187.32±20.17f 1971.42±91.21d 17.04±1.09cd 513.51±53.71e 5.44±0.14b 887.69±17.12abc 433.92±11.69b 2090.23±97.27c 50.67±5.14ab 609.87±2.59d 5.37±0.34b 706.84±43.07d 278.62±25.97d 1849.54±98.10e 17.82±0.92c 508.13±42.66ef 5.02±0.51b 842.97±14.96bc 363.95±31.15c 2475.43±127.06b 51.17±3.15ab 728.12±49.49bc 3.78±0.17c 921.04±42.31a 513.10±10.02a 2082.54±102.38c 52.24±2.18ab 757.24±27.00ab 9.07±0.14a 826.41±23.08c 201.80±32.71ef 2641.03±96.94a 54.87±2.81a 821.33±24.51a 5.51±0.26b 902.23±25.62ab 446.93±13.30b 0.1~1甜味,花香,水果香,奶油1500 32.94±2.56c 21.34±2.20cd 25.40±2.13c 32.39±1.60c 211.74±7.26ab 34.09±2.00c 192.81±19.91b 0±0d 217.19±25.34a——水果香—0.1~1——125—70.21±6.71a 11.63±1.46cd 39.44±2.21e 0±0e 24.46±1.04f 9.43±0.31d 67.53±4.07a 14.59±0.55c 56.45±4.92bc 24.45±3.86a 60.11±6.19b 0±0e 53.07±2.25c 23.04±1.14ab 47.04±2.22d 20.06±1.24b 56.93±3.43bc 24.53±1.07a———————黄油味、杏仁味>1>1————— 1 5 00 874.39±32.96g 0±0d 3.93±0.22b 765.43±27.54d 1721.35±68.41a 1591.67±61.89a 0±0e 99.84±3.77f 1432.48±139.11c 1071.76±125.18c 2.62±0.15d 263.92±6.11e 953.62±70.66f 0±0d 0±0e 867.53±60.87c 1533.75±111.85b 1197.25±99.07b 0±0e 247.09±8.52e 1152.87±68.96e 0±0d 3.46±0.18c 938.81±48.40ab 1169.32±29.55de 0±0d 2.42±0.21d 930.62±14.10b 1211.24±45.12d 0±0d 4.39±0.21a 866.40±10.12c 1214.13±32.46d 0±0d 3.64±0.50bc 996.52±24.91a焦糖味、牛奶味、脂肪0.1~1 1000 25.77±1.41d 0±0e 29.04±4.10d 24.98±1.69d 29.85±1.45d 176.90±18.66b 236.28±15.24a 107.03±13.07c 194.20±5.97b———植物香气、杏仁味青草、香草味玫瑰花香、李子香大茴香香气清香、花香、香脂香<0.1>1 0.1~1——350 5 15——————377.55±34.88d 18.96±0.55d 42.99±3.67c 11.13±1.00c 288.89±29.12c 7.87±0.29d 441.88±32.72bc 21.71±0.81c 73.99±2.01b 14.07±0.25b 305.04±29.24c 7.99±0.16d 453.62±41.21bc 27.54±1.06b 77.76±2.76b 0±0g 311.78±35.51c 8.00±0.16d 410.69±35.79cd 33.30±2.47a 37.46±1.26d 4.96±0.25e 299.09±31.17c 9.47±0.14c 431.46±15.07c 0±0e 96.91±2.62a 3.61±0.09f 306.27±10.76c 12.07±0.80b 484.32±21.49ab 0±0e 0±0e 6.13±0.10d 462.29±20.96b 6.47±0.27e 450.59±43.41bc 0±0e 0±0e 5.54±0.20de 418.39±42.52b 6.86±0.34e 380.79±27.85d 0±0e 0±0e 3.97±0.15f 341.55±26.40c 8.22±0.23d 511.35±32.58a 0±0e 0±0e 4.89±0.31e 476.66±30.51b 5.49±0.41f 5268.95±360.93f 6389.28±491.83c 5795.22±448.98e 6051.01±326.91d 7399.38±351.98a 6126.09±325.30d 7062.65±337.63b 7424.16±359.57a 7423.26±326.91a 6397.31±450.74f 7720.31±565.24c 6925.18±507.54e 7242.81±379.92d 9302.20±482.21a 7882.00±397.85c 8727.09±449.66b 9259.37±421.07a 8587.70±348.73b 0.05)。著(P<显异差间理处示表母字同不化合物品种香气成分正己醇香茅醇芳樟醇苯乙醇丁香酚2,4-二叔丁基苯酚小计发酵香气成分高级醇异戊醇庚醇正辛醇乙酸酯乙酸乙酯乙酸己酯乙酸异戊酯乙酸苯乙酯乙醇酯丁酸乙酯己酸乙酯庚酸乙酯辛酸乙酯癸酸乙酯月桂酸乙酯其他酯类辛酸异戊酯脂肪酸3-甲基-4-氧基戊酸庚酸辛酸癸酸其他化合物苯甲醛己醛壬醛甲基胡椒酚α-金合欢烯小计总和行同中:表注
2.3.1 品种香气成分分析
样品中品种香气成分包括1种C6化合物(正己醇)、2种萜烯醇(香茅醇、芳樟醇)、1种苯衍生物(苯乙醇)、2种挥发性酚(丁香酚、2,4-二叔丁基苯酚)。9个酒样中有6个酒样(HU、HS1、HS2、HS3、MC、MS2)的品种香气物质含量高于对照组,其中酒样HS2最高为1 902.80 μg/L,较CK增加了63.4%,其次是HU为1 835.21 μg/L,表明H.uvarum发酵有利于品种香气物质的生成。M.caribbica单菌种发酵酒样中品种香气成分表现较好,但混菌发酵酒样中品种香气成分不同程度有所降低,可能由于两种菌互作影响品种香气物质的代谢。
2.3.2 发酵香气成分分析
样品的发酵香气中有高级醇3种,酯类11种,脂肪酸4种,其他化合物5种,其中正辛醇、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、庚酸、辛酸、己醛9种化合物的OAV>1。
高级醇类物质是糖类或氨基酸代谢的副产物,含量<300 mg/L时能衬托酯香,促进香气的协调性和复杂性[23]。试验酒样的高级醇含量为1 501.06~2 169.48 μg/L,均<300 mg/L,高级醇含量最高的为HU、CK、HS2,分别是2 169.48 μg/L、2 107.96 μg/L、1 851.28 μg/L,均显著高于其他处理组(P<0.05)。酒样中含量最高的为异戊醇,含量为888.95~1 581.17 μg/L,异戊醇具有苹果白兰地香气,是杂醇油的主要成分[24],含量高会引起头晕,本研究中混菌发酵酒样中异戊醇含量均低于单菌种发酵酒样。各酒样中正辛醇的OAV>1,赋予了酒样柑橘和玫瑰的香气。庚醇的OAV为0.1~1.0,增加了酒样柠檬和橘子的香气。
酯类化合物是酒精发酵的副产物之一,能赋予果酒花香和果香气味[25]。酯类化合物中以乙酸酯和乙醇酯为主,酒样HU中乙酸酯含量最高为1 533.07 μg/L,可能是由于H.uvarum酯酶活性较高。除MS3乙酸酯含量低于对照组,其余酒样中乙酸酯含量均显著高于对照组(P<0.05),说明两种非酿酒酵母在苹果酒发酵中产乙酸酯的能力较强。乙酸异戊酯嗅觉阈值较低,且在所有酒样中OAV>1,能赋予果酒果香和鲜香蕉的气味。酒样中检测到的乙醇酯中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯OAV>1,其中辛酸乙酯具有最高的OAV(87.44~180.45),为果酒带来草莓、菠萝和梨的香气。CK中乙醇酯含量显著高于其他组(P<0.05),这与LEE P等[26]研究结果类似,酿酒酵母菌株发酵能代谢较高的乙醇酯,而非酿酒菌株能生产较高的乙酸酯。
脂肪酸含量接近气味阈值时,可赋予果酒奶酪、黄油等风味,使酒体香气平衡[27]。MS2与HS2酒样中脂肪酸含量分别为1 721.35 μg/L和1 533.75 μg/L,显著高于其他组(P<0.05),说明先接种非酿酒酵母混菌发酵有利于果酒脂肪酸含量的提高。所有处理酒样中辛酸含量最高,且CK、HU、HS1、HS3、MC和MS3酒样中辛酸OAV>1,使果酒具有黄油的香气。
在酒样中还检测到了3种醛类化合物、1种酚类化合物和1种烯类化合物,CK酒样中这些物质总含量显著高于其他组。每个酒样中均检测到了甲基胡椒酚、α-金合欢烯,其中甲基胡椒酚的含量最高,有大茴香的气味,α-金合欢烯则有花香和脂香。
混菌发酵中,先接种非酿酒酵母有利于提高香气物质总量及脂肪酸含量;H.uvarum发酵可增加苹果酒中品种香气含量;两种非酿酒酵母均表现出有较强的乙酸酯生产能力,而酿酒酵母则是乙醇酯生产能力强。
2.3.3 特征香气成分主成分分析
一般认为,OAV>0.1的香气物质与相似的香气物质叠加能够一定程度增加酒体的香气及协调性,OAV>1的香气物质可能直接影响酒体香气,被认为是特征香气物质[28-29]。为进一步分析各处理酒样之间挥发性香气成分的差异,对不同处理酒样及其OAV>0.1的21种挥发性香气物质进行主成分分析(PCA),结果见图2。
图2 ‘123’苹果酒中特征香气化合物主成分分析
Fig.2 Principal component analysis for characteristic aroma compounds in '123' cider
由图2可知,主成分PC1方差贡献率占33.2%,PC2方差贡献率占21.4%,前两个主成分累计方差贡献率为54.6%。9种酒样在置信区间被很好地区分开,对照组CK与混菌发酵组均不在同一象限内,说明混菌发酵对‘123’苹果酒风味有显著影响。HU、MC和HS1在同一象限,且距离较近,与香气物质乙酸己酯、月桂酸乙酯和辛酸乙酯相关较大;虽然MS2和HS2在同一象限,但距离较远,HS2与香茅醇、丁香酚、乙酸乙酯和2,4-二叔丁基苯酚相关性较大;MS2与己醛、壬醛和乙酸苯乙酯相关性较大。MS1、MS3和HS3与乙酸异戊酯相关性较大。而与CK相关性较大的香气物质是庚酸、辛酸和庚醇。
不同接种方式发酵的‘123’苹果酒感官香气评价雷达图见图3。由图3可知,所有非酿酒酵母发酵的处理组乙醇味均低于CK,与理化指标检测结果一致。CK的脂肪味也最强烈,与主成分分析中CK酒样脂肪酸相关性较大的结果一致。各组酸味比较接近。如图3a所示,果香、花香和酸味较突出的是H.uvarum单菌发酵的酒样,其次是同时接种和先接种H.uvarum酒样,后接种H.uvarum会明显影响果酒的香气。HU K等[30]的研究也表明,H.uvarum在混菌发酵中能够增加葡萄酒的花香和水果香气。如图3b所示,M. caribbica单菌种发酵酒样有较好的果香与花香,但与S.cerevisiae混菌发酵明显降低了酒样的花香与果香,可能与S.cerevisiae影响了M.caribbica的生长代谢有关。2种非酿酒酵母可以提高‘123’苹果酒的感官香气品质。
图3 ‘123’苹果酒感官香气评价雷达图
Fig.3 Sensory evaluation radar map of '123' cider
本实验主要研究H. uvarum与M. caribbica分别与S.cerevisiae混合发酵对‘123’苹果酒香气成分的影响。总体来看,在发酵过程中,不同的顺序接种对非酿酒酵母的生长有影响;混菌发酵降低了‘123’苹果酒中乙醇含量,M.caribbica酵母使酒样总酸含量增加,H.uvarum增加酒样的挥发酸含量。非酿酒酵母有利于酒中品种香气化合物和乙酸酯的生成,其中,先接种H.uvarum再接种S.cerevisiae组香气物质总量最高,且显著高于CK,并以2,4-二叔丁基苯酚、正辛醇、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等物质为特征香气物质;先接种非酿酒酵母的混菌发酵酒样中香气物质总量显著高于同时接种与后接种非酿酒酵母处理组。H.uvarum参与的混菌发酵的酒样中品种香气物质含量显著高于CK,而CK则有较高的发酵香气物质含量。M.caribbica单菌种发酵酒样中香气物质含量表现好于混菌发酵。
混菌发酵可以改变‘123’苹果酒的香气特征,先接种H.uvarum再接种S.cerevisiae(HS2)混菌发酵在完成酒精发酵的同时,最大程度的发挥了非酿酒酵母的产香特性,挥发性香气物质总量最高,且品种香气物质较CK增加了63.4%,果香和花香突出,此接种方案在‘123’苹果酒增香酿造方面有应用潜力。后续将通过转录组及代谢组学深入研究H.uvarum与S.cerevisiae相互作用机理,进一步确定发酵调控参数,以期为‘123’苹果酒酿造提供理论依据。
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Effects of mixed-strains fermentation on the aroma compounds of'123'cider