旅行者腹泻（traveler's diarrhea，TD）指在旅行期间或旅行后，每天有3次及以上未成形便，同时伴随腹痛、恶心、呕吐、发热或血便、粘液便的急性肠道传染病，全球TD发病率为30%～50%。调查发现，80%～90%的TD由细菌感染，其中40%～70%病原菌为产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）[1-2]。青壮年由于接触范围广为旅行者腹泻易感人群，另外老人、小孩、孕妇等免疫力低下者感染后症状较严重，可能引起心血管疾病、低血糖或脱水等症状[3]。ETEC感染后在黏附素作用下黏附、定殖于肠道上皮细胞，通过释放肠毒素引起细胞过度凋亡，破坏上皮细胞正常生理功能，导致肠道通透性和渗透性增加，造成肠道屏障受损，从而引起炎症和腹泻。同时，肠道屏障的损伤更有利于ETEC的定殖和肠毒素分泌入胞内，使其致病性增强，加剧肠道炎症与腹泻症状[4-5]。
益生菌是指足量摄入时能够对宿主产生健康益处的活性微生物，能够定植于肠道发挥多种益生功能[6-7]。其中，乳酸菌的特定菌株可以通过调节肠道微生态平衡、增强肠道屏障、改善机体免疫功能等多种机制改善肠道健康，是公认的有益菌[8-9]。大量研究表明，乳酸菌对腹泻具有缓解作用。臧凯丽等[10]研究发现，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）能够改善便秘和腹泻人群的肠道菌群结构及相关症状。ŁUKASIK J等[11-12]研究发现，植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）、副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）、乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）等乳酸菌能够降低儿童抗生素腹泻发病风险，并恢复营养不良婴儿的肠道菌群结构减少腹泻的发生。另外，OKSANEN P等[13-14]研究发现，服用乳酸杆菌和鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）能够显著降低TD发病率。但不同种属乳酸菌对旅行者腹泻的缓解效果具有差异性，其具体调控机制尚不明确。
因此，本研究采用肠道体外发酵模拟系统，通过考察不同种属乳酸菌对ETEC抑制效果，调节水通道蛋白-3（aquaporin-3，AQP-3）表达和免疫因子分泌能力，以及拮抗ETEC造成的肠道屏障损伤方面的作用效果，进一步探明不同种属乳酸菌对TD的干预机制及效果差异。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与细胞
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP45、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）La28、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LR519、乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）BAL531、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）S131、S709、S869、产肠毒素大肠杆菌（ETEC）、人体结肠癌细胞系HT-29细胞株：河北一然生物科技股份有限公司。
1.1.2 化学试剂
胎牛血清、胰蛋白酶细胞消化液（0.25%，含乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA），不含酚红）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）：武汉普诺赛生命科技有限公司；细胞/细菌总核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取试剂盒、FastKing互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）第一链合成试剂盒、SuperReal 荧光定量预混试剂增强版（SYBR Green）试剂盒：天根生化科技有限公司；IL-8酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒：北京四正柏生物科技有限公司；0.25%胰蛋白酶溶液（含乙二胺四乙酸（EDTA），溶于磷酸盐缓冲液PBS）：武汉普诺赛生命科技有限公司；细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）：生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.1.3 培养基
HT-29细胞完全培养基、McCoy's 5A培养基：武汉普诺赛生命科技有限公司；MRS肉汤培养基、LB培养基、哥伦比亚血平板：北京陆桥技术股份有限公司。
基础发酵培养基：参考文献[15]配制，调节pH至6.5，然后厌氧条件下在10 mL的西林瓶中分装5 mL培养基，密封后于115 ℃高压灭菌25 min。
1.2 仪器与设备
Mini细胞计数仪：美国Nexcelom公司；Multiskan Sky酶标仪、Fresco21型高速离心机：赛默飞世尔科技公司；CKX41倒置显微镜：日本奥林巴斯公司；DH-160HI二氧化碳培养箱、LRH-250F生化培养箱：昆山一恒仪器有限公司；9700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪：杭州博日科技有限公司；LM2 012实时荧光定量PCR（realtime fluorescent quantitative PCR，RT-fqPCR）分析仪：上海复星医学检测设备有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 乳酸菌、ETEC及HT-29细胞的培养
菌株活化：植物乳杆菌LP45、嗜酸乳杆菌La28、鼠李糖乳杆菌LR519、乳双歧杆菌BAL531、嗜热链球菌S131、S709、S869以3%（V/V）的接种量接种于MRS肉汤培养基，于37 ℃恒温培养箱中培养18 h，连续传代3次；ETEC以3%（V/V）的接种量接种于LB培养基中，37 ℃恒温培养箱中培养18 h，连续传代3次。
菌悬液浓度调整：取第3代培养18 h以恢复菌种活力后的各菌株调整菌液浓度。3代菌种4 ℃、5 000 r/min离心5 min，收集菌体用PBS洗涤2次4 ℃、5 000 r/min离心5 min后，去除上清，用MyCoy's 5A培养基重悬，利用细胞计数仪调整菌株LP45、La28、LR519、BAL531、S131、S709、S869 及ETEC菌体浓度均为108 CFU/mL，备用。
细胞培养：将在-80 ℃超低温冰箱中保存的细胞HT-29取出，37 ℃恒温水浴迅速解冻复苏，培养瓶中加入一定量的HT-29细胞完全培养基，5%CO2培养箱中37 ℃培养24 h至细胞长满培养瓶底面积80%后，加入1 mL胰蛋白酶细胞消化液消化处理1 min至细胞悬浮后加入2mL HT-29细胞完全培养基终止消化，细胞悬液于12 000 r/min离心2 min后收集细胞并转移至75 mL中号培养瓶中补充HT-29细胞完全培养基至15 mL，重复上述操作传代3次进行后续实验。
1.3.2 体外发酵实验分组及发酵液的制备
取正常人新鲜粪便用生理盐水按照1∶10（g∶mL）比例稀释过滤得到粪便接种液，取500 μL粪便接种液接种到基础发酵培养基中，按照表1分组及接种ETEC与各乳酸菌菌悬液，于37 ℃培养24 h后得到发酵液，将发酵液于9 000 r/min离心3 min，上清液经0.22 μm膜过滤后备用。
表1 体外发酵实验分组及接种
Table 1 Grouping and inoculation of fermentation experiments in vitro
分组 接种方法对照组（Control） 仅接种粪便接种液培养24 h ETEC组（ETEC）治疗组（ETEC+菌株）接种粪便接种液后接种等量的ETEC菌悬液培养24 h接种粪便接种液后接种等量的ETEC菌悬液培养12 h后分别接种等量的各乳酸菌菌悬液培养12 h
1.3.3 发酵液与HT-29细胞共培养
将1.3.1节中活化HT-29细胞浓度调整为2×105个/mL，每孔2 mL细胞液接于24孔板中，培养16～20 h细胞贴壁后，更换2 mL新鲜培养液。对照组、ETEC组及治疗组分别每孔接种1.3.2节中各分组发酵上清液200 μL于24孔板，接种200 μL HT-29细胞培养液为空白组，置于5%CO2培养箱中37 ℃培养12 h后每孔加入100 μL胰蛋白酶消化处理1 min至细胞悬浮，加入200 μL HT-29细胞完全培养基终止消化，收集细胞悬液于12 000 r/min离心2 min后分别收集细胞及上清液，-80 ℃贮藏待用。
1.3.4 不同种属乳酸菌抑制ETEC能力测定
采用牛津杯双层平板法，按照1.3.1将调整浓度后的ETEC涂布到哥伦比亚血平板上，立即放入牛津杯，加入菌体浓度均为108 CFU/mL的各乳酸菌菌悬液100 μL，以生理盐水为对照，37 ℃培养18 h，采用游标卡尺测量抑菌圈直径，当抑菌圈直径＞8 mm表示有抑菌作用[16]。
1.3.5 HT-29细胞免疫因子质量浓度的测定
使用1.3.3节中所收集的细胞上清液再次于12 000 r/min离心2 min，取上清分装至无酶PE管中，按照ELISA试剂盒说明书测定各样品细胞因子质量浓度，细胞培养基作为空白孔。
1.3.6 实时荧光定量PCR分析
按照RNA Easy Fast动物组织/细胞RNA提取试剂盒操作说明提取1.3.3节中共培养后HT-29细胞RNA，并通过Fast King cDNA第一链合成试剂盒操作说明反转录为cDNA，并在-80 ℃保存。使用Super Real 荧光定量预混试剂增强版（SYBR Green）试剂盒进行RT-fqPCR，分析黏蛋白（mucin，MUC）（MUC2、MUC5AC）、水通道蛋白-3（aquaporin-3，AQP-3）基因与紧密连接蛋白基因，包括闭合小环蛋白-1/2（zonula occluden-1/2，ZO-1/2）及咬合蛋白（occludin）相对表达水平，RT-fqPCR引物序列见表2。
表2 RT-fqPCR引物序列
Table 2 Primer sequences of RT-fqPCR
引物 引物序列（5'-3'）β-actin MUC2 MUC5AC AQP-3 ZO-1 ZO-2 occludin F:5'-TTTTAGGATGGCAAGGGACTT-3'R:5'-GATGAGTTGGCATGGCTTTA-3'F:5'-GACCCGCACTATGTCACCTT-3'R:5'-GGACAGGACACCTTGTCGTT-3'F:5'-CCAGCTCTGTGGCTTACTCC-3'R:5'-TCGGAGGTGGATATTGAAGG-3'F:5'-AGACAGCCCCTTCAGGATTT-3'R:5'-TCCCTTGCCCTGAATATCTG-3'F:5'-ATCCCTCAAGGAGCCATTC-3'R:5'-CACTTGTTTTGCCAGGTTTTA-3'F:5'-AAAGCAGAGCGAACGAAGAG-3'R:5'-TTTAGTTGCCAGACCCGTTC-3'F:5'-CCAATGTCGAGGAGTGGG-3'R:5'-CGCTGCTGTAACGAGGCT-3'
参照SYBR Green试剂盒说明书要求进行加样。加样后进行RT-fqPCR扩增，扩增体系、扩增参数参考张秋月等[17]的研究并加以修改：95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，循环45次。溶解曲线分析步骤为65～95 ℃，每步升0.5 ℃，保持5 s。以β-actin基因为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算各实验组相对于对照组各基因的相对表达倍数。
1.3.7 细胞增殖能力测定
将活化HT-29细胞浓度调整为2×105个/mL，每孔100 μL细胞液接于96孔板中，于5%CO2培养箱中37 ℃培养16～20 h细胞贴壁后，更换新鲜培养液，每孔接种分组发酵上清液10 μL于96孔板，接种10 μL细胞培养液为空白组，置于5%CO2培养箱中37 ℃培养12 h后参考CCK-8试剂盒说明书检测细胞增殖情况：每孔内加入10 μL的CCK-8溶液，细胞培养箱内孵育1 h，在波长450 nm处测定吸光度值（OD450 nm值。细胞相对增殖率计算公式如下：
式中：As表示实验组OD450nm值，Ac表示空白对照组OD450nm值。
1.3.8 数据统计分析
所有实验均设置3组平行，数据以“平均值±标准差”表示。采用Origin 9.5软件绘图，采用Excel 2016、SPSS 23.0软件对数据进行分析处理。
2 结果与分析
2.1 不同种属乳酸菌对ETEC的抑制能力
由图1可知，菌株LP45、La28、LR519、BAL531、S131、S709及S869抑菌圈直径均＞8 mm，表现出明显的抑制ETEC的作用，其中嗜热链球菌S131抑菌圈直径达到（18.00±0.59）mm，抑菌作用最显著（P＜0.05）。表明不同种属乳酸菌均具有良好的抑制致病菌、缓解TD的能力。相关研究表明[18-19]，乳酸菌通过分泌抑菌物质，如短链脂肪酸，降低环境pH从而抵抗致病菌，或与致病菌竞争营养物质及黏附位点等方式阻断致病菌黏附与增殖。不同菌株生长过程中合成短链脂肪酸能力与黏附能力不尽相同，这可能是不同乳酸菌抑制致病菌能力存在差异的原因。
图1 不同种属乳酸菌对产肠毒素大肠杆菌的抑制能力
Fig.1 Inhibition ability of different species of lactic acid bacteria on enterotoxigenic Escherichia coli
不同字母表示各菌株抑菌作用差异显著（P＜0.05）。下同。
2.2 不同种属乳酸菌拮抗ETEC引起的HT-29细胞炎症因子表达
细菌感染性腹泻中，致病菌ETEC影响了肠道屏障，侵入肠壁固有层，破坏免疫稳态，引发炎性病变，导致脓血渗出性腹泻，损害肠道健康[20-21]。由图2可知，ETEC组促炎因子白细胞介素-8（interleukin，IL-8）浓度相较于Control组显著增加了（20.82±5.70）%（P＜0.05），表现出较高的促炎作用，可能引起炎症病变。菌株LP45、La28、BAL531、S131、S709、S869的干预使得IL-8浓度相较于ETEC组分别下降了（24.46±2.51）%、（30.45±4.05）%、（6.13±1.56）%、（30.16±4.34）%、（12.99±2.75）%和（35.07±3.19）%，其中菌株S869抑制作用显著（P＜0.05）。与该结果相似，YANG J等[22-23]研究发现，乳杆菌属能够有效抑制ETEC刺激HT-29细胞产生炎症因子。大量动物实验也表明，乳酸菌能够降低仔猪或小鼠体内炎症因子水平，从而降低炎症反应[24-25]。结果表明，上述菌株能够抑制ETEC刺激HT-29细胞产生的促炎因子IL-8，从而抑制炎症发生、提高肠道免疫力，有效缓解ETEC感染造成的肠道炎症及渗出性腹泻。
图2 不同种属乳酸菌拮抗产肠毒素大肠杆菌引起的HT-29细胞炎症因子表达
Fig.2 Different species of lactic acid bacteria antagonized the expression of inflammatory factors in HT-29 cells induced by enterotoxigenic Escherichia coli
2.3 不同种属乳酸菌对HT-29细胞AQP-3表达的影响
致病菌能够直接侵入肠道上皮细胞，引起细胞功能障碍，同时破坏肠道微绒毛减少肠道吸收面积，造成吸收障碍，从而引起吸收障碍性或渗出性腹泻[26-27]。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是位于细胞膜上的蛋白质，能够调节水在细胞中的转运，调节AQP-3表达能够有效改善便秘或腹泻症状[28-29]。由图3可知，与Control相比，ETEC使HT-29细胞AQP-3 mRNA相对表达下调至（34±7）%。与ETEC相比，除菌株S869外，其余各乳酸菌的干预均可改善ETEC造成的AQP-3表达下调，其中菌株LP45及S709提升作用显著，分别使AQP-3 mRNA相对表达显著提升（2.77±0.60）倍、（2.39±0.14）倍（P＜0.05）。虽然ETEC引起腹泻的水外流机制尚未明确，但其可能与AQP-3表达下调有关，各乳酸菌通过恢复AQP-3的表达、提高肠道吸水能力，降低粪便含水量，从而改善ETEC造成的腹泻。该结果与IKARASHI N等[30-31]鼠李糖乳杆菌LB1改善ETEC引起仔猪腹泻的机制相似。
图3 不同种属乳酸菌对HT-29细胞AQP-3表达的影响
Fig.3 Effect of different species of lactic acid bacteria on AQP-3 expression in HT-29 cells
2.4 不同种属乳酸菌对HT-29细胞黏蛋白表达的影响
肠道中的杯状细胞能够分泌黏蛋白形成一层黏液屏障，黏液屏障作为肠道机械屏障的重要组成之一，能够保护肠道上皮细胞免受病原菌和有害物质的侵袭、一定程度上能够阻止致病菌的黏附，同时对肠上皮细胞保护及肠道转运过程至关重要[32-33]。由图4可知，与Control相比，ETEC分别使HT-29细胞MUC2、MUC5AC mRNA相对表达水平下调至（75±5）%（P＞0.05）和（52±1）%（P＜0.05），而各乳酸菌的干预能够改善ETEC对黏蛋白基因的抑制。其中，植物乳杆菌LP45能够显著提升MUC2信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）相对表达至（2.39±0.15）倍（P＜0.05），嗜热链球菌S709显著提升MUC5AC mRNA相对表达至（1.89±0.21）倍（P＜0.05），从而增加肠道的黏液分泌，改善ETEC感染造成的黏液屏障损伤，增强肠道屏障、恢复黏膜屏障功能。
图4 不同种属乳酸菌对HT-29细胞黏蛋白表达的影响
Fig.4 Effect of different species of lactic acid bacteria on mucin expression in HT-29 cells
不同字母表示同一指标不同菌株差异显著（P＜0.05）。
2.5 不同种属乳酸菌对HT-29细胞紧密连接蛋白表达的影响
紧密连接的肠道上皮细胞是肠道机械屏障的基础，能够有效避免致病菌或大分子物质透过细胞间隙，而致病菌可通过改变紧密连接蛋白结构与功能等方式破坏肠道屏障[33-34]。由图5可知，与Control相比，ETEC对紧密连接蛋白表达的抑制效果并不明显，仅使HT-29细胞ZO-2 mRNA相对表达下调至（63±4）%。另外，各乳酸菌的干预能够在ETEC存在的情况下上调各紧密连接蛋白的相对表达，其中嗜热链球菌S869分别使ZO-1、occludin mRNA相对表达显著上调（15.24±0.93）倍、（9.06±0.09）倍（P＜0.05），鼠李糖乳杆菌LR519和乳双歧杆菌BAL531分别使ZO-2 mRNA相对表达显著上调（14.83±1.60）倍、（13.27±1.01）倍（P＜0.05），表示各乳酸菌均可上调细胞紧密连接蛋白表达，增强肠上皮细胞的紧密连接，恢复肠道屏障功能，但其作用效果存在一定的菌株差异。这与朱翠等[35-36]研究发现，乳酸菌能够调节肠上皮细胞紧密连接蛋白表达及其在胞内的分布，肠道内双歧杆菌、乳杆菌分泌的短链脂肪酸能够维持肠黏膜上皮细胞紧密连接、保护肠道机械屏障的结果相似。
图5 不同种属乳酸菌对HT-29细胞紧密连接蛋白表达的影响
Fig.5 Effect of different species of lactic acid bacteria on tight junction protein expression in HT-29 cells
2.6 不同种属乳酸菌拮抗ETEC造成的HT-29细胞损伤
肠上皮细胞是肠道机械屏障的另一组成部分，其完整性对肠道吸收营养物质、阻挡致病菌和内毒素的入侵至关重要[37]。由图6可知，ETEC组HT-29细胞增殖率降低（2.06±0.08）%（P＜0.05）。除菌株S869外，各乳酸菌的干预可改善ETEC造成的肠上皮细胞损伤，其中嗜热链球菌S131能够使HT-29细胞的相对增殖率显著提高至（21.07±1.21）%（P＜0.05），结果表明，上述乳酸菌能够清除ETEC产生的毒素类物质，产生有益于肠上皮细胞生长的物质，从而拮抗ETEC对肠上皮细胞的损伤。该结果与VON MENTAER A等[38-39]研究发现，ETEC通过破坏细胞骨架、引起炎症反应等机制对宿主肠道上皮细胞造成损伤结论一致。
图6 不同种属乳酸菌拮抗产肠毒素大肠杆菌造成的HT-29细胞损伤
Fig.6 Different species of lactic acid bacteria antagonized the damage of HT-29 cells caused by enterotoxigenic Escherichia coli
3 结论
植物乳杆菌LP45、嗜酸乳杆菌La28、鼠李糖乳杆菌LR519、乳双歧杆菌BAL531、嗜热链球菌S131、S709可以通过抑制致泻性大肠杆菌ETEC，拮抗ETEC感染造成的AQP-3表达下调、炎症因子分泌增加及上皮细胞凋亡，提高肠道吸水能力、增强肠道免疫，从而改善腹泻症状，缓解水样便或脓血便。此外，上述乳酸菌均在不同程度上缓解ETEC感染造成的肠道黏膜屏障与紧密连接损伤，增强肠道机械屏障，从而维持基本肠道健康。综合来说，菌株LP45、La28、LR519、BAL531、S131、S709及S869能够通过抑制肠道致病菌，恢复肠道通透性及正常肠道屏障生理功能，降低肠道炎症等机制缓解TD腹泻症状，但不同乳酸菌在各机制下的作用效果存在一定差异。
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