燃料乙醇作为优良燃油品质改善剂及清洁液体燃料和绿色能源，已成为国内外关注并推广使用的绿色燃料[1-2]。燃料乙醇可以替代石油燃料应用于交通行业，对环境友好，改善城市空气质量和减少温室气体的排放，为实现“碳达峰、碳中和”目标贡献力量[3-4]。两种或多种原料混合发酵可以避免单一原料发酵的某些不利因素，原料间相互促进，提高出酒率，原料多元化应用也能随时适应于市场变化[5-6]。2020年起，我国开始定向拍卖超储存小麦，部分乙醇厂开始尝试使用小麦[7]，但是小麦发酵乙醇存在诸多的问题[8]。超标的小麦（是指储藏3年以上，由于霉变、真菌毒素和重金属超标等问题的小麦。）价格偏低，通过与木薯原料混合，辅料工艺优化筛选，能够降低原料成本，节省辅料添加量，同时提高经济效益，又能保证粮食安全。
目前，燃料乙醇的研究从之前利用不能食用的玉米、水稻与小麦混合原料发酵，到目前尝试提高混合发酵原料中小麦的比例和辅料优化，缓解燃料乙醇企业原料成本压力。周娜娜等[9]研究小麦与水稻混合发酵生产燃料乙醇，当干物质含量为30%，超期储存小麦添加量为30%，液化阶段使用超强复配淀粉酶（0.26 kg/t粮），糖化阶段使用糖化酶（0.300 kg/t粮），酸性蛋白酶（0.035 kg/t粮），在32 ℃条件下发酵72 h，酒精度可达12.37%vol。通过在拌料阶段添加蔚蓝木聚糖酶（0.3 kg/t粮），可使蒸馏残液滤速由4.8 mL/min提高至7.8 mL/min，清液干物（清液是生物乙醇企业产生的高溶度蛋白质工业废水，清液干物就是清液的干物质浓度。）由8.2%降低至5.7%。李永恒等[10]研究小麦和木薯混合发酵生产燃料乙醇中试试验，结果表明中试试验液化醪固形物含量为33.20%，酒精度为14.90%vol，残总糖含量为3.06%。木薯小麦混合发酵生产燃料乙醇工艺是可行的，陈化小麦出厂价为1 200元左右，可以有效降低原料成本。刘晓峰等[11]研究陈化小麦和水稻共混发酵生产燃料乙醇，添加15%比例小麦的乙醇产量最高，达到11.14 g/100 mL，在不改变生产工艺的条件下，对生产影响不大。鲁佰成等[12]研究大米和木薯混合发酵制备燃料乙醇，大米添加比例为25%时，发酵酒精度能达到15%vol以上，废渣蛋白质22.80%，废水可以通过前处理工艺解决环保压力问题。申乃坤等[13]研究木薯与甘蔗汁混合发酵，木薯粉与甘蔗汁的料液比为1∶5（g∶mL），梯度升温，发酵48 h，发酵成熟醪乙醇体积分数可达17.84%，采用混合发酵，可以提高原料的转化速率和利用率。
本研究以超期储存小麦和木薯为原料，以活性干酵母为发酵菌株，混合发酵生产燃料乙醇。主要对木薯与小麦混合发酵比例、糖化酶添加量、酸性蛋白酶添加量和不同活性干酵母对发酵的影响。优化混合发酵的原料和辅料，为原料多元化发酵燃料乙醇工艺提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
木薯、超期储存小麦：宿州中粮生物化学有限公司车间；淀粉酶（酶活14～15万U/g）：杰能科（中国）生物工程有限公司；糖化酶（酶活15万U/g、35万U/g）、酸性蛋白酶（酶活10万U/g）、木聚糖酶（酶活3万U/mL）：山东隆科特酶制剂有限公司；菌肽宝（主要成份为乳酸链球菌素、脱氢醋酸钠、脱乙酰甲壳素、糊精等）：山东安茂康生物技术有限公司；安琪超级酿酒高活性酵母、糖化酵母：安琪酵母股份有限公司；发利酒用高活性干酵母：英联马利（北京）食品销售有限公司；耐高温活性酒用干酵母：法国乐斯福集团；奥利酵母：新疆昇力生物科技有限责任公司。
1.2 仪器与设备
Agilent 1260高效液相色谱：安捷伦科技发展有限公司；SBA-40E生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所；HWS-28水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；EUROSTAR 20悬臂搅拌器：德国艾卡公司；ZQZY-CF8振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司；HG63快速水分测定仪、40型精密型台式pH/电导率测量仪：梅特勒-托利多有限公司；Secura 3102-1CN电子天平：德国赛多利斯集团。
1.3 试验方法
1.3.1 燃料乙醇生产工艺流程及操作要点
操作要点：
原料：以木薯、小麦作为原料，经筛选，去除杂质。
粉碎：木薯和小麦分别通过粉碎机粉碎，木薯粉碎后经20目筛网通过率95%；小麦全粉碎。
拌料：1 L玻璃反应釜，体系为800 g，分别按一定比例称取木薯粉和小麦粉，按料液比1∶1.96（g∶mL）加入保温65 ℃的蒸馏水混合，控制粉浆干物质含量30%左右，调节pH 5.6，添加α-淀粉酶0.60 kg/t酒，木聚糖酶0.07 kg/t酒，在66 ℃水浴锅中搅拌40 min。
液化：拌料结束后，将反应釜立刻放置在90 ℃的水浴锅中，前10 min搅拌转速为200 r/min，10 min后调整搅拌速度为80 r/min维持120 min。液化结束后迅速降温32 ℃，摇瓶分装。
同步糖化发酵：将液化醪取出降温至32 ℃，硫酸调节发酵pH值4.2～4.3，装液量200 mL/500 mL，安琪超级酿酒高活性酵母活化液添加量为0.05%，糖化酶加量为2.0 kg/t酒，酸性蛋白酶加量为0.3 kg/t酒，菌肽宝5 mg/L，转速100 r/min，温度32 ℃，发酵68 h后检测酒精度、残总糖和残还原糖含量。
蒸馏：发酵完成后，取100 mL成熟醪，加入100 mL蒸馏水，混合均匀后用蒸馏冷凝装置蒸酒，用100 mL容量瓶收集，即得燃料乙醇。
1.3.2 分析检测
淀粉含量：按照国标GB 5009.9—2016《食品中淀粉的测定》中的方法测定[14]；粗脂肪含量：按照国标GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》中的方法测定[15]；粗蛋白含量：按照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》中的方法测定[16]；粗纤维含量：按照国标GB/T 5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》中的方法测定[17-18]；残总糖、残还原糖含量：生物传感分析仪测定[19]；酒精度：采用高效液相色谱法[20-21]，其色谱条件如下：HPX-87H色谱柱（300 mm×7.8 mm）；流动相0.005 mol /L H2SO4；泵流速0.5 mL/L；柱温65 ℃；设置示差检测器温度50 ℃；进样量10 μL；运行时间30 min。
1.3.3 发酵工艺优化单因素试验设计
通过木薯和小麦混合不同比例（纯木薯、3.0∶1.0、1.5∶1.0、1.0∶1.0、1.0∶1.5）发酵过程筛选最优条件，在此基础上进行糖化酶添加量（1.0 kg/t酒、1.4 kg/t酒、2.0 kg/t酒、2.6 kg/t酒、3.0 kg/t酒）、不同酿酒酵母（安琪超级酿酒高活性酵母、法尔凯酵母、安琪糖化酵母、发利酵母、奥利酵母）、酸性蛋白酶添加量（0.075 kg/t酒、0.150 kg/t酒、0.300 kg/t酒、0.600 kg/t酒、1.200 kg/t酒）单因素试验，考察以上因素单独变化时对发酵生产乙醇的影响。每组试验设为3个平行，最终结果取平均值。
2 结果与分析
2.1 原料成分分析
将木薯、超期储存的小麦进行组分分析，结果见表1。由表1可知，从粗淀粉含量来看，木薯中粗淀粉含量要高于小麦中粗淀粉约5.60%，混合小麦后淀粉含量会下降，但是小麦的价格相对便宜，小麦的添加会缓解原料成本压力。小麦的粗蛋白和粗脂肪都要高于木薯，混合液化黏度会升高，需要添加木聚糖酶降低物料黏度，同时小麦中的蛋白质可以增加干酒糟及其可溶物（distillers dried grains with solubles，DDGS）饲料中蛋白质的含量，提高饲料附加值，为企业降本增效。因此，木薯和超期储存小麦原料生产酒精是可行的。
表1 木薯和小麦原料的组成分析结果
Table 1 Results of composition analysis of cassava and wheat raw materials
原料 粗蛋白/% 粗纤维/% 粗脂肪/% 粗淀粉/%木薯小麦3.20 14.35 3.85 3.05 0.40 1.38 68.47 62.87
2.2 不同木薯与小麦质量比对发酵的影响
以纯木薯粉为对照，考察木薯与小麦不同混合比例对发酵的影响，结果见图1。
图1 不同木薯与小麦质量比对发酵产乙醇的影响
Fig.1 Effect of different mass ratio of cassava and wheat on ethanol production by fermentation
由图1可知，使用纯木薯发酵，酒精度为15.63%vol，这是因为木薯淀粉含量高于小麦，小麦添加导致整体的淀粉含量降低；当木薯与小麦质量比在3∶1～1∶1时，发酵酒精度由15.11%vol降低至14.95%vol，残总糖由2.30 g/100 mL升高至2.57 g/100 mL；当木薯与小麦质量比为1∶1，残糖最低，酒精度最高；当木薯与小麦质量比在1∶1～1∶1.5时，残总糖为3.12 g/100 mL、酒精度为14.11%vol；相比1∶1时发酵残总糖升高0.55 g/100 mL，残还原糖升高0.06 g/100 mL，酒精度降低0.84%vol。因此，最适木薯与小麦质量比为1∶1。
2.3 糖化酶添加量对发酵的影响
糖化酶添加量对发酵的影响见图2。
图2 不同的糖化酶添加量对发酵产乙醇的影响
Fig.2 Effect of different saccharification enzyme addition on ethanol production by fermentation
由图2可知，随着糖化酶添加量在1.4～2.0 kg/T酒范围内的增加，酒精度逐渐上升，残总糖、残还原糖变化不大；当糖化酶添加量为2.0 kg/T酒时，发酵成熟醪残总糖和残还原糖最低，分别为2.53 g/100 mL、0.44 g/100 mL，酒精度最高为15.09%vol；当糖化酶添加量＞2.0 kg/T酒之后，酒精度有所下降，残糖有所升高。糖化酶浓度持续增加时，吸附在淀粉颗粒上多余的酶分子改变了淀粉的结构，使其不能有效分解[22-23]。糖化酶加量过高渗透压也高，加量过低导致酵母生长缓慢。因此，最适糖化酶添加量为2.0 kg/T酒。
2.4 酸性蛋白酶加量对发酵的影响
酸性蛋白酶可将原料中的部分蛋白质降解为小肽和氨基酸，在发酵中添加酸性蛋白酶，一方面可将与蛋白交联的部分淀粉释放出来，为糖化酶的糖化作用创造条件，一方面可以为酵母提供有机氮源，为酿酒酵母提供丰富的营养[24]。同时在整个发酵过程中，能够有效的抑制杂菌的繁殖，有利于酵母的生长繁殖[25]。不同的酸性蛋白酶添加量对产乙醇的影响见图3。
图3 不同的酸性蛋白酶添加量对发酵产乙醇的影响
Fig.3 Effect of different acid protease addition on ethanol production by fermentation
由图3可知，当酸性蛋白酶添加量为0.075～0.300 kg/t酒时，酒精度稍有升高，残糖稍有下降；当酸性蛋白酶添加量为0.300 kg/t酒时，残总糖、残还原糖分别为2.48 g/100 mL、0.38 g/100 mL，酒精度为15.15%vol；当酸性蛋白酶添加量＞0.3 kg/t酒之后，残总糖、残还原糖及酒精度指标差异不大。因此，最适酸性蛋白酶添加量为0.3 kg/t酒。
2.5 不同酿酒酵母种类对发酵的影响
酒精发酵中，随着酵母的繁殖和代谢，醪液中可利用的糖不断减少，酒精度逐渐增加，到发酵结束时，残糖含量越低，酒精度越高，说明发酵效果越好，同时也能降低污水处理时化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）值。不同种类的酿酒酵母对发酵产乙醇的影响见图4。
图4 不同种类的酿酒酵母对发酵产乙醇的影响
Fig.4 Effect of different Saccharomyces cerevisiae types on ethanol production by fermentation
由图4可知，通过对不同酿酒酵母进行混合原料发酵试验，从残糖和酒精度指标来看，不同的酿酒酵母添加量为0.05%，发酵效果差异较大，安琪超级酿酒高活性酵母成熟醪残总糖为2.74 g/100 mL、残还原糖为0.41 g/100 mL，酒精度为15.26%vol；安琪糖化酵母成熟醪残总糖为2.74 g/100 mL、残还原糖为0.42 g/100 mL，酒精度为15.24%vol，都优于法尔凯酵母、奥利酵母和发利酵母。这主要是因为安琪超级酿酒干酵母发酵活性强，耗糖快，生长繁殖迅速[26]；糖化酵母是在发酵过程中能释放出糖化酶，糖化酶增加利于多糖的水解，从而产生更多的乙醇[27]。因此，最适菌株为糖化酵母或安琪超酒酵母。
3 结论
通过开展木薯与小麦混合发酵，对影响发酵的因素进行单因素试验可知，两种原料混合发酵产乙醇的最佳工艺条件为木薯粉与小麦粉的质量比为1∶1、糖化酶加量为2.0kg/t酒、酸性蛋白酶加量为0.300 kg/t酒、活性干酵母为安琪超酒酵母或糖化酵母。在此试验优化工艺条件下，残总糖为2.74g/100mL、残还原糖为0.41g/100mL、酒精度为15.26%vol。本试验优化出的混合原料发酵工艺是一种有效的产乙醇的方法，优化出的工艺可为多元化原料混合发酵提供试验参考，为乙醇行业生产一线提供可借鉴的数据，缓解原料成本压力。
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