红枣（Ziziphus jujuba Mill.）兼具食用和药用价值、含有多种活性成分，是极佳的功能性食品原料[1]。我国的红枣产量居世界第一，现年产量已达750万t左右，约占世界红枣产量的90%[2]。红枣产量高，但其利用率较低，产品形式单一，近年来对红枣酸奶、红枣复合饮料、红枣醋研究较多[3-4]，且对于红枣酒研究大多为蒸馏酒[5]，而对红枣果酒的研究较少。果酒生产历史悠久，种类繁多，口味丰富，在酒类市场具有重要销售价值[6]。随着消费观念改变和饮食结构调整，果酒深受消费者青睐[7]。目前，红枣酒占果酒市场的比重为12%～15%，而中国红枣酒所占的比重却不足1%，且有很大一部分属于蒸馏酒，与庞大的红枣产量不成正比[8]。
发酵型红枣果酒品质的优劣与发酵剂、发酵工艺密切相关。曹泽虹等[9]采取Cox回归结合正交试验的方法，对红枣酒发酵工艺进行优化，发现酿造工艺对红枣酒品质影响显著；柴秀枝[10]采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）发酵结合蛋白酶处理对红枣发酵果酒的发酵工艺进行优化，得到最佳工艺参数；尹晓洁[11]通过对红枣酒中香气成分的分析，发现混合发酵的红枣酒中酯类成分显著升高，且添加非酿酒酵母能显著降低高级醇的含量；战吉宬等[12]通过研究发现，在葡萄酒酿造过程中，非酿酒酵母具有独特的代谢通路和较强的酶活，可降低酒中高级醇的含量，增加萜烯和酯类含量，并能释放甘露糖蛋白、多糖，提高多酚类物质含量，提高产品颜色的稳定性。另外，红枣中的黄酮类和多酚类物质具有较高抗氧化活性。ESTEKI T等[13]通过自由基清除能力和还原力检测证明红枣具有一定的抗氧化能力；齐习超[14]研究发现，经过发酵后的黑化红枣酒中多酚、总黄酮含量较高，且具有较好的自由基清除能力；宋亚茹[15]研究发现，7种不同红枣固态发酵后，总酚、多糖以及黄酮含量明显增加，2,2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-amino-bis（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulphonic acid），ABTS）自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力显著提升。因此，发酵型红枣果酒有助于提升枣中活性物质的抗氧化效果，同时提高红枣产品的附加值，延伸产业链，促进红枣产业健康发展。
本研究采用非酿酒酵母戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）NS-D与安琪酵母混菌发酵制备红枣果酒。以酒精度及感官评分为评价指标，通过单因素试验和正交试验对其发酵工艺进行优化，并考察非酿酒酵母添加对红枣果酒抗氧化物质含量和抗氧化活性的影响，为发酵型低醇红枣果酒产品的开发提供理论指导。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
新疆若羌红枣：沧州铭鑫食品有限公司；酿酒酵母（安琪酵母）：湖北安琪酵母股份有限公司；非酿酒酵母（戴尔有孢圆酵母（Torulaspora debrueckii）NS-D）：湖北安琪酵母股份有限公司；焦亚硫酸钾（分析纯）、柠檬酸（分析纯）、果胶酶（500 U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；没食子酸（纯度＞98%）：天津市科秘化学试剂有限公司；无水乙醇、水杨酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；福林试剂（分析纯）：茂名雄大化工有限公司；DPPH（分析纯）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；三氯乙酸（分析纯）：烟台健硕化工有限公司；硝酸铝（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：青岛希望生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
ME204E电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HH.S21-8-S数显式电热恒浴锅、SPX-400-Ⅲ生化培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；FE28电位滴定仪：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；ATC手持式折光仪：池州施耐得智能科技有限公司；GC-2010pro气相色谱（gas chromatography，GC）仪：岛津仪器（苏州）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 红枣果酒发酵工艺流程及操作要点[16]
红枣→挑选→清洗→蒸煮→去核→浸泡→热水浸提→冷却→酶解浸提→过滤→调节pH→调整糖度→添加SO2→接种酵母→主发酵→澄清→过滤→装瓶→灭菌→成品
操作要点：
红枣预处理：挑选无霉变虫害的红枣，洗净，上锅蒸10 min，去核，无菌水25 ℃常温浸泡30 min后，按照料液比1∶5（g∶mL）添加100 ℃热水浸提45 min，冷却至37～40 ℃备用。
酶解浸提、过滤：将果胶酶（添加量0.3 g/L）加入料液中，50 ℃酶解4 h，过滤，滤液备用。调节pH：采用0.1 g/mL的柠檬酸调节pH到3.5～4.0之间。调整糖度：设置预设酒精度为10%vol，添加蔗糖将红枣汁糖度调整至22°Bx。
添加SO2：添加80 mg/L SO2，可以减少发酵过程中微生物污染，抑制杂菌生长，保证酒的正常发酵。
接种酵母：按0.3 g/L红枣液取酿酒酵母溶于10倍体积的无菌水中，37 ℃活化30 min后备用。按照0.3 g/L红枣液取非酿酒酵母溶于10倍体积的无菌水中，37 ℃活化30 min后备用。将酿酒酵母和非酿酒酵母接种于红枣液中。
主发酵：将处理好的发酵液用保鲜膜封口，28 ℃条件下发酵9 d，每天早晚各排一次气。
澄清、过滤：在发酵好的酒液中加入0.5%皂土，静置澄清，过滤即得澄清酒体。
装瓶、灭菌：装瓶后进行巴氏杀菌，87 ℃灭菌30 min，即得红枣果酒成品。
1.3.2 红枣果酒发酵工艺优化单因素试验
在调整后的红枣液中先加入0.3 g/L的酿酒酵母，然后再分别加入0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L的非酿酒酵母，考察非酿酒酵母添加量对红枣果酒感官评分及酒精度的影响。在此基础上，依次考察SO2添加量（0、40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L、160 mg/L）及初始糖度（18°Bx、20°Bx、22°Bx、24°Bx、26°Bx）对红枣果酒感官评分及酒精度的影响。
1.3.3 红枣果酒发酵工艺优化正交试验
在单因素试验基础上，以感官评分和酒精度为评价指标，选取非酿酒酵母添加量（A）、SO2添加量（B）和初始糖度（C）3个因素，采用SPSS 22.0软件设计3因素3水平的正交试验，试验设计因素与水平见表1。
表1 红枣果酒发酵工艺优化正交试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests design for fermentation process optimization of jujube wine
水平 A 非酿酒酵母添加量/（g·L-1）B SO2添加量/（mg·L-1）C 初始糖度/°Bx 1 2 3 0.2 0.3 0.4 40 80 120 20 22 24
1.3.4 红枣果酒理化指标的测定
参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定红枣果酒的理化指标。酒精度采用重铬酸钾氧化法测定[17]。
1.3.5 感官评分
选取10名年龄在20～22岁且具有果酒品评经验的学生，男女各半，从外观、滋味、香气、典型性对红枣果酒的感官品质进行评定，满分100分，具体评价标准见表2。
表2 红枣果酒的感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of jujube wine
项目 评分标准 分值外观（10分）香气（30分）颜色呈黄褐色，失光浑浊，有悬浮物和沉淀颜色呈黄色，基本无光泽，澄清无杂物颜色金黄，透亮澄清，有一定光泽香气较淡，伴有不良气味红枣香气浓，酒香淡，轻微不良气味红枣香气适中，酒香醇厚，持久浓郁，怡人芳香典型性（20分）滋味（40分）普遍不明显风格独特，优良风味独特，典型完美刺喉不柔和，无异味柔和协调，均衡爽口口味协调，酒香醇厚0～3 4～6 7～10 0～10 11～20 21～30 0～10 11～15 16～20 0～15 16～30 31～40
1.3.6 红枣果酒中抗氧化物质含量的测定
总黄酮及总多酚含量测定：参考齐习超[14]的方法；氨基酸态氮含量测定：参考王斯维等[18]的方法；维生素C（vitamin C，VC）含量测定：参照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》。
1.3.7 红枣果酒抗氧化活性的测定
DPPH自由基清除能力的测定：参考曾臻等[19]方法并略微改动。取0.5 mL无水乙醇与5 mL DPPH乙醇溶液（39.4 mg/mL）混合摇匀；取0.5 mL不同浓度的红枣果酒样品与5 mL DPPH乙醇溶液混合摇匀；取0.5 mL红枣果酒样品溶液与5 mL无水乙醇混合摇匀；室温下避光静置0.5 h，采用紫外可见分光光度计在波长517 nm处测定吸光度值A0、A1、A2，计算DPPH自由基清除率，其计算公式如下：
羟基自由基清除能力的测定：参照文献WANG Y等[20]的方法。
超氧阴离子自由基清除能力的测定参考程超等[21]的方法。
ABTS自由基清除能力的测定：参考TRABELSI I等[22]的方法。
1.3.8 数据处理与分析
利用SPSS 22.0软件进行显著性分析，P＜0.05表明差异显著，结果以“平均值±标准差”表示。采用Origin8.5软件作图。
2 结果与分析
2.1 红枣果酒发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 非酿酒酵母添加量对红枣果酒发酵的影响
在果酒发酵过程中，非酿酒酵母主要增加香气物质，但非酿酒酵母和酿酒酵母混合发酵可能会使得非酿酒酵母失活[23]，因此考察非酿酒酵母添加量对红枣果酒酒精度及感官评分的影响，结果见图1。
图1 非酿酒酵母添加量对红枣果酒发酵的影响
Fig.1 Effect of non-Saccharomyces addition on the fermentation of jujube wine
由图1可知，随着非酿酒酵母添加量的增加，红枣果酒的酒精度及感官评分均呈先上升后下降的趋势。当非酿酒酵母添加量为0.3 g/L时，红枣果酒的酒精度及感官评分均达到最大值，分别为13.8%vol、95.3分。分析原因可能为非酿酒酵母添加量过低时，与酿酒酵母协同发酵不明显，酒体的风味明显不足；当非酿酒酵母添加量过高时，原料中的营养成分被微生物生长过度利用，从而导致酿酒酵母的发酵底物不足，酒精度降低，导致酒体风味寡淡[24]。因此，确定最佳非酿酒酵母添加量为0.3 g/L。
2.1.2 SO2添加量对红枣果酒发酵的影响
SO2溶于水生成亚硫酸，能够调节发酵液的pH值，适宜酸度不仅对酵母菌生长具有促进作用，还能保证红枣低度酒的口感[25]，因此，考察SO2添加量对红枣果酒酒精度及感官评分的影响，结果见图2。
图2 SO2添加量对红枣果酒发酵的影响
Fig.2 Effect of SO2 addition on the fermentation of jujube wine
由图2可知，随着SO2添加量的增加，红枣果酒的酒精度和感官评分均呈先上升后下降的趋势，当SO2添加量为80 mg/L时，酒精度和感官评分均达到最高值，分别为13.6%vol、95.1分。分析原因可能是SO2添加量过低，不能有效抑制杂菌生长；SO2添加量过高，抑制了酵母菌的活性，影响发酵，使得红枣果酒中的酒精度降低。因此，确定最佳SO2添加量为80 mg/L。
2.1.3 初始糖度对红枣果酒发酵的影响
红枣低度酒发酵过程中酒精发酵需要酵母菌利用碳源产乙醇，发酵底物具有一定的初始糖分是必要的[26]，初始糖度对红枣果酒酒精度及感官评分的影响见图3。由图3可知，随着初始糖度的升高，酒精度呈上升趋势，而感官评分呈先升高后下降的趋势，当初始糖度为22°Bx时，感官评分最高，为95.2分，此时酒精度为13.7%vol。糖可以作为酵母菌发酵的底物，促进酵母的生长代谢，理论上在果酒发酵过程中，糖越多，发酵后的酒精度就会越高。因本试验研究红枣果酒，需要保留部分糖分，适宜的糖酸比和酒精度是红枣果酒的风味品质的重要保障[27]。因此，确定最佳初始糖度为22°Bx。
图3 初始糖度对红枣果酒发酵的影响
Fig.3 Effect of initial sugar content on the fermentation of jujube wine
2.2 红枣果酒发酵工艺优化正交试验结果
在单因素试验基础上，以感官评分和酒精度为评价指标，选取非酿酒酵母添加量（A）、SO2添加量（B）和初始糖度（C）3个因素，采用SPSS 22.0软件设计3因素3水平的正交试验，结果与分析见表3，方差分析见表4。
表3 红枣果酒发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for jujube wine fermentation process optimization
试验号 A B C 感官评分/分 酒精度/%vol 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 3 2 2 1 3 3 2 1 89.7±1.17 92.8±1.22 90.7±1.25 93.4±1.12 91.3±1.28 92.5±1.31 92.7±1.22 90.5±1.04 86.4±1.32 12.2±1.01 13.2±0.49 12.4±0.83 13.4±0.65 13.3±0.98 13.8±1.09 14.3±1.12 13.6±0.84 12.1±0.45感官评分k1 k2 k3 R k1′酒精度k2′k3′R′91.1 92.4 89.9 2.5 12.6 13.5 13.3 0.9 91.9 91.5 89.9 2.0 13.3 13.4 12.8 0.6 89.1 91.5 92.7 3.6 12.5 13.1 13.8 1.23
表4 正交试验结果的方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal test results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。
来源 因变量 平方和 自由度 均方 F 值 P 值校正模型截距A B C 误差5.796 0.612 74 529.00 1 568.160 6.173 0.810 2.893 0.163 8.320 0.863 0.123 0.053 46.991 11.479 604 289.189 29 403.00 50.054 15.187 23.459 3.063 67.459 16.187 0.021*0.082 0.000**0.000**0.020*0.062 0.041*0.246 0.015*0.058总计校正后总计感官评分酒精度感官评分酒精度感官评分酒精度感官评分酒精度感官评分酒精度感官评分酒精度感官评分酒精度感官评分酒精度34.773 3.673 74 529.00 1 568.160 12.347 1.620 5.787 0.327 16.640 1.727 0.247 0.107 74 564.020 1 571.940 35.020 3.780 6 6 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 9 9 8 8
由表3及表4可知，非酿酒酵母添加量、SO2添加量和初始糖度对红枣果酒的感官评分均有显著影响（P＜0.05），影响程度为C＞A＞B，即初始糖度＞非酿酒酵母添加量＞SO2添加量；最佳发酵工艺为A2B1C3，即非酿酒酵母添加量为0.3 g/L，SO2添加量为40 mg/L，初始糖度为24°Bx。3个因素对红枣果酒酒精度的影响程度为C＞A＞B，即初始糖度＞非酿酒酵母添加量＞SO2添加量，但对红枣果酒酒精度的影响不显著（P＞0.05）。因此，本试验中仅将感官评分作为最终评价指标，确定最佳发酵工艺为A2B1C3，即非酿酒酵母添加量为0.3 g/L，SO2添加量为40 mg/L，初始糖度为24°Bx。经验证，在此工艺条件下得到的红枣果酒，感官评分为96.1分，酒精度为13.6%vol。
2.3 红枣果酒的理化指标分析
采用最优工艺发酵制备红枣果酒，分别对红枣果酒的理化指标进行检测。结果表明，红枣果酒的残糖量为5.82g/L，总酸含量为4.95 g/L，挥发酸含量为0.32 g/L，可溶性固形物含量为8.51%，pH 4.33，其理化指标均符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》要求。
2.4 红枣果酒中抗氧化物质含量及抗氧化活性测定结果
2.4.1 红枣果酒中抗氧化物质含量的测定
红枣果酒发酵过程中，非酿酒酵母必须借助发酵性能强的酿酒酵母才能完成定殖，在整个发酵阶段非酿酒酵母可以产生一系列的酶和代谢物来影响发酵[28]。因此，以安琪酿酒酵母单菌发酵的红枣果酒为对照，考察非酿酒酵母添加对红枣果酒中抗氧化物质含量的影响，结果见图4。
图4 红枣果酒中抗氧化物质含量测定结果
Fig.4 Determination results of antioxidant substances contents in jujube wine
不同字母表示不同红枣果酒差异显著（P＜0.05）。下同。
由图4可知，安琪酿酒酵母单菌发酵的红枣果酒中多酚类物质含量为4.037 mg/mL，显著高于混菌发酵红枣果酒（0.214 mg/mL）（P＜0.05），分析原因可能是红枣果酒酿造过程中，非酿酒酵母和酿酒酵母的发酵都会产生氧化酶，这些酶会与多酚类物质反应，从而导致多酚含量下降[29]，这与金海炎等[26]研究结果类似。然而，混菌发酵红枣果酒中总黄酮（3.476 mg/mL）和VC含量（2.146 mg/mL）显著高于安琪酿酒酵母单菌发酵的红枣果酒中总黄酮（0.356 mg/mL）和VC含量（0.167 mg/mL）（P＜0.05），分析原因可能是非酿酒酵母的添加抑制了酿酒酵母中葡萄糖苷酶的活性，从而阻止黄酮分解[30]；VC含量变化则与发酵过程中自由基的产生有关，酿酒酵母单独发酵过程相对简单，自由基产生积累迅速，VC对自由基有着明显的清除作用，因此导致VC含量下降，非酿酒酵母可以降低酿酒酵母的发酵速度，限制红枣果酒中自由基的产生与积累[23]。混菌发酵红枣果酒中氨基酸态氮含量（9.347 mg/mL）显著高于安琪酿酒酵母单菌发酵红枣果酒（8.376 mg/mL）（P＜0.05），这可能是因为单一酿酒酵母发酵、酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵对原料中蛋白质的降解能力不同所致[18，23]。
2.4.2 红枣果酒抗氧化活性的测定
红枣果酒的抗氧化活性可以在一定程度上反应果酒品质的优劣[31]，以安琪酿酒酵母单菌发酵的红枣果酒为对照，考察非酿酒酵母添加对红枣果酒DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基和ABTS自由基清除率的影响，结果见图5。
图5 红枣果酒抗氧化活性测定结果
Fig.5 Determination results of antioxidant activity of jujube wine
由图5可知，添加非酿酒酵母混菌种发酵的红枣果酒的DPPH自由基清除率为92.33%、超氧阴离子自由基清除率为88.79%，显著高于安琪酿酒酵母单菌发酵的红枣果酒（69.92%、93.60%）（P＜0.05）；羟自由基清除率（77.42%）、ABST自由基清除率（45.76%）与安琪酿酒酵母单菌发酵的红枣果酒（75.68%、42.41%）无显著差异（P＞0.05），说明添加非酿酒酵母后，红枣果酒的抗氧化活性提高。分析原因可能是非酿酒酵母在发酵早期，分泌的胞外代谢物（可能是一些蛋白类物质，也可能会有一些醇类、醛酮类化合物）影响了酿酒酵母发酵，从而有利于抗氧化物质的生成和累积，增强对自由基的清除能力[23]。
3 结论
通过单因素试验和正交试验优化得到红枣果酒的最佳工艺条件为：非酿酒酵母（戴尔有孢圆酵母NS-D）添加量0.3 g/L，SO2添加量40 mg/L，初始糖度24 °Bx。在此工艺条件下得到的红枣果酒，感官评分为96.1分，酒精度为13.6%vol，残糖量为5.82 g/L，总酸含量为4.95 g/L，挥发酸含量为0.32 g/L，可溶性固形物含量为8.51%，pH 4.33，其理化指标均符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》要求。添加非酿酒酵母发酵有助于提高红枣果酒抗氧化物质含量及抗氧化活性，其总黄酮含量为3.476 mg/mL，总酚含量为0.214 mg/mL，氨基酸态氮含量为9.347 mg/mL，VC含量为2.146 mg/mL；超氧阴离子自由基清除率为88.79%，DPPH自由基清除率为92.3%，羟基自由基清除率为77.42%，ABTS自由基清除率为45.7%。
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