中国传统发酵食醋又称谷物醋，是中国人日常生活中重要的调味品和功能食品[1]。传统发酵谷物醋通常由谷物经过淀粉糖化、酒精发酵和醋酸发酵三个步骤发酵而成[2]，并在市售之前储存于陶器中进行陈酿。这一独特的酿造技术为谷物醋带来了多种有机酸、氨基酸和生物活性成分，如类黄酮类、黑色素和川芎嗪等[4]，同时赋予深黑或棕红的颜色和独特的风味[3]。
由于原料、糖化剂和发酵工艺的不同，国内市场上存在超过20多种的谷物醋产品。近年来，利用仪器分析技术结合多元统计分析对谷物醋进行了表征、鉴定和鉴别。研究了谷物醋中的挥发性风味化合物、有机酸和矿物元素[5-7]，并应用了不同的化学计量学方法来建立谷物醋的真实性和鉴别标准，特别是在香醋和雪利葡萄酒醋中[8-9]。镇江香醋（Zhenjiangaroma vinegar，ZAV）、山西老陈醋（Shanxi aged vinegar，SAV）、福建红曲醋（Fujian Monascus vinegar，FMV）和四川麸醋（Sichuan bran vinegar，SBV）是我国传统四大名醋，前三种也是我国的受保护的地理标志（protected geographical indication，PGI），很多研究基于谷物醋香气、挥发性风味成分、滋味等进行谷物醋的分类鉴别[10-13]。氨基酸不仅是谷物醋的重要营养成分，而且对谷物醋的香气、口感和外观都有影响[14]。对于不同的种类的谷物醋，氨基酸组成也有所不同[15]。目前还鲜有基于氨基酸组成特征对谷物醋的表征和分类相关研究。
本研究采用柱前衍生化高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定镇江香醋（ZAV）、山西老陈醋（SAV）、福建红曲醋（FMV）和四川麸醋（SBV）4种传统谷物醋中游离氨基酸的含量[16]，并对结果进行主成分分析（principal component analysis，PCA）及线性判别分析（linear discrimination analysis，LDA）。本研究旨在探索不同种类谷物醋样品中游离氨基酸谱的差异，明确特征氨基酸种类，并为氨基酸作为谷物醋分类的生物标志物奠定科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
镇江香醋样品（编号为1～13号）、四川麸醋样品（编号为14～24号）、山西陈醋样品（编号为25～32号）和福建红曲醋样品（编号33～40号），共40种谷物醋样品，详细信息见表1。所有醋样（陈酿时间均为2年）均直接从谷物醋厂抽样，以确保其可靠性。
表1 实验所用谷物醋样品信息
Table 1 Information of cereal vinegar samples used in the experiments
谷物醋 样品数量 主要原料 发酵方法 产地 PGI镇江香醋山西老陈醋福建红曲醋四川麸醋13 11 8 8糯米，麦麸，水高粱，大麦，豌豆，麦麸，水糯米，红曲，水麦麸，大米，曲，水固态发酵固态发酵固液发酵固态发酵江苏山西福建四川中国PGI（GB/T 18623—2011《地理标志产品镇江香醋》）和欧盟（No.501/2012）中国PGI（GB 19777—2013《地理标志产品山西老陈醋》）中国PGI（GB/T 26531—2011《地理标志产品永春老醋》）-
1.1.2 化学试剂
L-丙氨酸（alanine，Ala）、L-精氨酸（arginine，Arg）、L-天冬氨酸（aspartic acid，Asp）、L-半胱氨酸（cysteine，Cys）、L-谷氨酸（glutamic acid，Glu）、L-甘氨酸（glycine，Gly）、L-组氨酸（histidine，His）、L-异亮氨酸（isoleucine，Ile）、L-亮氨酸（leucine，Leu）、L-赖氨酸（lysine，Lys）、L-蛋氨酸（methionine，Met）、L-苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、L-脯氨酸（proline，Pro）、L-丝氨酸（serine，Ser）、L-苏氨酸（threonine，Thr）、L-酪氨酸（tyrosine，Tyr）、L-缬氨酸（valine，Val）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）标准溶液：美国Sigma-Aldrich公司。其他所有试剂均为国产分析纯。超纯水：美国Millipore超纯水系统。
1.2 仪器与设备
1260 Infinity II高效液相色谱仪：美国Agilent公司。
1.3 方法
1.3.1 氨基酸含量的测定
将5 mL的谷物醋样品与5 mL的10%三氯乙酸等量混合，并通过4号滤纸过滤。滤液用10%三氯乙酸溶液稀释，10 000×g条件下离心10 min，取上清液进行HPLC分析。用反相高效液相色谱法测定谷物醋样品中的游离氨基酸，邻苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）和9-芴甲基氯甲酸酯（9-fluoro-methyl chloroformate，FMOC）的色谱柱前衍生化由高效液相色谱Agilent 1100自动完成。其色谱条件为[17]：ODSHypersil 色谱柱（4.6 mm×250 mm），柱温40 ℃，流动相A为乙酸钠97.5 mmol/L，流动相B为乙酸钠（48.7 mmol/L）、乙腈与水（1∶2∶2，V/V），采用等度洗脱，流速为1.0 mL/min。紫外检测波长分别为338 nm和262 nm。采用外标法进行定性和定量。
1.3.2 总酸含量的测定
采用国标GB 2719—2018《食品安全国家标准食醋》中的酸碱滴定法。
1.3.3 数据处理
每个谷物醋样品氨基酸分析设置3个平行，结果以“平均值±标准差”表示。所有谷物醋产品的总酸和氨基酸含量都折算为谷物醋总酸4.00g/100mL时的数值。使用Microsoft Office Excel 2013和SPSS 16.0执行所有结果统计分析。
2 结果与分析
2.1 四种传统发酵谷物醋氨基酸组成分析
4类谷物醋样品的氨基酸含量测定结果见表2。由表2可知，四种谷物醋中共检出18种氨基酸，其中必需氨基酸7种。四川麸醋、镇江香醋、山西老陈醋、福建红曲醋氨基酸总量具有显著性差异（P＜0.05），分别为（833.47±34.97）mg/100 mL、（494.56±23.52）mg/100 mL、（387.60±12.98）mg/100 mL、（218.07±14.41）mg/100 mL。四川麸醋的脂肪族氨基酸、酸性氨基酸、含羟基氨基酸、碱性氨基酸、芳香族氨基酸、含硫氨基酸的总量及γ-氨基丁酸含量均显著高于其他3类谷物醋（P＜0.05）。4类谷物醋中酸性氨基酸和含羟基氨基酸的平均总含量均具有显著性差异（P＜0.05），可以区分不同产地来源的样品。
表2 谷物醋样品中总酸和氨基酸含量测定结果
Table 2 Determination results of total acid and amino acids contents in cereal vinegar samples
注：同一行中的不同字母表示结果差异显著（P＜0.05）。“*”表示必需氨基酸。
镇江香醋 山西老陈醋 福建红曲醋 四川麸醋总酸含量/（g·100 mL-1）酸性氨基酸含量/（mg·100 mL-1）含羟基氨基酸含量/（mg·100 mL-1）脂肪族氨基酸含量/（mg·100 mL-1）碱性氨基酸含量/（mg·100 mL-1）芳香族氨基酸含量/（mg·100 mL-1）含硫氨基酸含量/（mg·100 mL-1）Asp Glu小计Thr*Ser小计Ala Pro Leu*Val*Ile*Gly小计Lys*His Arg小计Tyr Phe*小计Cys Met*小计GABA含量/（mg·100 mL-1）必需氨基酸含量/（mg·100 mL-1）非必需氨基酸含量/（mg·100 mL-1）总氨基酸含量/（mg·100 mL-1）5.20a±0.69 24.21bc±4.43 67.98c±6.81 92.19c±7.74 19.75b±1.14 5.88c±0.74 25.63c±1.51 85.38b±5.93 21.18b±2.70 61.6c±3.51 44.29c±2.29 29.23c±1.62 21.95b±1.13 263.63b±14.46 23.15c±1.46 5.05b±0.97 40.87c±4.78 69.07c±5.52 10.11b±2.04 17.25b±1.33 27.36b±3.11 0.37a±0.06 6.53a±0.86 6.89a±0.91 9.80a±1.59 201.79c±38.21 292.77c±32.11 494.56c±23.52 4.93a±0.79 14.94ab±2.39 43.93b±4.33 58.87b±5.63 13.19a±0.79 3.66b±0.40 16.84b±0.97 80.42b±4.81 20.17b±1.71 45.07b±2.30 34.27b±0.96 19.85b±0.93 20.00b±1.25 219.77b±8.20 10.82b±1.80 3.60ab±0.72 14.40b±3.17 28.82b±5.11 4.84ab±0.76 19.21b±1.44 24.06b±1.67 0.47a±0.09 5.73a±0.59 6.20a±0.62 33.04b±4.38 148.13b±13.60 239.47b±21.23 387.60b±12.98 5.59a±0.90 8.72a±0.71 23.67a±4.01 32.39a±3.80 10.47a±1.21 1.55a±0.32 12.02a±1.36 53.76a±3.99 6.93a±1.05 27.43a±2.36 22.84a±1.22 13.82a±1.01 15.64a±1.12 140.40a±9.32 2.26a±0.42 1.26a±0.14 1.00a±0.57 4.52a±0.91 2.93a±0.60 10.08a±0.89 13.01a±0.94 0.35a±0.10 4.23a±0.62 4.58a±0.65 11.16a±0.97 91.11a±16.71 126.96a±15.54 218.07a±14.41 5.24a±0.97 31.98c±5.12 84.07c±7.26 116.05d±7.34 30.62c±2.04 5.82c±0.60 36.43d±2.10 177.03c±11.02 45.02c±2.93 88.66d±6.89 77.41d±3.67 48.05d±2.64 40.56c±2.29 476.72c±26.12 26.13c±4.04 9.92c±1.54 40.85c±4.17 76.91c±6.87 19.52c±3.37 28.44c±1.52 47.96c±2.66 1.34b±0.18 19.09b±1.38 20.43b±1.48 58.97c±9.96 318.39d±47.16 515.08d±43.69 833.47d±34.97
4类谷物醋样品中游离氨基酸含量最高的是丙氨酸，为53.76～177.03 mg/100 mL，谷氨酸含量为23.67～84.07 mg/100 mL，亮氨酸含量为27.43～88.66 mg/100 mL，缬氨酸含量为22.84～77.41 mg/100 mL。上述四种氨基酸之和占总氨基酸含量的51.3%～58.6%。
4种谷物醋样品中必需氨基酸含量为91.11～318.39 mg/100 mL，非必需氨基酸含量为126.96～515.08 mg/100 mL。4种谷物醋样品中必需氨基酸/总氨基酸为38%～42%，符合世界卫生组织推荐人体蛋白质氨基酸最佳模式。必需氨基酸/非必需氨基酸为62%～72%，符合世界卫生组织推荐人体蛋白质氨基酸最佳模式。
4种谷物醋样品中总酸含量为4.93～5.59 g/100 mL，GABA含量9.80～58.97 mg/100 mL。
2.2 四种传统发酵谷物醋游离氨基酸组成的层次聚类分析
采用层次聚类分析（hierarchical clustering analysis，HCA）方法对40个样品氨基酸组成进行聚类，距离函数采用平方欧式距离，连接标准采用加权组平均法（weighted pair group method with arithmetic mean，WPGMA）。四种传统发酵谷物醋共40个样品中18种氨基酸的含量聚类分析结果见图1。由图1可知，除了19号和41号样品以外，其他样品均聚类良好。
图1 四种传统发酵谷物醋基于游离氨基酸的层次聚类分析
Fig.1 Hierarchical cluster analysis of four traditional fermented vinegars based on free amino
右边数字为样品编号，颜色代表不同种类谷物醋产品。
2.3 四种传统发酵谷物醋游离氨基酸组成的主成分分析
主成分分析（PCA），结果见图2。由图2可知，前三个主成分的累计方差贡献率为83.56%（PC1=65.53%，PC2=11.22%，PC3=6.81%）。由图2a可知，前两个主成分的方差贡献率为76.75%，可以解释76.75%的总变异。在氨基酸分布上，PC1与所有氨基酸呈正相关，与Thr、Ala、Pro、Leu、Val、Ile、Gly和Met呈显著正相关（载荷值＞0.8）。PC2与Arg、Ser、Asp、Lys、Tyr、Glu、His、Leu呈正相关（载荷值＞0.6）。由图2b可知，4个谷物醋样品之间基本上是分开的。在第一象限，镇江香醋与5种氨基酸（Asp、Ser、Arg、Lys、Glu）相近，这5种氨基酸在供试样品中的含量相对较高。在第四象限，四川麸醋与8种氨基酸（Met、Thr、Leu、Val、Ile、Gly、Pro和Ala）高度相关。山西老陈醋和福建红曲醋未能找到其对应的特征氨基酸。
图2 四种传统发酵谷物醋样品游离氨基酸组成的主成分分析载荷图（a）及得分图（b）
Fig.2 Load plots (a) and score plots (b) of principal component analysis of free amino acid composition of four traditional fermented cereal vinegar samples
2.4 四种传统发酵谷物醋游离氨基酸组成的线性判别分析
对包含40个谷物醋样品和18个变量（检测到的氨基酸）的数据集进行线性判别分析（LDA），结果见图3。通过逐步分析选择最显著的变量，发现GABA、Ser、Leu、Val、Ile、Lys、His、Cys和Met是对样品分类效果最好的变量。特征值表明，得到了解释100%总方差的三个典型判别函数（函数1，68.1%；函数2，23.5%；函数3，8.4%）。判别函数1、2和3的Wilks's Lambda因子数值分别为0.003、0.054和0.342（P=0.000），表明该模型具有良好的判别能力。每个区域的Fisher线性判别函数如下：
图3 谷物醋样品游离氨基酸组成的线性判别分析散点图
Fig.3 Scatter plots of linear discrimination analysis of free amino acid composition of cereal vinegar samples
组1（镇江香醋）=0.554GABA+2.499Ser+0.348Leu+1.150Val-1.178Ile+1.011Lys+2.661His-9.892Cys-2.398Met-39.193
组2（山西老陈醋）=0.842GABA+1.856Ser+0.272Leu+1.616Val-2.244Ile+0.935Lys+2.718His+0.951Cys-2.502Met-33.239
组3（福建红曲醋）=0.081GABA-0.066Ser-0.060Leu+0.747Val-0.263Ile-0.151Lys+0.485His+1.748Cys-0.024Met-8.075
组4（四川麸醋）=1.078GABA+1.227Ser-0.158Leu+3.235Val-2.857Ile+0.950Lys+4.281His+1.583Cys-1.193Met-109.611
由图3可知，通过排名前3的三个判别函数得分，检验了不同种类谷物醋在判别空间中的分离度，4种谷物醋样相互分开，说明4种谷物醋之间存在的差异，同一种谷物醋具有明显的区域聚集性，说明同一种酒样氨基酸组成存在一定的相似。
采用留一法交叉验证（leave-one-out cross-validation，LOO-CV）进行模型交叉验证判别分析，结果见表3。由表3可知，采用典型函数，能将100%的原始样本进行正确分类，从交叉验证结果可以看出，模型的总体判别正确率为97.6%。
表3 分类矩阵和交叉验证结果
Table 3 Results of classification matrix and cross-validation
种类预测组镇江香醋/个山西陈醋/个福建红曲醋/个四川麸醋/个总计/个13 0原始样本镇江香醋山西陈醋福建红曲醋四川麸醋0 0 0 11 13 11 0 0 0 0 8 0 0 0 0 8 8 8正确率/%100 13 100 100交互验证分类镇江香醋山西陈醋福建红曲醋四川麸醋0 0 0 100 0 10 100 13 11 0 0 0 1 8 0 0 0 0 8 8 8正确率/%100 90.9 100 100 97.6
3 讨论
我国市场上有超过20多种的谷物醋，每一种产品都有自己的特色风味。研究表明，来自四个地区的谷物醋中游离氨基酸含量差异显著（P＜0.05）。在本研究中，镇江地区的12个样本可被划分为3组（见图1），说明同一个地区的相同类型谷物醋之间存在差异。在前期研究中，通过分析挥发性化合物组成，同样可将12个镇江香醋样品分为3组[12]。结果表明，同一地区谷物醋的差异没有不同地区的谷物醋之间的差异显著。
在本研究中，来自四个地区的谷物醋的游离氨基酸组成的差异可以归因于原料、发酵工艺和微生物组成。首先，尽管被称为谷物醋，但来自不同地区的谷物醋使用了各种不同的原料，如糯米、高粱、麦皮和红曲大米。因此，小麦麸皮（6%～10%）、高粱（4%～6%）和红曲米（1.5%）的总游离氨基酸含量对最终产品的影响是不容忽视的[21-23]。VALERO E等[14]于2005年报告了原料对谷物醋中氨基酸和挥发性化合物的影响。其次，谷物醋的氨基酸组成受发酵工艺的影响。我国大部分传统发酵谷物醋采用固态发酵（solid-state fermentation，SSF）工艺生产[1]，还有玫瑰醋等一部分有些谷物醋通过液体深层发酵（submerged fermentation，SMF）工艺生产[24]。在谷物醋固态发酵过程中，不同微生物的共存为风味物质和功能化合物的合成提供了大量的酶[25]。在本研究中，SMF（70 d）和SSF（3年）相结合的红曲醋发酵工艺与其他三种谷物醋的发酵工艺显著不同。此外，其他三种谷物醋产品的SSF工艺也存在差异[26]。在镇江香醋的发酵过程中，采用了独特的“套醪接种”循环接种方式[25]，而在山西老陈醋生产过程中会采用熏醅工艺获得独特的风味（85 ℃下6 d）[27-28]。与其他大多数发酵工艺不同的是，四川麸醋采用由中草药发酵制备的“醋曲”，然后与麸皮混合[26]。因此，发酵工艺的不同可能会产生影响。另外，不同地区生产谷物醋的SSF技术的不同还会导致发酵过程中微生物组成的多样性。用培养和非培养的方法研究了山西老陈醋和镇江香醋在醋酸发酵过程中微生物群落的结构和动态，结果显示出明显的差异[25，27]。上述这些因素都造成了谷物醋产品氨基酸组成的差异。此外，样品的氨基酸图谱不仅受原料和发酵工艺的影响，还受其他因素的影响，如陈酿时间。一些研究报道了陈酿时间和谷物醋味道之间的关系[29-30]。
4 结论
四种传统发酵谷物醋的游离氨基酸和GABA含量具有显著差异（P＜0.05）。结果表明，采用主成分分析可以区分各类谷物醋产品的特征氨基酸种类为GABA、丝氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、胱氨酸和蛋氨酸。采用基于特征变量的线性判别分析，能够对四种不同传统谷物醋进行正确分类，成功率为100%。
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