高粱（Sorghum bicolor（L.）Moench）是世界第五大谷类作物，也是我国重要的粮饲作物，因具有广泛的适应性和较强的抗逆能力，在中国栽培范围较广[1]。高粱按照用途可分为四类：粒用高粱、甜高粱、草高粱和工艺用高粱，粒用高粱可供食用、饲用和酿酒，随着经济社会的发展和人民生活水平的提高，粒用高粱的主要用途逐步从食用转变为酿造原料，高粱籽粒是中国名优白酒酿造的重要原料[2]。高粱根据所含直链淀粉和支链淀粉比例的不同，可分为粳高粱和糯高粱[3]。中国东北地区（内蒙古、黑龙江、吉林和辽宁）四季分明，土壤肥沃，是优质粳高粱主产区[4]；四川川南地区（自贡、宜宾和泸州）气候温和、热量丰足、雨量充沛、光照适宜，盛产酿酒专用糯高粱，也是中国优质浓香型白酒主产区[5]。
高粱是一种含氰作物，生氰作用（cyanogenesisi）是指植物具有合成生氰化合物并能水解释放氢氰酸（HCN）的能力。生氰糖苷（cyanogentic glycosides）是由氰醇衍生物的羟基和D-葡萄糖缩合形成的糖苷，其在高粱中以蜀黍氰苷（对羟基苯甲醛氰醇葡萄糖苷）的形式存在[6]。在白酒酿造过程中，高粱籽粒中的蜀黍氰苷经β-葡萄糖苷酶酶解或高温裂解最终可生成氰化物，因沸点较低，在蒸酒过程中极易进入到酒体中。研究发现，氰化物是2A类致癌物氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）的一种重要前体物[7]，从而对人体造成危害。研究酿酒高粱中蜀黍氰苷含量对于控制白酒中氰化物、EC含量具有重要意义[8]。曹帅等[9]研究发现，产地为中国中部、东北部和西南部的6个高粱中蜀黍苷降解生成的氰化物含量在327.90～1 599.89 μg/kg之间。张顺荣[7]分析了产地为中国、加拿大和澳大利亚的9个酿酒高粱中蜀黍苷含量，发现不同品种酿酒高粱中蜀黍苷含量不同，范围为4.52～19.28 mg/kg。
中国白酒酿造工艺传统、复杂，EC广泛存在于各种香型的白酒中[7]，如何在不改变原有生产工艺、不影响酒体风格的前提下有效降低EC含量，是白酒行业面临的共同难题[8]。本研究采用高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）对东北地区和川南地区39个高粱样品中的蜀黍苷含量进行了测定，比较不同产地、不同品种高粱中蜀黍氰苷的含量差异，并对不同产地的高粱进行酿酒试验，研究酒体中氰化物及EC含量，以期为白酒生产企业探寻优质原料源、建设酿酒专用粮基地、提高产品安全水平提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
1～31号高粱样品：市售；32～39号高粱样品：由宜宾市农业科学院提供。本实验所用高粱样品产地与品种信息见表1。
表1 本实验所用高粱样品信息
Table 1 Information of sorghum samples used in the experiments
编号 产地 品种 种类 编号 产地 品种 种类1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20吉林吉林吉林吉林吉林吉林内蒙古内蒙古内蒙古内蒙古辽宁辽宁辽宁辽宁辽宁黑龙江黑龙江黑龙江四川宜宾四川宜宾德杂10号凤杂13号禾粮一号吉杂305吉杂127吉杂124赤杂101赤杂107内杂5号敖杂1号辽糯11辽杂37辽杂19号辽粘3号辽杂10号龙杂19号绥杂7号齐杂722号川糯粮1号红缨子杂交粳高粱杂交粳高粱杂交粳高粱杂交粳高粱杂交粳高粱杂交粳高粱杂交粳高粱杂交粳高粱杂交粳高粱杂交粳高粱杂交糯高粱杂交粳高粱杂交粳高粱杂交糯高粱杂交粳高粱杂交粳高粱杂交粳高粱杂交粳高粱杂交糯高粱常规糯高粱21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39四川宜宾四川泸州四川宜宾四川自贡四川自贡四川宜宾四川泸州四川宜宾四川泸州四川泸州四川宜宾四川宜宾四川宜宾四川宜宾四川宜宾四川宜宾四川宜宾四川宜宾四川宜宾金糯粮1号泸糯8号宜糯红1号宜糯红2号宜糯红4号宜糯红4号红选1号江安红泸糯8号泸州红1号青壳洋沈杂5号辽糯11辽杂37辽杂19号辽粘3号冀酿3号晋糯3号辽杂10号杂交糯高粱杂交糯高粱杂交糯高粱常规糯高粱常规糯高粱常规糯高粱常规糯高粱常规糯高粱杂交糯高粱常规糯高粱常规糯高粱杂交粳高粱杂交糯高粱杂交粳高粱杂交粳高粱杂交糯高粱杂交糯高粱杂交糯高粱杂交粳高粱
1.1.2 化学试剂
蜀黍氰苷（纯度95%）、D5-氨基甲酸乙酯（纯度98%）：美国Sigma-Aldrich公司；氨基甲酸乙酯（纯度99%）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；水中氰化物标准溶液（CN-质量浓度为50 mg/L）：中国计量科学研究院；正己烷、乙酸乙酯、乙醚（均为色谱纯）；磷酸、氯胺T（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；甲醇（色谱纯）：德国Merck公司。
1.2 仪器与设备
7890A型气相色谱仪、7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；ExionLC-5500型三重四级杆液相色谱-串联质谱联用仪：美国AB Sciex公司；DMA 35型手持式密度计：奥地利安东帕公司；SBEQ-CG1012型固相萃取装置：上海安谱实验科技股份有限公司；SHB ⅢA型循环水式真空泵：杭州大卫科教仪器有限公司；TTL-DCⅡ型氮吹仪：北京同泰联科技发展有限公司；Milli-Q型超纯水仪：美国Millipore公司；ML1602型百分之一分析天平、AE200型万分之一分析天平：梅特勒-托利多科技（中国）有限公司；LRH-250型生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；FSJ-Ⅱ型锤片式粮食粉碎机：中储粮成都粮食贮藏科学研究院；YM-060S型超声波清洗机：深圳市雨盟超声波清洗机设备厂。
1.3 方法
1.3.1 高粱中蜀黍氰苷含量的测定
分别将39种高粱（编号为1～39）经过粉碎机粉碎，过120目筛，每种样品称取1.50 g，分别采用20 mL甲醇水溶液（95∶5，V/V）超声提取1 h，8 000 r/min离心10 min，取上清液0.4 mL，用超纯水稀释3倍，经0.2 μm滤膜过滤后进三重四级杆液相色谱-质谱联用仪，分析39种高粱样品中蜀黍氰苷含量[10]。
1.3.2 酿酒试验
试验在宜宾地区某酒厂小试基地进行，将8口小窖池（1.2 m×1.2 m×1.2 m）分成两个组（1组和2组），每组4口，其中1组以东北地区高粱为高粱原料，2组以川南地区高粱为高粱原料，另四种原料（小麦、大米、玉米、糯米）相同，两个组均按照五粮浓香型白酒生产工艺进行酿酒试验，进行4轮试验，每口窖池的每轮白酒蒸馏出来后，原酒取样，进行分析测定。
1.3.3 分析检测
酒精度：采用手持式密度计测定；氰化物含量：按GB 5009.36—2016《食品安全国家标准食品中氰化物的测定》中气相色谱法测定[11]。EC含量：将酒样密封，置于28 ℃恒温培养箱中贮存1年，按照GB 5009.223—2014《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》[12]中的方法测定。
1.3.4 数据处理
采用Excel 2016分析数据，绘制柱形图，并用SPSS 24.0数据分析软件对数据进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 不同产地及品种高粱中蜀黍氰苷含量的差异化分析
测定39个不同产地及品种高粱中蜀黍氰苷含量，结果见图1。
图1 不同产地及品种高粱中蜀黍氰苷含量测定结果
Fig.1 Determination results of dhurrin contents in sorghum from different producing areas and varieties
由图1可知，不同产地及品种高粱中蜀黍氰苷含量有较大差异，范围为0.31～13.16 mg/kg。其中，产地为吉林的“凤杂13号”和产地为辽宁的“辽糯11”高粱中蜀黍氰苷平均含量较高，分别为13.16 mg/kg和12.14 mg/kg，产地为四川宜宾的“宜糯红2号”、“宜糯红4号”、“青壳洋”和“辽杂37”高粱中蜀黍氰苷平均含量极低，分别为0.82 mg/kg、0.96 mg/kg、0.58 mg/kg和0.31 mg/kg。
2.2 同一品种、不同产地高粱中蜀黍氰苷的含量
分析同一品种、不同产地的高粱中蜀黍苷含量，结果见表2。
表2 同一品种、不同产地的高粱中蜀黍氰苷含量测定结果
Table 2 Determination results of dhurrin contents in sorghum from the same variety and different producing areas
注：“**”表示差异极显著（P＜0.01）。下同。
品种 产地 蜀黍氰苷含量/（mg·kg-1）辽糯11辽杂37辽杂19号辽粘3号辽杂10号辽宁四川宜宾辽宁四川宜宾辽宁四川宜宾辽宁四川宜宾辽宁四川宜宾12.14 1.37**5.64 0.31**4.68 2.15**6.64 1.41**5.16 2.24**
由表2可知，产地不同极显著影响高粱中蜀黍氰苷的含量（P＜0.01）。“辽糯11”、“辽杂37”等5个品种的高粱在辽宁省种植时，籽粒中蜀黍氰苷平均含量显著高于在四川宜宾种植时的含量。辽宁省位于中国东北部，四川宜宾地处中国西南部，两地气候特征和作物种植方式等相差较大：辽宁省全年平均气温比四川宜宾大约低10 ℃，四川宜宾的年降水量为辽宁省的1.5～2.5倍，而年日照时长不及辽宁省的二分之一[13-14]；辽宁省平原地区土地宽广肥沃，农业种植机械化程度较高[15-16]，宜宾市位于四川盆地南缘，全市地貌以中低山地和丘陵为主体，农作物耕种机械化水平不高[17-18]。有文献报道，高粱中氰含量高于同属的苏丹草，叶片的含氰量高于其他部位，分蘖中的氰含量更高，提高氮肥施用量不仅能显著增加高粱的叶片数、茎粗、总绿物质和干物质产量等，还能引起饲草高粱氰含量的升高，水分限制也是高粱中蜀黍氰苷浓度的重要决定因素，旱地饲草高粱的含氰量高于灌溉区高粱[19-21]。初步推测，同一品种、不同产地的高粱中蜀黍氰苷含量差异显著，可能和两地气候、地形地貌和种植方式等因素有关[5，20]。
2.3 东北地区与川南地区高粱中蜀黍氰苷的含量
对东北地区（内蒙古、黑龙江、吉林和辽宁）和川南地区（自贡、宜宾和泸州）高粱中蜀黍苷含量进行统计分析，结果见表3。
表3 东北地区和川南地区高粱中蜀黍氰苷含量测定结果
Table 3 Determination results of dhurrin contents in sorghum from northeast China and southern Sichuan mg/kg
产地 样品个数 平均值 中位数 P95下限 P95上限 范围东北地区川南地区18 21 6.71 1.75**5.94 1.41 5.31 1.27 8.11 2.23 2.53～13.16 0.31～4.28
由表3可知，东北地区高粱中蜀黍氰苷含量普遍较高，其平均含量极显著高于川南地区高粱中蜀黍氰苷平均含量（P＜0.01）。饲草高粱中含氰化合物积累影响因素的研究较多，与根、径、叶相比，蜀黍氰苷在高粱籽粒中的含量较低[22-23]，有文献报道，高粱籽粒中蜀黍氰苷的含量随着籽粒成熟而降低；作物蒸散量与降水量之间的差值越大，高粱籽粒中蜀黍氰苷含量越高；高粱成熟期，浅层地下水水位越深，籽粒中蜀黍氰苷积累量越大[24]。初步推测，高粱籽粒中蜀黍氰苷积累可能和品种、氮肥施用量、种植地气候特点等因素有关[21，24]，还有待进一步研究。
2.4 酿酒试验结果与分析
测定8口窖池四轮酿酒试验的32个原酒样品酒精度，结果发现，原酒酒精度差别较小，约为70%vol。测定新酒中氰化物含量，结果见表4，酒样于28 ℃下贮存1年后测定EC含量，结果见表5。
表4 不同产地及品种高粱酿造白酒酒样中氰化物含量测定结果
Table 4 Determination results of cyanide contents in Baijiu samples brewed by sorghum from different producing areas and varieties μg/L
样品 个数 平均值 中位数 P95下限 P95上限 范围1组酒样2组酒样16 16 620.55 203.38**633.35 216.80 581.55 177.14 659.55 229.14 467.10～712.90 106.00～258.40
表5 不同产地及品种高粱酿造白酒酒样中氨基甲酸乙酯含量测定结果
Table 5 Determination results of ethyl carbamate contents in Baijiu samples brewed by sorghum from different producing areas and varieties μg/kg
样品 个数 平均值 中位数 P95下限 P95上限 范围1组酒样2组酒样16 16 365.65 232.95**367.16 235.67 350.68 214.67 380.61 251.23 307.69～402.54 160.92～304.42
白酒中含有一定量的EC，贮存阶段是白酒中EC生成的重要时期。高粱籽粒中的蜀黍氰苷是白酒中氰化物的前体物，氰化物又是EC的重要前驱物。采用蜀黍氰苷含量低的高粱作为酿酒原料，可降低白酒中氰化物和EC含量[4-5]。东北地区高粱中蜀黍氰苷含量普遍较高，川南地区高粱中蜀黍苷含量相对较低，本试验的1组酒样采用东北地区高粱作为酿造高粱原料，2组酒样采用川南高粱作为酿造高粱原料，由表4和表5可知，2组酒样中氰化物平均含量极显著低于1组酒样（P＜0.01），贮存1年后，2组酒样中平均EC含量极著低于1组酒样（P＜0.01）。结果表明，选用川南地区高粱作为酿酒原料，可有效降低白酒中氰化物及EC含量。
3 结论
在本试验中，以东北地区和川南地区39个高粱样品为研究对象，比较分析了不同产地、不同品种高粱中蜀黍氰苷的含量差异，并进一步对不同产地高粱进行酿酒试验，探讨酒体中氰化物及EC含量差异。结果表明，不同产地及品种高粱中蜀黍氰苷含量有较大差异，产地极显著影响高粱中蜀黍氰苷的含量（P＜0.01），川南地区高粱中蜀黍苷平均含量极显著低于东北地区高粱中蜀黍氰苷含量（P＜0.01），和东北地区高粱相比，采用川南高粱作为酿造高粱原料，酒体中氰化物及EC含量极显著降低（P＜0.01）。白酒生产企业选择川南高粱作为酿酒原料，可有效降低酒体中EC含量，提高产品质量与安全水平。
四川川南地区是酿酒专用糯高粱主产区，学者对酿酒高粱的研究大多数集中在香气成分、营养组成、单宁含量、蒸煮特性和产酒率等方面[25]。本研究从蜀黍氰苷含量角度证实了四川川南地区种植的高粱为优质酿酒原料，为白酒生产企业建设酿酒专用粮基地、收购优质高粱原料、提高产品质量和安全水平提供了理论参考和实践依据，具有重要的实际应用价值。
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