浓香型白酒以其饱满和谐的风味口感屹立于世界酒林中[1]。酿造白酒的原料较多，不同原料酿造白酒风味物质的分布和含量并不同，也决定白酒的香气和口味[2-4]。六粮浓香型白酒由于采用高粱、大麦、小麦、玉米、大米、糯米为原料，所使用的原料比传统五粮多一味大麦，酒醅经长期循环发酵，积累了大量的酿酒原料分解残存物、微生物菌体自溶物及代谢产物等风味前体物质，所以酒喝起来更醇、更厚、更绵柔，使其市场占有率逐年提高。环境信息是以酒醅为载体[5]，调控着窖池微生物种类的变化、代谢物质的形成。酒醅酸度、淀粉、还原糖、水分、总酯等是评价酒醅发酵情况的重要理化指标[6-7]，能直接反映出窖池内部发酵进程的好坏。近年来，酒醅的理化参数、微生物群落演替以及酒醅中挥发性香气成分受到研究者的关注[8-9]。但目前对六粮浓香型白酒酒醅的相关报道还较少。
六粮浓香型白酒发酵机理复杂，窖内不同部位酒醅其发酵进程亦不同。在实际生产过程中，六粮浓香型白酒大多数是针对入窖酒醅和出窖酒醅理化数据的监测研究，而对窖内发酵过程酒醅的研究则相对较少，这就导致无法深入了解窖内发酵过程“物系、酶系、菌系”发生了何种变化，更不易找到各项理化指标之间的相互关系。
基于目前对六粮浓香型白酒窖内不同部位酒醅的研究较匮乏。本试验以研究六粮浓香型白酒发酵酒醅时间和空间的差异性为目的，系统地分析了六粮浓香型酒醅一个发酵周期中边缘酒醅和中心酒醅理化指标随时间的动态变化过程，以期为深入解析窖内发酵机理提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
酒醅样本：来自四川中部地区某六粮浓香型白酒生产企业30年窖龄的窖池，随机取3个窖池的酒醅，作为平行样。酒醅样品信息见表1。
表1 酒醅样品信息
Table 1 Information of fermented grains sample
注：EJP为窖池边缘酒醅，CJP为窖池中心酒醅。
取样时间/d 0 d 8 d 18 d 33 d 54 d 76 d窖池1 EJP窖池2 EJP CJP CJP窖池3 EJP CJP 1-E0 1-E8 1-E18 1-E33 1-E54 1-E76 1-C0 1-C8 1-C18 1-C33 1-C54 1-C76 2-E0 2-E8 2-E18 2-E33 2-E54 2-E76 2-C0 2-C8 2-C18 2-C33 2-C54 2-C76 3-E0 3-E8 3-E18 3-E33 3-E54 3-E76 3-C0 3-C8 3-C18 3-C33 3-C54 3-C76
1.1.2 试剂
乙醇、葡萄糖、浓盐酸、次甲基蓝、邻苯二甲酸氢钾、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、五水硫酸铜、氢氧化钠、碳酸钠、浓硫酸、氯化钠（均为分析纯）：成都科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
AR2140电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；GZX-9420MBE电热恒温鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；PHS-3C酸度计：上海博取仪器有限公司；MYP11-2A恒温磁力搅拌器：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；LRH-250生化培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；5430R高速离心机：德国Eppendorf公司；A360紫外分光光度计：上海翱艺仪器有限公司；HYC-260医用冷藏箱：青岛海尔特种电器有限公司；MH-500电热套：北京科伟永兴仪器有限公司；HW326恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 采样方法
随机选取冬季3个正常发酵池进行跟踪取样，发酵周期76 d，选取了6个发酵时间点（0 d、8 d、18 d、33 d、54 d和76 d），每个时间点分别从每个窖池中部和边缘采集酒醅样本，按窖池深度差异分为上（距窖顶50～60 cm）、中（距窖顶160～170 cm）、下（距窖底20～30 cm）三个点进行混合（上中下的边缘酒醅混合，上中下的边缘酒醅混合）作为代表样本，储存在-20 ℃冰箱中供进一步使用。
1.3.2 理化指标的测定
水分测定采用热风干燥质量恒定法[10]；酸度测定采用酸碱电位滴定法[11]，定义为10 g酒醅消耗0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液的毫摩尔数；淀粉含量测定采用酸水解法[11]，以湿醅计；总酯含量测定采用皂化返滴定法[12]；用测温计测量取样点附近的温度。
1.3.3 试验数据处理方法
试验结果用“平均值±标准差”表示。在此利用SPSS 26.0软件对数据进行系统分析，采用SIMCA-P 14软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA），同时建立偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）模型。将所有数据导出用Origin 8.0作图。
2 结果与分析
2.1 酒醅发酵过程温度变化曲线
通过实时监测温度变化情况对固态发酵进行阶段性的划分，以期针对具体的参数变化调节工艺，酒醅发酵过程的温度变化曲线见图1。由图1可知，酒醅发酵过程可分为三个阶段，包括前发酵期、发酵稳定期和缓落阶段。发酵早期由于微生物群落的蓬勃生长，产生了大量的生物热，导致温度升高[14]。此外，根据一阶导数曲线与温度的关系（y=-0.078 4x+26.94），第8天和第18天左右分别被确定为具有最大上升和下降速率的时间点，而第33天和第54天分别在最后两个阶段变化较小。因此，以发酵关键点为主线确定采样时间，选择上述四个发酵时间点采集酒醅样品。
图1 酒醅发酵过程温度的动态变化
Fig.1 Dynamic changes of fermented grains temperature during fermentation process
2.2 发酵过程酒醅理化指标主成分分析
酒醅理化指标（水分、酸度、还原糖、淀粉、总酯）的变化与酒醅微生物生长代谢有紧密的关系。酒醅理化指标的变化可以反映出发酵进程情况，酒醅糖化酶、酯化酶可以影响物质的转化，从而对香味物质的形成产生深刻的影响。主成分分析可以反映出各个因素对结果影响作用的大小[15]。对整个发酵过程36个酒醅样品的理化指标进行主成分分析，结果见图2。
图2 发酵过程酒醅理化指标主成分分析结果
Fig.2 Principal components analysis results of physicochemical indexes of fermented grains in fermentation process
由图2可知，从6个不同发酵时间采集的酒醅样品大致可分为三个区域，从0～18 d采集的样本集相互聚集位于一、四象限，发酵54～76 d采集的样本聚集在第二象限，第33天采集的样本单独聚为一类，位于第三象限，可以将酒醅发酵阶段明显的区分开来。同时，边缘酒醅和中心酒醅分布较为集中，分别位于y轴正轴和x轴负轴附近。因此，整个发酵过程可分为三个阶段，分别对应于发酵前期（0～18 d）、发酵中期（18～54 d）和发酵末期（54～76 d）。
2.3 发酵过程酒醅理化指标的偏最小二乘-判别分析
基于酒醅理化物质的主成分分析模型仅可对酒醅发酵阶段进行判别。因此，应需结合多种分析方法进一步筛选对发酵周期影响最大的因素。PLS-DA是指采用偏最小二乘回归的一种判别方法，可以用来预测分类变量，并进行有监督的分析。变量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）分析值用来衡量PLS-DA的每个变量对分类的贡献度，并用以筛选最重要的分类变量。VIP值越高，则认为特征变量在不同产地间差别越明显。酒醅发酵理化物质PLS-DA结果见图3。
图3 发酵过程酒醅的理化指标偏最小二乘－判别分析结果
Fig.3 Partial least squares-discriminant analysis results of physicochemical indexes in fermentation process
由图3可知，以VIP＞1为尺度，可以得到水分、酸度、还原糖、总酯、淀粉5种特征变量对于模型分析都具有意义，这说明对整个发酵周期影响较大的指标主要为上述5种物质。因此，应进一步详细剖析这五种重要物质在边缘酒醅和中心酒醅发酵过程中的差异。
2.4 不同部位酒醅的发酵阶段特征
2.4.1 六粮浓香型白酒发酵过程中酒醅水分含量的变化
酒醅水分对出酒率和酒质等有重要意义，酒醅水分不足会使发酵不能够正常进行[16]。研究窖内酒醅发酵过程中水分含量的变化，结果见图4。由图4可知，相同发酵时间，窖池不同部位酒醅水分含量在整个发酵过程无显著差异（P＞0.05）。酒醅水分含量随着发酵时间的延长呈先增后降的变化趋势，边缘酒醅和中心酒醅在发酵18 d时分别上升至（71.08±2.83）%和（67.93±6.08）%，可能是由于酒醅淀粉被分解为还原糖后，淀粉中的水分逐渐被释放出来，酵母菌等微生物进行乙醇发酵产生游离水，综合导致酒醅水分上升[17]。相同部位酒醅水分含量发酵中期显著高于发酵前期（P＜0.05），其变化结果与宋瑞滨等[18]的研究结果一致。发酵后期（54～76 d）酒醅水分迅速下降，可能是因为微生物利用发酵前期产生的有益物质迅速生长繁殖，厌氧发酵消耗酒醅中的水分，使酒醅中的水分大量开始沉降[19]。
图4 六粮浓香型白酒发酵过程中酒醅水分含量的变化
Fig.4 Changes of moisture contents of fermented grains of strongflavor Baijiu with six-grain during fermentation process
EJP：大写字母；CJP：小写字母，不同大写或小写字母表示差异显著
（P＜0.05）；“*”表示相同发酵时间边缘和中心酒醅差异显著（P＜0.05）。
下同。
2.4.2 六粮浓香型白酒发酵过程中酒醅还原糖含量的变化
酒醅还原糖的变化情况可以反映出酒精的生成情况。研究酒醅发酵过程中还原糖含量的变化，结果见图5。由图5可知，相同发酵时间，窖池不同部位酒醅还原糖含量在整个发酵过程无显著差异（P＞0.05）。在整个发酵过程中，酒醅还原糖含量整体呈先降后升再降的变化趋势，这与LI S等[20]的研究结果一致。在发酵前期（0～8 d），窖池不同部位酒醅还原糖含量均显著降低（P＜0.05），可能由于微生物糖化作用迅速，还原糖被快速消耗而大幅度减少。在发酵中期（8～18 d），微生物分解的淀粉酶使淀粉水解产生大量还原糖，使边缘酒醅和中心酒醅还原糖含量快速增长，随后于第54天下降至最小值（0.03±0.1）g/100 mL和（0.02±0.01）g/100 mL，发酵54 d后，窖内氧气逐渐被消耗，酵母菌等厌氧微生物开始利用还原糖进行发酵，酒醅还原糖消耗速率与生成速率平衡，酒醅还原糖含量趋于稳定[21]。
图5 六粮浓香型白酒发酵过程中酒醅还原糖含量变化
Fig.5 Changes of reducing sugar contents in fermented grains of strong-flavor Baijiu with six-grain during fermentation process
2.4.3 六粮浓香型白酒发酵过程中酒醅酸度的变化
有机酸是六粮浓香型白酒的重要呈味物质，适量的有机酸可以使白酒风味饱满和谐。因此，酒醅酸度变化对研究窖内发酵情况具有重要意义。酒醅在发酵过程中酸度的变化见图6。
图6 六粮浓香型白酒发酵过程中酒醅酸度变化
Fig.6 Changes of acidity in fermented grains of strong-flavor Baijiu with six-grain during fermentation process
由图6可知，同一发酵时间，不同部位酒醅酸度在整个发酵过程中无显著性差异（P＞0.05）。同一部位酒醅总酸含量在发酵后期显著高于发酵前期和发酵中期（P＜0.05），这与王旭娜[22]的结果一致。发酵前期（0～18 d），边缘酒醅的总酸含量高于中心酒醅，可能是因为边缘酒醅靠近窖泥，窖泥中产酸微生物的作用导致酸度高于中心酒醅。在发酵中期（18～54 d），总酸含量先降低后迅速升高，边缘酒醅和中心酒醅分别于发酵第33天达到最小值（1.45±0.06）mmol/10 g和（1.7±0.06）mmol/10 g，可能是因为微生物生长活动需要大量营养物质，由于供糖不足，此时有机酸则作为能源物质被消耗，导致酸度下降。随着发酵的进行，产酸期的到来使得总酸含量快速增加，在发酵54 d时达到峰值。酒醅总酸含量在发酵后期有所改变，随着时间的推移，其含量呈现下降趋势，这可能是受到窖内酸类物质与醇类物质酯化作用的影响[23-24]。
2.4.4 六粮浓香型白酒发酵过程中酒醅淀粉含量的变化
酒醅中淀粉作为酿酒的主要碳源，变成单糖后可被微生物直接利用[25-26]。因此，酒醅淀粉变化对研究窖内发酵情况具有重要意义。本试验研究了酒醅在发酵过程中淀粉含量的变化规律，结果见图7。由图7可知，同一发酵时间不同部位酒醅淀粉含量在整个发酵过程中无显著性差异（P＞0.05）。不同部位酒醅淀粉含量均在发酵8～33 d显著降低（P＜0.05），随后淀粉消耗速率变缓，在发酵54～76 d含量缓慢上升，与张霞等[27]发现浓香型酒醅淀粉随发酵时间延长而逐渐降低有所差异。可能是由于发酵前期酒醅中的氧气和营养物质相对丰富，使得霉菌等好氧微生物数量大量提升，在代谢这一过程中也会随之产生较多的淀粉酶，从而使得酒醅中的淀粉含量迅速降低[28-29]，这说明酒醅发酵在0～33 d淀粉类物质的消耗最大，是发酵的最关键时期。随着发酵时间延长，窖内逐渐进入厌氧环境，好氧微生物和不耐受乙醇、高酸环境的微生物逐渐被淘汰，使得酒醅微生物代谢活动受到一定抑制，因此酒醅淀粉呈缓慢降低变化。然而，发酵后期（54～76 d）淀粉含量呈上升趋势，边缘酒醅和中心酒醅淀粉含量在第76天分别达到（11.35±1）%和（11.28±1）%，可能是因为发酵前期黄水不断沉降，黄水液位逐渐增加到达取样点后被抽出，水分含量的下降，导致酒醅淀粉含量快速上升，这也与水分含量的变化趋势相互印证。
图7 六粮浓香型白酒发酵过程中酒醅淀粉含量变化
Fig.7 Changes of starch contents in fermented grains of strong-flavor Baijiu with six-grain during fermentation process
2.4.5 六粮浓香型白酒发酵过程中酒醅总酯含量的变化
酒醅中的酯类物质是在酒曲以及脂肪酶催化作用下由酸和醇反应生成，酯的种类和数量决定着白酒的香味和风格[30-31]。发酵过程窖内酒醅总酯含量的变化规律见图8。由图8可知，相同发酵时间，不同部位酒醅总酯含量在整个发酵过程中无显著性差异（P＞0.05）。不同部位酒醅总酯含量均随发酵时间的延长呈先降后增的变化趋势，均在发酵中期（18～54 d）整体趋于稳定，在发酵后期（54～76 d）显著上升（P＜0.05）。边缘酒醅的总酯含量在发酵33～54 d略微下降，这可能是由于在发酵前中期，酒醅主要进行的是酯分解反应，酒醅中的酯类物质被窖内微生物利用，酒醅总酯消耗量高于生成量，导致边缘酒醅的总酯含量呈下降趋势[32]。酒醅总酯含量在发酵后期快速上升，可能是因为随着酒醅醇类物质和酸类物质的增加，酒醅中的挥发性酯类物质逐渐积累，说明该阶段仍存在酶促反应和非酶促反应，此变化规律与前人的研究结果一致[33]，因此，通过适当延长发酵期来改善六粮浓香型白酒质量是一种有效的策略。
图8 六粮浓香型白酒发酵过程中酒醅总酯含量变化
Fig.8 Changes of total ester contents in fermented grains of strongflavor Baijiu with six-grain during fermentation process
3 结论
对整个发酵周期六粮浓香型白酒酒醅的理化指标（水分、酸度、还原糖、总酯、淀粉）进行主成分分析，结果表明发酵周期可划分为发酵前期（0～18 d）、发酵中期（18～54 d）和发酵后期（54～76 d）三个阶段。相同发酵时间，不同部位酒醅的理化性质均不具有显著差异（P＞0.05）。不同部位酒醅水分含量随着发酵时间的延长均呈先增后降的趋势，不同部位酒醅还原糖及淀粉含量整体上均呈下降趋势。不同部位酒醅水分、总酸和总酯含量在发酵后期显著高于发酵前期（P＜0.05），相反，酒醅淀粉和还原糖含量在发酵前期显著高于发酵后期（P＜0.05）。可以通过适当延长发酵期来改善六粮浓香型白酒质量。
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