我国是世界上重要的葡萄酒消费国和生产国之一。多年来，国内特别是西北产区的葡萄酒长期存在颜色稳定性差、香气易损失、不耐陈酿等问题。因此，提高酿酒葡萄原料品质，生产高品质陈酿型葡萄酒一直以来受到广泛关注[1-3]。在自然或室内环境中使浆果脱水是一种提高葡萄品质的离藤脱水过程，在“旧世界国家”被广泛用于生产高品质的甜型葡萄酒和具有特殊香气的干型葡萄酒[4]。
葡萄在脱水过程中发生多种物理-化学变化，包括失水导致的浓缩效应以及在水分胁迫下代谢过程的变化等[5]。葡萄中的酚类物质会影响葡萄酒的颜色与口感[6]。作为红葡萄酒的主要呈色物质，花色苷的结构、含量及其与其他物质的相互作用影响葡萄酒的颜色演变[6]。除花色苷的降解外，脱水处理还可引起花色苷与其他酚类物质发生反应，提高花色苷稳定性[6]。酚酸、黄烷醇和黄酮醇在脱水过程中参与氧化、降解、聚合、缩合等反应，并最终影响葡萄酒的颜色与口感[7]。在脱水过程中，酚类物质代谢途径的相关基因产生差异性表达，离藤浆果通过调节特定的代谢过程来响应脱水造成的水分胁迫[8]。脱水过程中葡萄酚类化合物的变化是浓缩效应、酶促/非酶促降解、生物合成和水解反应等共同作用的结果[9]。
葡萄的挥发性风味成分对葡萄酒的香气质量至关重要。在葡萄脱水过程中，水分胁迫可改变浆果的细胞结构，从而影响细胞代谢[10]。被激活的脂氧合酶可以改变膜的通透性，参与脂质氧化并促进C6化合物的形成[11]。与乙醇脱氢酶活性相关的细胞基础代谢从有氧转变为无氧，导致乙醇、CO2和发酵副产物的产生[11]。脱水对葡萄的挥发性成分的影响与其质量损失率[12]、脱水速率[10]和温度[12]等因素有关。
赤霞珠是国内栽培面积最大、分布范围最广的酿酒葡萄品种[13]。目前，国内对酿酒葡萄在脱水过程中葡萄皮酚类物质和葡萄汁挥发性风味成分的变化研究较少，而这些成分影响葡萄酒的感官特性和品质。因此，本研究以赤霞珠葡萄为实验材料，通过测定脱水过程中葡萄理化指标、葡萄皮酚类化合物和葡萄汁挥发性风味成分含量变化，为提高赤霞珠品质进而酿造高品质陈酿型葡萄酒提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
赤霞珠葡萄：于2021年9月27日取自宁夏。还原糖含量（以葡萄糖计）为216.85 g/L，滴定酸（以酒石酸计）为6.13 g/L。
1.1.2 试剂
乙腈、甲醇（均为色谱纯）：美国Tedia公司；甲酸（色谱纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷标准品（纯度＞95%）：美国Sigma公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
LB32T手持糖度计：广州速为电子科技有限公司；FE20 pH计：美国梅特勒-托利多集团；Pilot3-6L真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；RAPidRVAP样品快速蒸发仪：德国Vacuubrand公司；UV1800紫外分光光度计、LC-20A高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（二极管阵列检测器）：日本岛津公司；顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPMEGC-MS）仪：美国安捷伦科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 葡萄脱水方法
葡萄采收后进行分选，选择无破损、无霉变的完整赤霞珠葡萄悬挂于阴凉干燥的室内进行脱水，保持通风，温度18～23 ℃，相对湿度53%～71%，每天及时去除腐烂霉变的果实。随机选择悬挂于室内不同位置的18个葡萄果穗，每天对选定果穗进行称质量，记录脱水过程中果实质量的变化，以质量损失率表示。分别在第0天（CK）、第7天（C7）、第14天（C14）、第21天（C21）和第28天（C28）采样，随机采集果穗任意部位无物理性损伤及霉变的果实500粒，储存于-80 ℃冰箱备用。
1.3.2 葡萄基本理化指标的测定
葡萄压榨后于4 ℃，10 000 r/min离心10 min后得到澄清葡萄汁，参考GB15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[14]测定还原糖及滴定酸含量；采用手持糖度计测定可溶性固形物含量；采用pH计测定pH值。
1.3.3 葡萄果皮总酚含量的测定
取-80 ℃冷冻保存的葡萄100粒，立即剥取葡萄皮，液氮冷冻研磨成粉末装于培养皿中，在冻干机中冻干24 h，取出保存于-80 ℃冰箱中，备用。
称取0.5 g葡萄干粉于50 mL离心管中，加入10 mL 0.1%盐酸-60%甲醇-水溶液，料液比为1∶20（g∶mL），超声提取30 min（30 ℃，40 Hz），离心10 min（4 ℃，10 000 r/min），收集上清液于离心管中，采用0.1%盐酸-60%甲醇-水溶液重复以上提取步骤两次，合并上清液，摇匀，储存于-80 ℃冰箱中。采用福林-肖卡法测定总酚[15]。结果以mg/L没食子酸计。
1.3.4 葡萄果皮花色苷含量的测定
参照岳泰新[16]的方法，准确称取0.500 g葡萄果皮冻干粉于50 mL离心管中，加入10 mL盐酸-甲醇-水溶液（1∶600∶399，V/V），30 ℃避光超声萃取30 min后，离心10 min（4 ℃，10 000 r/min），转移上清液，重复提取两次，合并上清液并摇匀，储存于-20 ℃冰箱中。参照YANG P等[17-19]的HPLC法测定花色苷含量，结果以μg/g果皮干质量计。
1.3.5 葡萄果皮单体酚含量的测定
参照唐国冬等[20]的方法，并适当进行修改。准确称取0.500g葡萄果皮冻干粉于50mL离心管中，加入0.5mL蒸馏水和4.5 mL乙酸乙酯，25 ℃条件下避光130 r/min振荡30 min，离心5 min（4 ℃，10 000 r/min），取上清液，重复提取4次，合并上清液，真空浓缩至干，甲醇定容至0.5 mL。参照YANG P等[17]的HPLC法测定单体酚含量。
1.3.6 葡萄汁挥发性风味成分的测定
参照马娜等[21]的HS-SPME-GC-MS法测定葡萄汁中挥发性风味成分。
1.3.7 数据处理及统计分析
采用统计分析软件SPSS 23.0进行方差分析（analysis of variance，ANOVA）和多重比较（Tukey检验），结果以“平均值±标准差”表示；采用GraphPad Prism 8.0.2绘图。
2 结果与分析
2.1 脱水过程中赤霞珠葡萄理化指标的变化
脱水过程中赤霞珠葡萄理化指标的变化见图1。由图1（A）～1（C）可知，赤霞珠葡萄在脱水过程中，质量损失率、可溶性固形物含量及还原糖含量逐渐增加，在脱水28 d时，质量损失率、可溶性固形物含量及还原糖含量分别达到32.92%、34.70°Bx、327.50 g/L，与新鲜葡萄样品相比，可溶性固形物及还原糖含量分别提高了56.31%、51.02%。由图1（D）可知，随着脱水时间的延长，葡萄滴定酸含量呈现先下降后上升的趋势，在脱水21 d和28 d时，滴定酸含量分别达到（6.42±0.62）g/L、（6.73±0.39）g/L，均显著高于新鲜葡萄样品（P＜0.05）。由图1（E）可知，脱水过程中葡萄汁的pH呈现先上升后下降的趋势，最终pH达到3.02±0.06。由图1（F）可知，总酚含量在整个脱水过程中逐渐增加。总酚含量在脱水7 d出现显著上升（P＜0.05），然后在14 d略有下降，在脱水14 d后持续上升，脱水28 d时总酚含量显著高于前期脱水时间的总酚含量（P＜0.05），分析原因可能是失水引起的非生物胁迫诱导代谢途径进行合成以及浓缩效应共同作用导致的结果[6]。
图1 脱水过程中赤霞珠葡萄理化指标的变化
Fig.1 Changes of physicochemical indexes during Cabernet Sauvignon dehydration
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.2 脱水过程中赤霞珠葡萄果皮多酚类物质含量的变化
2.21 花色苷组分和含量的变化
赤霞珠葡萄果皮中共检测到17种花色苷，包括16种共4类单体花色苷（5种基本花色苷、5种乙酰花色苷、4种香豆酰花色苷和2种咖啡酰花色苷）和1种未鉴定的聚合花色苷，4类单体花色苷和1种未鉴定的聚合花色苷的总含量见表1，4类单体花色苷的物质组分和含量见图2。
表1 脱水过程中赤霞珠葡萄果皮5类花色苷总含量的变化
Table 1 Changes of 5 anthocyanins in grape pericarp during Cabernet Sauvignon dehydration
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图2 脱水过程中赤霞珠葡萄果皮单体花色苷含量的变化
Fig.2 Changes of anthocynins content in grape pericarp during Cabernet Sauvignon dehydration
由表1可知，新鲜赤霞珠葡萄果皮花色苷总量为（9 857.49±174.41）μg/g，脱水处理后花色苷总量显著降低（P＜0.05），脱水7 d、14 d、21 d和28 d时，花色苷总量分别降低13.22%、30.31%、48.38%和44.33%，分析原因可能是脱水促使花色苷向其他多酚类化合物转化[22]。由表1亦可知，聚合花色苷含量随着脱水时间延长持续上升，脱水28 d时样品的聚合花色苷含量为CK的1.91倍。分析原因可能是在脱水过程中，由于果皮细胞破裂，单体花色苷与其他物质发生氧化反应生成聚合花色苷[24]，这有助于增加葡萄酒颜色的稳定性[19]。
由图2可知，新鲜葡萄和脱水处理的葡萄果皮中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量最高，与先前报道的结果一致[23]。脱水过程中，葡萄果皮中基本花色苷和乙酰花色苷含量均显著低于新鲜葡萄果皮（P＜0.05），香豆酰花色苷和咖啡酰花色苷中除花翠素3-O-反式香豆酰化葡萄糖苷、甲基花翠素3-O-反式香豆酰化葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-咖啡酰化葡萄糖苷的含量在脱水7 d时出现升高外，其他物质含量均下降，说明花翠素3-O-反式香豆酰化葡萄糖苷、甲基花翠素3-O-反式香豆酰化葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-咖啡酰化葡萄糖苷在脱水初期的转化与降解速率低于失水带来的浓缩效应，表现出较高的稳定性。除甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-咖啡酰化葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-咖啡酰化葡萄糖苷之外，其他单体花色苷含量在脱水28 d时均有回升，说明脱水28 d时单体花色苷的降解速率趋缓，浓缩效应占据主导地位。脱水后单体花色苷含量显著下降一方面是因为脱水过程中葡萄表皮破裂，花色苷与酚酸发生反应；另一方面是因为花色苷与氧气接触会导致氧化降解[22]。此外，脱水葡萄果肉出现染色现象，说明脱水过程中花色苷发生了从果皮到果肉的扩散[23]，这也导致果皮花色苷含量下降。综上，在脱水过程中，单体花色苷转化形成更稳定的聚合花色苷。面对脱水引起的非生物胁迫，单体花色苷中咖啡酰花色苷和香豆酰花色苷相对稳定，但随着脱水时间的延长，单体花色苷含量整体呈现下降趋势。
2.2.2 单体酚含量的变化
脱水过程中赤霞珠葡萄果皮单体酚含量及组成的变化见表2及图3。
表2 脱水过程中赤霞珠葡萄果皮4类单体酚总含量的变化
Table 2 Changes of 4 monomer phenols in grape pericarp during Cabernet Sauvignon dehydration
单体酚种类羟基苯甲酸羟基肉桂酸黄烷醇黄酮醇总量含量/（μg·g-1）CK C7 C14 C21 C28 41.21±4.63a 9.74±0.57c 81.43±0.20c 7.76±0.08d 140.15±3.93c 39.45±1.28ab 10.51±0.53bc 93.04±4.09b 18.60±0.67b 161.59±5.51b 34.42±0.98b 10.73±0.11bc 84.52±1.09bc 15.06±0.19c 144.73±2.38c 36.46±2.68ab 11.14±0.01ab 89.84±6.69bc 17.04±1.56b 154.49±10.93bc 39.70±0.25ab 11.88±0.51a 107.23±2.73a 24.12±0.15a 182.92±2.61a
图3 脱水过程中赤霞珠葡萄果皮单体酚含量的变化
Fig.3 Changes of monomer phenols content in grape pericarp during Cabernet Sauvignon dehydration
由表2可知，单体酚总量在脱水28 d达到最高值（182.92±2.61）μg/g。羟基苯甲酸中原儿茶酸与香草酸在新鲜葡萄样品中含量最高，可能是通过酶促多酚氧化酶和过氧化物酶途径发生了氧化反应[25]。游离的羟基肉桂酸化合物总含量随脱水时间的增加持续上升，分析原因可能是在脱水过程中，羟基肉桂酸酯在肉桂酰酯酶的作用下被水解为相应的游离态酚酸[26]。
黄烷醇总含量在葡萄果皮脱水28 d时达到最大。参考质量损失率修正浓缩效应带来的影响，黄烷醇含量下降，与文献[8]研究结果一致。黄酮醇可以稳定花色苷、增加葡萄酒的涩感和色泽，是酿酒葡萄重要的酚类化合物[8]。在脱水过程中，黄酮醇化合物可以通过特定的基因表达进行合成[8]。结果表明，槲皮素和山奈酚含量在各个脱水阶段均显著高于新鲜葡萄（P＞0.05）（图3d），与文献[6]报道的结果一致。这些结果证实，黄酮醇含量的增加是葡萄果实采后脱水的主要代谢活动之一[8]。
由图3可知，脱水过程中，没食子酸、咖啡酸、对香豆酸、表儿茶素、槲皮素和山奈酚的含量均高于新鲜葡萄，且在脱水28 d时均显著性高于新鲜葡萄（P＜0.05）。没食子酸含量的上升可能是浓缩效应和聚合酚类化合物的水解共同影响的结果[6]。葡萄果皮中的绿原酸和反式阿魏酸含量均在脱水21 d时最高，且显著高于新鲜葡萄（P＜0.05）。原儿茶酸、香草酸、丁香酸和儿茶素含量均在脱水14 d时达到最小值，可能是因为单体酚发生降解或与花色苷发生反应[26-27]。有研究表明，葡萄脱水过程是单体酚合成与氧化之间的平衡[28]。综上，葡萄皮单体酚含量在整个脱水进程中产生波动。整体来看，脱水28 d最有利于单体酚的富集。
2.3 脱水过程中赤霞珠葡萄汁挥发性风味成分的变化
采用HS-SPME-GC-MS检测赤霞珠葡萄汁中的挥发性风味成分，结果见表3。
表3 脱水过程中赤霞珠葡萄汁挥发性风味成分的变化
Table 3 Changes of volatile flavour compounds in grape juice during Cabernet Sauvignon dehydration
注：“nd”表示未检出。
序号 种类 化合物1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0酯类酸类醛类11 12 13 14 15 16 17 18醇类乙酸乙酯乙酸己酯乙酸异戊酯总含量异丁酸总含量苯甲醛壬醛癸醛总含量正丙醇异戊醇正己醇1-辛醇2-甲基-1-丙醇3-甲基-1-戊醇2-乙基己醇（E）-2-己烯-1-醇（Z）-3-己烯-1-醇苯甲醇苯乙醇总含量总计CK C7 632.25±103.21b 0.78±0.02c 26.10±0.03d 659.12±103.26b nd nd nd 1.98±0.02d nd 1.98±0.02d nd nd 282.98±16.73b 10.80±0.01b nd 605.50±32.32b 4.31±0.02b 298.36±9.76a nd nd 1 938.76±0.09c 3 140.72±58.90c 3 801.82±162.13c 1 007.81±70.50a 5.10±0.09a 31.86±0.50a 1 044.77±71.09a nd nd nd 1.75±0.01e nd 1.75±0.01e nd 288.92±64.18c 710.70±14.07a 11.09±0.04a 565.83±4.73a 1 353.91±17.37a 5.80±0.07a 162.74±1.25b 5.58±0.00a nd 1 959.37±3.79b 5 063.94±105.42b 6 110.45±176.51b含量/（μg·L-1）C14 C21 C28 551.87±57.58b nd 26.29±0.03d 578.17±57.61b nd nd 1.37±0.03b 3.53±0.04a 0.49±0.00b 5.39±0.08a nd 42.92±26.50d 223.53±23.17c 11.03±0.02a nd 499.92±41.86c 4.18±0.00c 135.55±7.35c nd 18.22±0.22b 1 940.91±0.11c 2 876.26±99.23c 3 459.81±156.91c 771.13±22.45b 1.01±0.00b 28.35±0.08b 800.48±22.54b 108.09±3.84a 108.09±3.84a 2.04±0.19a 2.25±0.03b 0.53±0.01a 4.81±0.15b 2 904.89±86.63a 789.05±47.96a 234.36±1.41c 10.63±0.01b nd 519.86±3.63c 4.25±0.02bc 133.65±0.90c nd 28.63±1.48a 1 969.70±1.99a 6 595.00±132.12a 7 508.38±150.98a 604.85±95.40b nd 27.27±0.26c 632.12±95.65b 111.14±1.32a 111.14±1.32a 1.59±0.00b 2.11±0.00c 0.50±0.01b 4.20±0.00c 2 337.47±75.31b 566.99±129.77b 124.05±24.35d nd nd 321.92±44.25d 4.29±0.07bc 76.24±7.39d nd 22.08±1.57b 1 953.95±4.12b 5 406.99±286.70b 6 154.45±383.67b
由表3可知，从赤霞珠葡萄汁样品中共鉴定出18种挥发性风味物质，包括3种酯类、1种酸类、3种醛类和11种醇类。其中，新鲜葡萄汁样品CK中共检测出10种挥发性风味物质，脱水葡萄汁样品C7、C14、C21和C28中共检测出18种挥发性风味物质。异丁酸、苯甲醛、癸醛、正丙醇、异戊醇、2-甲基-1-丙醇、（Z）-3-己烯-1-醇、苯甲醇仅在脱水葡萄汁样品中被检出。新鲜葡萄汁样品CK的挥发性风味成分总含量为（3 801.82±162.13）μg/L，除脱水葡萄汁样品C14，其他脱水葡萄汁样品中的挥发性风味物质含量均显著高于新鲜葡萄汁样品CK（P＜0.05），且脱水葡萄汁样品C21的挥发性风味物质总量最高，为（7 508.38±150.98）μg/L，是新鲜葡萄汁样品CK的1.97倍。
在新鲜葡萄汁和脱水葡萄汁中，含量最丰富的2种挥发性风味物质是苯乙醇和乙酸乙酯，它们可贡献花香与果香，如香蕉、梨等令人愉悦的水果香气[1]。脱水葡萄汁样品C7中检出的3种乙酸酯类化合物含量显著高于新鲜葡萄汁样品CK，乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸异戊酯含量分别为新鲜葡萄汁样品CK的1.59倍、6.54倍和1.22倍。根据质量损失率对失水导致的浓缩效应进行换算，可以得出乙酸乙酯和乙酸己酯含量的增幅高于浓缩倍数1.13，说明脱水促进了乙酸乙酯和乙酸己酯含量的增加。在后续脱水过程中，酯类物质含量下降，表明随着脱水时间的延长，酯类化合物发生了水解[29]。
醛类化合物在新鲜葡萄汁样品CK中含量较低，具有杏仁甜香的苯甲醛和癸醛[1]，在脱水14 d后的葡萄汁样品中被检出。酸类化合物中异丁酸具有酸腐奶酪的气味[1]，在脱水21 d后出现，但其含量低于阈值，不会被感知。醇类化合物是葡萄汁中主要的挥发性化合物，以花香、蜂蜜香气为特征的苯甲醇和苯乙醇[1]含量在脱水葡萄汁样品C21中达到最大值，分别为（28.63±1.48）μg/L、（1 969.70±1.99）μg/L。正己醇、1-辛醇、（E）-2-乙基己醇、（Z）-3-己烯-1-醇等主要贡献青草和嫩叶香气的长链醇在脱水葡萄汁样品C7中含量最高，分别为（710.70±14.07）μg/L、（11.09±0.04）μg/L、（5.80±0.07）g/L、（162.74±1.25）μg/L，与文献[11]报道的结果一致。
综上，脱水葡萄汁样品C7香气最为浓郁，以水果、植物香气为特征；而脱水葡萄汁样品C21的挥发性风味物质含量最高，可能呈现更甜蜜成熟的风格。
3 结论
赤霞珠葡萄脱水过程中，可溶性固形物、还原糖及总酚含量均显著高于新鲜葡萄（P＜0.05），脱水28 d时含量最高，分别为34.70°Bx、327.50 g/L、36.11 mg/g。滴定酸含量呈先下降后上升的趋势，pH值则相反。与新鲜葡萄果皮相比，脱水葡萄果皮花色苷总含量显著降低（P＜0.05），而其中聚合花色苷含量显著增加（P＜0.05），脱水28 d时增加91.30%；单体酚总含量升高，其中羟基肉桂酸、黄烷醇和黄酮醇含量增加，尤其是槲皮素和山奈酚，而羟基苯甲酸含量下降。从葡萄汁中共检出18种挥发性风味物质，新鲜葡萄汁中检测到10种，脱水葡萄汁中检测到18种，六个碳原子以上的长链醇和乙酸酯含量在脱水7 d时达到最高。综上，脱水处理改善了葡萄原料的糖酸和总酚特性。从酚类物质方面考虑，最佳脱水时间为28 d；而酿造果香馥郁的新酒应选择赤霞珠葡萄7 d的脱水处理，本研究为脱水技术在不同类型葡萄酒生产酿造中的应用提供了理论依据。
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