广东梅州客家娘酒又称广东客家黄酒、月子酒，是我国最古老的酒种之一，有着五千多年历史，汇聚了中华民族中原酒文化与岭南山区文化的精华，在广东梅州、河源、惠州、韶关等地区的客家人依然传承着这种传统发酵黄酒，其中以世界客都——梅州客家娘酒最为有名。梅州客家娘酒是以糯米、黑糯米为主要原料，经蒸煮，加入天然微生物酒曲发酵，酿造而成的发酵酒。客家娘酒中含有丰富的糖、醇、酯类、氨基酸等物质[1-2]，娘酒中羰基化合物、还原糖以及氨基化合物等在高温、弱酸以及微生物参与等条件下不断进行美拉德反应，并产生大量美拉德反应产物[3]，比如5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethyl-furfural，5-HMF）[4-8]等醛类化合物，增加了娘酒的色泽和风味。
5-HMF也称5-羟甲基-2-呋喃甲醛，具有一定的神经毒性，遗传毒性，摄入后在磺基转移酶作用下可转化为具有致癌毒性的羟甲基糠醛次硫酸[9-12]。近年来，随着国内外研究的深入，5-HMF在动物身上的抗氧化性、抗菌性、抗过敏等生物活性也逐渐被人们所发现[13-15]。国内外针对牛乳、果汁、蜂蜜、咖啡、葡萄酒和药物中5-HMF的检测方法进行了大量的报道，主要包括紫外分光光度法[16]、薄层层析-薄层扫描法[17]、核磁共振氢谱定量法[18]、高效液相色谱法[19-21]、高效液相色谱-串联质谱联用分析方法[22-24]等。紫外分光光度法分析结果会受到复杂样品成分的影响；薄层色谱扫描法主要用于中药材等复杂成分的检测，且过程较为复杂[17]。高效液相色谱-串联质谱联用法对于微量5-HMF检测具有优势，但设备成本较大。高效液相色谱法因具有样品用量少、方法操作简单并且能够准确对单一组分进行定性和定量等优点而被广泛使用，但目前国内尚未对黄酒中的5-HMF的检测以及限量制定相关标准。本实验以梅州地区特色产品——客家娘酒为原料，建立了5-HMF的液相色谱分析方法，旨在探索广东梅州客家娘酒中5-HMF含量，为后续国家制定相关标准提供参考和依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
5-HMF标准品（纯度98.9%）：曼哈格（上海）生物科技有限公司；甲醇（色谱纯）：北京MREDA科技有限公司；冰乙酸（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；超纯水：实验室自制。
1.2 仪器与设备
1260 Infinity II超高效液相色谱仪（配有四元梯度泵，二极管阵列检测器，在线真空脱气机）：美国安捷伦公司；BSA224S-CW电子分析天平：德国赛多利斯公司；Milli-Q Reference超纯水机：美国默克化工技术有限公司；HHS-21-4电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件
5-HMF分析采用安捷伦C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），配有柱温箱，以甲醇和水为流动相，等度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长为284 nm，进样量10 μL。
1.3.2 标准溶液的配制
5-HMF标准溶液的配制：精确称取5-HMF 标准品200 mg，用体积分数为20%甲醇水稀释定容于100 mL容量瓶中，得到质量浓度为200 mg/L的5-HMF 标准溶液。
1.3.3 样品的制备
本研究所用客家娘酒取自梅州本地客户2022年4月份委托送检产品，样品经检验符合相关标准。称取1 g娘酒于100 mL烧杯中，放置60 ℃水浴锅水浴加热30 min，以去除酒精，取出冷却至室温，用超纯水定容于50 mL容量瓶中，摇匀，记为样品A；精确移取5 mL样品A于另一50 mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，记为样品B。
2 结果与分析
2.1 5-HMF液相色谱检测条件的选择
5-HMF 具有紫外吸收的能力，因此，本研究采用二极管阵列检测器配合安捷伦C18色谱柱对其进行分析。影响5-HMF色谱出峰的因素主要有流动相比例、流速、流动相pH及柱温。
2.1.1 流动相流速的选择
流动相的流速是影响保留时间的重要因素。流速变大，洗脱能力增强，保留时间缩短；流速变小，洗脱能力减弱，保留时间延长。本研究考察了5-HMF标准液和客家娘酒样品B在流速为0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min时对保留时间的影响，结果分别见图1与图2。
图1 流动相不同流速下5-羟甲基糠醛标准品的色谱图
Fig.1 Chromatograms of 5-hydroxymethyl-furfural standards with different flow rates of mobile phase
图2 流动相不同流速下客家娘酒样品中5-羟甲基糠醛的色谱图
Fig.2 Chromatograms of 5-hydroxymethyl-furfural in Hakka wine samples with different flow rates of mobile phase
由图1可知，流动相流速对保留时间有较大的影响，对峰形影响较小，流速越低，保留时间越长，峰形更宽。
由图2可知，当流速为0.6mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min时，5-HMF保留时间分别为15.393min、11.247min、9.103min、7.462min。结果表明，在不同流速下5-HMF标准液和客家娘酒样品中的5-HMF均能得到较好的分离，无杂峰干扰。但流速过低样品分析时间较长；流速过大，柱压过大，对色谱柱填料有损害。综合考虑，适宜的流动相流速为1.0 mL/min。
2.1.2 柱温的选择
分别在柱温为25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃时进样，标品和样品色谱分析结果见图3和图4。
图3 不同柱温下5-羟甲基糠醛标准品的色谱图
Fig.3 Chromatograms of 5-hydroxymethyl-furfural standards with different column temperature
图4 不同柱温下客家娘酒样品中5-羟甲基糠醛的色谱图
Fig.4 Chromatograms of 5-hydroxymethyl-furfural in Hakka wine samples with different column temperature
由图3和图4 可知，柱温对保留时间有一定影响，柱温从25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃色谱峰保留时间分别为9.8 min、9.0 min、8.6 min、8.1 min。液相色谱仪色谱分析过程是通过流动相中样品中物质和固定相的结合-分离差异起到分离的作用，温度以影响结合-分离过程，从而影响色谱分析过程。柱温升高加快分离过程，但因样品保留时间不稳将增加分析工作的麻烦，分辨率也下降；相反，当柱温低时，分辨率高，但分离过程时间会延长，且在温度低的情况下，流动相黏度增加会延长分析时间，增加泵的磨损，从而影响色谱柱的使用。在上述4个柱温条件下，均能保证5-HMF标准液与样品B中5-HMF色谱峰的完全分离无干扰。考虑温度的综合影响，在保证分离效果的情况下，选择柱温为30 ℃。
2.1.3 流动相比例的选择
流动相所用溶剂及其比例的变化会带来流动相溶剂极性的变化，影响溶剂强度及溶剂的洗脱能力，进而影响色谱峰的保留时间和响应值。本实验采用甲醇/水为流动相，考察甲醇和水的体积比分别为5∶95、10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50时对色谱峰分离的影响，标品和样品色谱分析结果分别见图5和图6。
图5 不同流动相比例下5-羟甲基糠醛标准品的色谱图
Fig.5 Chromatograms of 5-hydroxymethyl-furfural standards with different ratios of mobile phase
图6 不同流动相比例下5-羟甲基糠醛在客家娘酒样品中的色谱图
Fig.6 Chromatograms of 5-hydroxymethyl-furfural in Hakka wine samples with different ratios of mobile phase
由图5可知，甲醇和水的体积比对保留时间和响应值有着显著的影响。流动相中有机相含量越高，色谱峰越尖锐，保留时间缩短；流动相中水相含量越高，色谱峰越平滑，保留时间延长。不同比例流动相保留时间相差近12 min。上述6个流动相体积比均能保证5-HMF标准品色谱峰的分离。但客家娘酒成分复杂，除了含有5-HMF外，还有许多其他物质，比如糖分、酸性物质等，色谱峰可能会受其干扰，故液相色谱条件必须保证客家娘酒中5-HMF的色谱峰不受其他物质的杂峰影响。
由图6可知，在娘酒中5-HMF含量较低，甲醇和水的体积比为5∶95时，虽然5-HMF色谱峰与杂峰无干扰，但峰形较平滑，且分析时间过长。甲醇和水的体积比为30∶70时，5-HMF色谱峰开始受到杂峰的干扰，当甲醇和水的体积比为50∶50时，干扰最为明显。由此可以预见甲醇和水的体积比越大，杂峰对5-HMF色谱峰的干扰越大。甲醇和水的体积比为10∶90和20∶80时，既能保证5-HMF色谱峰完整，又能保证不受杂峰的影响，考虑到分析时间的长短对分析大量样品的经济性，因此，甲醇和水的适宜体积比为20∶80。
2.1.4 流动相中水相pH的选择
色谱峰的峰形受流动相pH 值的影响。本研究通过加入乙酸来改变流动相的pH值，研究pH对峰形的影响。采用乙酸调整水相pH为3.0、4.0、5.0、6.5（其中pH=6.5为不加乙酸的超纯水），分别对5-HMF标准品和客家娘酒B进样分析，色谱分析结果见图7和图8。
图7 不同pH流动相中5-羟甲基糠醛标准品的色谱图
Fig.7 Chromatograms of 5-hydroxymethyl-furfural standards with different pH of mobile phase
图8 不同pH流动相中5-羟甲基糠醛在客家娘酒样品中的色谱图
Fig.8 Chromatograms of 5-hydroxymethyl-furfural in Hakka wine samples with different pH of mobile phase
由图7和图8可知，水相的pH 值对5-HMF标准品及客家娘酒样品的5-HMF色谱峰的保留时间几乎没有影响，保留时间均为4.7 min左右，相差0.1 min以内，对峰形的影响也较小。说明在甲醇和水的体积比为20∶80的流动相体系中，pH对5-HMF在C18色谱柱中的吸附-分离影响较小。可能原因是乙酸对该流动相体系的极性以及C18色谱柱中硅羟基的活性影响不大。考虑操作的便捷性和经济性，以超纯水为水相进行分析是比较适宜的。
综上，最终确定5-HMF的最佳高效液相色谱测定条件如下：采用安捷伦C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温为30 ℃；二极管阵列检测器，检测波长为284 nm；流动相中甲醇和水为体积比为20∶80，流速为1.0 mL/min，等度洗脱。
2.2 5-HMF高效液相色谱法分析方法学考察
2.2.1 5-HMF标准曲线回归方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限
精确移取5-HMF 标准溶液0.01 mL、0.05 mL、0.10 mL、1.00 mL、2.50 mL置于10 mL容量瓶内，用体积分数为20%甲醇水稀释定容，配制成1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL标准工作溶液，分别进样10 μL，以5-HMF色谱峰面积（Y）对标准溶液的质量浓度（X）进行线性回归，检出限与定量限以关于分析方法验证的指导原则中对检出限及定量限的规定[25]，通过5-HMF的线性回归方程，响应值的偏差和标准曲线斜率进行计算。得到5-HMF的线性回归方程和相关系数、检出限及定量限，结果见表1。由表1可知，5-HMF的标准曲线的线性方程相关系数R2为0.999 6，在1～50 μg/mL质量浓度范围内拟合度良好。该方法检出限为0.127 8 mg/kg，定量限为0.387 4 mg/kg。
表1 5-羟甲基糠醛的线性回归方程、线性范围、检出限及定量限
Table 1 Linear regression equations,linear ranges,limit of detection and limit of quantification of 5-HMF
2.2.2 精密度试验
取质量浓度为5 μg/mL的5-HMF标准溶液，重复进样7次，测定5-HMF峰面积，并计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表2。由表2可知，RSD为0.28%，表明该方法精密度良好。
表2 5-羟甲基糠醛的精密度试验结果
Table 2 Precision experiments results of 5-hydroxymethyl-furfural
2.2.3 重现性试验
取同一客家娘酒样品A过滤至6个进样瓶，分别进样，测定各组分的色谱峰面积并计算其RSD，结果见表3。由表3可知，RSD为0.06%，表明重现性非常好。
表3 客家娘酒中5-羟甲基糠醛的重现性试验结果
Table 3 Reproducibility experiments results of 5-hydroxymethyl-furfural in Hakka wine
2.2.4 回收率试验
采用加标回收法，取客家娘酒样品A四份，其中三份精确加入的5-HMF质量浓度分别为2.5 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL，同一样品平行测定3次，计算回收率，结果见表4。由表4可知，客家娘酒中的5-HMF含量为0.956 4 g/kg。5-HMF的平均回收率分别为96.88%、88.64%、102.13%，RSD均＜1%，说明该方法具有较高的准确度。
表4 5-羟甲基糠醛的回收率试验结果
Table 4 Recovery experiments results of 5-hydroxymethyl-furfural
3 结论
本研究建立了测定梅州客家娘酒中5-HMF的高效液相色谱法。该方法采用安捷伦C18色谱柱，柱温为30 ℃；二极管阵列检测器，检测波长为284 nm；以甲醇和水的体积比为20∶80作为流动相，流速为1.0 mL/min，等度洗脱。该方法精密度、准确度高，重现性好，可用于梅州客家娘酒中5-HMF的测定，为梅州客家娘酒的成分分析以及质量监控提供依据。
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