枸杞（Lycium barbarum）属于茄科枸杞属落叶灌木植物，其果实富含多糖、黄酮、甜菜碱等天然营养成分[1]，如枸杞多糖具有抗氧化、抗衰老、防治和治疗糖尿病的功效[2]，枸杞黄酮类具有降血糖、降血脂、增强人体免疫的功能[3]。ZHOU Z Q等[4]通过光谱分析，从枸杞果实中分离得到有益的生物活性成分二咖啡酰亚精胺衍生物，该物质对枸杞抗阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）和抗氧化作用贡献很大，同时有助于抗衰老和保护神经，被认为是枸杞中一种主要的生物活性成分。
枸杞果醋是经过预处理的枸杞果浆在酵母菌和醋酸菌的作用下通过酒精发酵与醋酸发酵而成的产品，其保留了枸杞中氨基酸等天然成分，同时产生了更多的有机酸。枸杞果醋不但果香浓厚、醋体均匀、酸甜美味，而且具有调理身体的功效[5-6]。研究表明，枸杞果醋不仅可以调节人体新陈代谢，还可促进血液循环，控制体内胆固醇水平，预防衰老[7]。
目前，对于枸杞果醋的研制，更多的是将苹果[8]、苦荞[9]、山药[10]、覆盆子[11]、红枣[12]、葡萄[13]等原料与枸杞以一定的比例配比发酵复合果醋，并对其加工工艺条件进行优化。同时，也有一些学者研究了仅以枸杞为原料发酵果醋。王怡明等[14]以枸杞为原料制备枸杞果醋饮料，得到枸杞果醋饮料的最佳配方为枸杞醋8%，枸杞汁15%，白砂糖6%，菊花提取液15%。在此优化条件下，枸杞果醋饮料感官评分为95.47分，枸杞果醋饮料口感柔和、酸甜爽口。TIAN Y L等[15]研究了枸杞醋中的营养、生物活性化合物和保肝活性，表明枸杞醋可用作预防氧化性肝损伤的功能性食品。但是缺乏对枸杞果醋酿造工艺的系统研究。
本研究采用宁夏枸杞干果作为试验原料，通过液态发酵酿造枸杞果醋，经过试验筛选出适合枸杞果醋酒精发酵和醋酸发酵的商业菌种，并通过单因素和响应面试验对醋酸发酵工艺进行优化，再结合体外抗氧化试验评价其抗氧化活性，旨在为枸杞果醋工业化生产和保健食用奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
枸杞：宁夏中宁县吉利宝枸杞制品有限公司；蔗糖（食品级）：南昌经济技术开发区鸿平食品厂；果胶酶（7 500 PGUN/g）：广州初凡生物科技有限公司；酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）S37：烟台在他香商贸有限公司；安琪酵母RW：安琪酵母股份有限公司；巴氏醋酸菌亚种（沪酿1.01）（HuNiang 1.01）（Acetobacter pasteurianum subsp.pasteurianum）：山东和众康源生物科技有限公司；许氏醋酸菌（Acetobacter schutzenbachii）、巴氏醋酸菌（Acetobacter pasteurianum）：上海保藏生物科技中心；无水乙醇（分析纯）：东莞市泉旺达化工科技有限公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市博华通化工产品销售中心；盐酸（纯度≥99.7%）：广州氪道标准物质专营店；葡萄糖（分析纯）：山东茧蜂生物科技有限责任公司；酵母膏（生化试剂）：天津市鼎盛鑫化工有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：合肥千盛生物科技有限公司；维生素C（vitamin C，VC）：天津市致远化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
JA1003电子分析天平、SPX-250B恒温培养箱、LC-LXLR650台式高速冷冻离心机、721紫外可见分光光度计、PHS-3C精密pH计：上海力辰仪器科技有限公司；12-Y91C破壁机：九阳股份有限公司；HH-3A恒温水浴锅：江苏盛蓝仪器制造有限公司；THE01505B手持糖度计：深圳市雅戈科技有限公司；QYC-211恒温振荡摇床：广州沪瑞明仪器有限公司；JSY-001P榨汁机：深圳市橙天环保科技有限公司；SW-CJ-2F无菌工作台：绍兴市景迈仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 枸杞果醋加工工艺流程与操作要点
酵母菌接种醋酸菌接种
操作要点：
枸杞果浆的制备：剔除枸杞中的霉果、烂果，流动水冲洗干净表面的灰尘，沥干水分后以1∶7（g∶mL）的料水比加入超纯水浸泡6 h，采用九阳破壁机打浆2 min，得到枸杞果浆。
酶解、调糖：在枸杞果浆中添加40 mg/kg果胶酶，45 ℃恒温水浴酶解30 min，酶解后的枸杞果浆加入蔗糖调节糖度为20%。置于恒温水浴锅在70 ℃条件下进行巴氏灭菌30 min，冷却至室温。
酵母菌的活化：配制适量5%的蔗糖溶液，将干酵母以枸杞果浆总量0.2 g/L用量，加入蔗糖溶液中，置于25～30 ℃培养箱中30 min。
酒精发酵：在无菌条件下，将活化后的酿酒酵母S37接种到枸杞果浆中，添加量为0.2%，搅拌均匀，隔绝氧气，置于25 ℃恒温培养4～6 d，制备枸杞果酒，待酒精度不再上升即停止酒精发酵。
醋酸菌种子液制备：参照董书阁[16]的方法。
醋酸菌活化与扩培：依据马新凤等[17]对醋酸菌活化与扩培的方法，稍作修改。将甘油保藏菌株取一环接入100 mL活化培养基，30 ℃、160 r/min恒温振荡培养24 h。一级扩大培养：将活化后的醋酸菌取1 mL接种于250 mL发酵培养基中，30 ℃、160 r/min 振荡培养24 h。二级扩大培养：将一级扩大培养的醋酸菌取1 mL接种于500 mL培养基中，30 ℃、160 r/min 振荡培养24 h。
醋酸发酵阶段：将制备好的醋酸菌发酵液加入枸杞果酒中，对干枸杞果酒的pH进行调节，于30 ℃、160 r/min条件下培养4～6 d，待酸度不再变化即醋酸发酵结束。
离心、灭菌、罐装：将发酵好的枸杞果醋于4 000 r/min条件下离心20 min，收集上清液，煮沸10 min，趁热灌装，即得枸杞果醋成品。
1.3.2 酵母菌的筛选
选择两份相同的枸杞果浆，分别接种酿酒酵母S37和安琪酵母RW（接种量均为0.2%），酒精发酵条件为初始糖度20%，初始pH 5.5，发酵温度25 ℃，酵母接种量0.2%，发酵时间4～6 d。以酒精度为评价指标，筛选最佳酿母菌种。
1.3.3 醋酸菌的筛选
根据1.3.1节中得到的枸杞果酒，分别采用沪酿1.01醋酸菌、许氏醋酸菌、巴氏醋酸菌进行醋酸发酵，筛选产酸最高的醋酸菌。醋酸发酵条件为发酵温度30 ℃，醋酸菌接种量6%，摇床转速160 r/min，发酵时间4～6 d。以产酸量为评价指标，筛选最佳的醋酸菌。
1.3.4 醋酸发酵工艺优化
（1）单因素试验设计
根据酒精发酵工艺进行酒精发酵得到的枸杞酒，再进行醋酸发酵得到枸杞果醋。本试验分别设置醋酸发酵温度（22 ℃、26 ℃、30 ℃、34 ℃）、初始pH值（5.0、5.5、6.0、6.5）和醋酸菌接种量（2%、4%、6%、8%）为自变量，以酸度为评价指标，分别考察发酵温度、初始pH值与接种量对醋酸发酵的影响。
（2）响应面试验设计
在单因素试验基础上，选择发酵温度（A）、初始pH值（B）、接种量（C）作为自变量，采用Design-Expert 11.0中Box-Behnken试验设计，以发酵液中酸度（Y）作为响应值，进行3因素3水平响应面试验。-1、0、1表示因素低、中、高三水平，Box-Behnken试验设计因素与水平见表1。
表1 醋酸发酵工艺优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for acetic acid fermentation process optimization
1.3.5 枸杞果醋感官评价
参照王怡明等[18]对枸杞果醋感官评定的标准进行感官评定，评定细则稍作修改。邀请10名专业人士依次品尝枸杞果醋，根据评分细则对枸杞果醋进行酸味、甜味、辛辣味、澄清度、香味以及口感进行感官评定，枸杞果醋的感官评价标准见表2。
表2 枸杞果醋的感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Lycium barbarum vinegar
1.3.6 理化指标的测定
可溶性固形物含量测定：参考国标GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》[19]；总酸含量测定：参考国标GB/T 5009.239—2016《食品酸度的测定》[20]；酒精度测定：参考GB/T 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》[21]；不挥发性酸含量测定：参考国标GB/T 5009.157—2016《食品中有机酸的测定》[22]。
1.3.7 抗氧化活性的测定
DPPH自由基清除率的测定：参考徐清萍等[23-26]的方法，稍作改动。配制质量浓度为（0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL）的枸杞果醋，取待测液与0.2 mmol/LDPPH溶液等体积加入同一具塞试管中，摇匀，在室温下避光放置20 min后迅速在波长517 nm处测定混合液的吸光度值Ai，用无水乙醇作空白对照。测定0.2 mmol/L DPPH溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度值Ac，以及待测溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度值Aj，并用与样品浓度相同的维生素C作为阳性对照，并测定吸光度值，每个样品测三个平行，取平均值，DPPH自由基清除率计算公式如下：
式中：Ai为2 mL DPPH溶液+2 mL待测溶液的吸光度值；Aj为2 mL无水乙醇溶液+2 mL待测溶液的吸光度值；Ac为2 mL DPPH溶液+2 mL无水乙醇溶液的吸光度值。
ABTS+自由基清除率的测定：参考李培源等[27]的方法，稍加修改。配制质量浓度为（0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL）的枸杞果醋，用无水乙醇调零，在波长734 nm处测定吸光度值，并用与样品相同浓度的维生素C作为阳性对照，测定其吸光度值的大小，每个试验做3次平行，ABTS+自由基清除率计算公式如下：
式中：A0为3 mL ABTS溶液的吸光度值；A1为3 mL ABTS溶液与0.2 mL待测样品混合液的吸光度值。
1.3.8 数据处理
单因素试验数据采用Origin 2021进行处理和分析；响应面优化、显著性差异分析采用Design-Expert11.0统计软件。
2 结果与分析
2.1 酵母菌的选择
由图1可知，酿酒酵母S37发酵的酒精度高于安琪酵母RW，第6天酿酒酵母S37发酵趋势趋于减弱，酒精度达到7.1%vol左右，而酵母RW在第7天处于平缓趋势，酒精度只达到5.2%vol。果醋进行醋酸发酵的初始酒精度需达到7%vol～8%vol，安琪酵母RW不能满足果醋醋酸发酵的要求。因此，最适用于干枸杞果醋发酵的酿酒酵母菌为酿酒酵母S37。
图1 不同酵母菌对枸杞果酒酒精度的影响
Fig.1 Effect of different yeast on alcohol content of Lycium barbarum wine
2.2 醋酸菌的选择
由图2可知，沪酿1.01菌株的酸度升高幅度明显大于许氏、巴氏醋酸菌，沪酿1.01菌株酸度最高达到3.62 g/100 mL，而且相比于许氏、巴氏醋酸菌，沪酿1.01醋酸菌发酵效率更高。因此，最适发酵干枸杞果醋的醋酸菌为沪酿1.01菌株。
图2 不同的醋酸菌对枸杞果醋酸度的影响
Fig.2 Effect of different acetic acid bacteria on acidity of Lycium barbarum vinegar
2.3 醋酸发酵工艺优化单因素试验
2.3.1 发酵温度的确定
由图3可知，在发酵温度22 ℃条件下，醋酸发酵液中总酸含量较低，其原因可能是温度较低醋酸菌活性低所致；当发酵温度为30 ℃时，枸杞果醋醋酸发酵液中总酸含量最高；当发酵温度＞30 ℃之后，总酸含量反而下降，这是因为发酵温度较高，醋酸菌生长和代谢过于旺盛，醋酸菌菌体老化，而且高温不利于产物的积累[28]。因此，枸杞果醋最适发酵温度为30 ℃。
图3 发酵温度对枸杞果醋酸度的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on acidity of Lycium barbarum vinegar
2.3.2 初始pH值的确定
由图4可知，当pH＜5.5和pH＞5.5时醋酸菌的生长能力下降，醋酸菌的产酸率都受到的不同程度的抑制作用，当初始pH值为5.5时，醋酸菌的活性最强，生长能力最旺盛，产酸能力也是最高的。因此，枸杞果醋发酵的最适初始pH值为5.5。
图4 初始pH值对枸杞果醋酸度影响
Fig.4 Effect of initial pH on acidity of Lycium barbarum vinegar
2.3.3 接种量的确定
由图5可知，当接种量在2%时，醋酸菌产酸速度相对较慢，发酵周期相对较长，最终的总酸含量也相对较低；随着接种量的増加，醋酸菌产酸速度增大，发酵周期缩短，总酸含量也增大，当接种量为6%时，发酵周期仅为5 d，总酸含量达最大值4.25 g/100 mL；当接种量＞6%之后，发酵周期缩短，总酸含量呈平缓趋势，由于接种量过大，菌体增殖会消耗发酵液中大部分养分，代谢废物大量积累，导致醋酸菌过早老化、出现自溶等现象，影响醋酸发酵效果[29]。因此，枸杞果醋发酵的最适接种量为6%。
图5 接种量对枸杞果醋酸度的影响
Fig.5 Effect of inoculum on acidity of Lycium barbarum vinegar
2.4 响应面法优化醋酸发酵工艺
在单因素试验结果的基础上，以酸度（Y）为响应值，设置转速为160 r/min，发酵时间为7 d，考察发酵温度（A）、初始pH值（B）、接种量（C）对枸杞果醋醋酸发酵的影响，采用Design-Expert 11.0进行3因素3水平的响应面试验，将得到的试验数据进行二次多项回归拟合，试验均重复3次。响应面试验设计结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 醋酸发酵工艺优化Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments for acetic acid fermentation process optimization
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
运用Design-Expert11.0软件对测试结果进行回归分析，得回归方程如下：
由表4可知，该模型P值=0.003＜0.01，回归模型方程显著；失拟项P值=0.445＞0.05，表示不显著，表明该方程合理可行；决定系数R2=0.952 5，校正决定系数R2Adj=0.891 5，说明该模型能解释89.15%响应值的变化。该回归方程的拟合度和可信度均较好，可用于枸杞果醋醋酸发酵工艺的理论预测。由P值可知，二次项A2、C2对结果有极显著影响（P＜0.01），二次项B2对结果有显著影响（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，各因素对醋酸产量的影响依次为：接种量（C）＜发酵温度（A）＜初始pH值（B）。
通过统计采用软件Design-Expert 11.0对模型优化求解，得到枸杞果醋醋酸发酵的最佳工艺条件为：发酵温度29.909 ℃，接种量5.905%，初始pH 5.617。在此条件下，枸杞果醋酸度理论值为4.930 g/100 mL。为了便于实际操作，将枸杞果醋醋酸发酵的最佳工艺条件修正为：发酵温度30 ℃，接种量6%，初始pH值为5.6。在此优化条件下进行3次平行验证试验，枸杞果醋酸度实际值为4.930 g/100 mL，实际值与理论预测值高度吻合。因此，所建立的模型可行，且利用响应面法优化枸杞果醋的工艺具有实际应用价值。
2.5 枸杞果醋品质分析
2.5.1 感官评价
对优化发酵工艺制备前后的枸杞果醋进行感官评价，结果见图6。由图6可知，工艺优化之前枸杞果醋的感官评分为68.5分，而工艺优化之后枸杞果醋感官评分为83.5分。优化之后枸杞果醋感官评分高于优化之前，枸杞果醋色泽呈现深褐色，颜色纯正均匀，具有果醋的酸味和枸杞的气味，酸度适中，口感爽口，无刺激性气味，稳定性好，无肉眼可见的杂质。
图6 枸杞果醋感官评价雷达图
Fig.6 Radar map of sensory evaluation of Lycium barbarum vinegar
2.5.2 枸杞果醋理化指标检测结果
对采用优化醋酸发酵工艺制备的枸杞果醋进行理化指标的测定，结果见表5。
表5 枸杞果醋理化指标测定结果
Table 5 Determination results of physicochemical indexes of Lycium barbarum vinegar
注：“ND”表示未检测出。
由表5可知，枸杞果醋中可溶性固形物、总酸、不挥发性有机酸中除酒石酸外的各项理化指标均满足国标GB/T 18187—2000《酿造食醋》的要求。
2.6 枸杞果醋的抗氧化能力
DPPH自由基中心的氮原子具有孤对电子，DPPH的最大吸收波长为517 nm。DPPH溶液中添加抗氧化剂时，孤对电子会与活性质子结合[30]，使DPPH溶液的吸光度下降或降低，使DPPH溶液的颜色从紫到黄，而在波长517 nm处的吸光度降低，降低的幅度与自由基的清除程度呈线性关系。枸杞果醋对DPPH及ABTS+自由基清除率结果见图7。由图7a可知，维生素C在0～0.4 mg/mL、样品在0～1.2 mg/mL的质量浓度区间内，自由基的清除率随样品的浓度呈线性增长的关系，维生素C、样品质量浓度在2.5 mg/mL时，DPPH清除率分别为92.34%和70.56%。结果表明，枸杞果醋对DPPH自由基具有一定清除作用，但效果比维生素C弱。
图7 枸杞果醋对DPPH（a）及ABTS+（b）自由基清除率
Fig.7 Clearance rates of Lycium barbarum vinegar on DPPH (a)and ABTS+(b) free radical
ABTS是由化合物2,2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐氧化产生稳定的ABTS+·，水溶液呈蓝绿色，在波长734 nm处有紫外特征吸收值[31]。当在ABTS+·中加入抗氧化剂后，自由孤电子会被配对，吸光度值减弱，溶液的色泽变淡，波长734 nm时的吸光度值最小，其变化与自由基清除的程度呈线性关系。由图7b可知，维生素C在0～1.0 mg/mL、样品在0～2.5 mg/mL范围内，试样浓度与自由基清除率存在着良好的线性关系。维生素C和样品质量浓度在2.5 mg/mL时，ABTS自由基清除率分别为93.93%和69.54%。结果表明，枸杞果醋对ABTS中O2-自由基具有一定清除作用，但效果比维生素C弱。
3 结论
根据响应面对发酵工艺的优化得出醋酸发酵的最佳工艺条件为：发酵温度30 ℃，接种量6%，初始pH值为5.5。在此优化醋酸发酵工艺条件下，枸杞果醋酸度为4.93 g/100 mL，枸杞果醋的感官评分为83.5分。枸杞果醋颜色呈现深褐色，色泽纯正，具有果醋的酸味和枸杞的香气，酸度适中，口感爽口，稳定性好，无刺激性气味，无肉眼可见的杂质，整体完成度比较好，相对大部分检验者可以接受。根据果醋成分国家标准的测定试验中，所测成分符合标准。枸杞果醋质量浓度在2.5 mg/mL时，DPPH和ABTS+的自由基清除率分别为70.56%和69.54%，表明枸杞果醋具有良好的体外抗氧化能力。
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