近年来，国内雪茄市场销量增长迅速，而国产优质雪茄原料短缺，这极大限制了国产雪茄产业的健康、可持续发展[1]。与国外优质雪茄烟叶相比，国内基础条件尚处于起步阶段，短期内国产优质雪茄烟叶原料保障能力不足，雪茄烟叶原料风格特征不够明确。不同于单菌发酵，雪茄烟叶的发酵生产属于多菌种混合固态发酵，在发酵过程中蛋白质、淀粉、纤维素等大分子物质在真菌和细菌的作用下降解为低分子化合物，并被进一步转化为各种致香成分，最终形成了雪茄独特的风格特征[2]。
传统雪茄依靠原料和发酵环境中存在的微生物在天然气温下进行发酵，生产周期长，质量不够稳定，受季节和外界环境影响较大。与自然发酵相比，人工发酵可以在可控的温度（如低温35 ℃、中温40 ℃和高温45 ℃）条件下进行发酵，烟叶品质相对稳定，发酵周期可从1～2年缩至4～8周[3]。如乔保明等[4]研究了不同温度对雪茄茄芯烟叶品质的影响，发现随着温度的升高，发酵的剧烈程度增加，烟叶的颜色逐渐变深，化学成分协调性和评吸质量也有显著的变化，但温度过高会导致发酵过度从而降低烟叶的品质。荣仕宾等[5]探究了发酵条件对雪茄芯叶致香成分含量的影响，发现烟叶各类香气物质及其总量涨幅随着发酵温度升高先增大后减小。然而，人工发酵的烟叶品质相较自然发酵存在香韵丰富度低或刺激性高的问题，这可能是由于单一的发酵温度不符合微生物生长和代谢规律，如高温会抑制功能微生物的增殖及其发酵作用，低温会抑制酶活作用和大分子物质的降解。在自然发酵过程中，传统发酵产品（如白酒、雪茄等）内部微生物群落的演替通常伴随着温度的变化，在发酵前期由于微生物快速生长代谢产生大量的生物热导致温度快速升高，之后由于微生物的消亡导致温度逐渐下降[6-7]。已有研究表明，黑蒜、豆瓣酱、茶叶、木聚糖酶等发酵产品通过人为控制的变温发酵，产量和质量相较恒温发酵均有一定程度的提高[8-11]。
综上所述，通过在不同发酵阶段控制合适的温度，可以在符合微生物生长和代谢变化规律的同时，促进底物的降解和致香成分的生成，从而提升雪茄烟叶品质。因此，本研究通过探讨恒温发酵和变温发酵对雪茄烟叶发酵品质的影响，旨在明确雪茄烟叶适宜采用的组合发酵温度，从而为国产雪茄烟叶品质的提高和发酵技术规程的形成提供理论和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
德雪1号茄芯上部烟叶：四川中烟工业有限责任公司长城雪茄厂；QuEChERS萃取试剂盒：美国Agilent公司；标准品：美国Sigma-Aldrich公司；乙腈（色谱纯）：美国J.T.Baker公司。
1.2 仪器与设备
KBF720恒温恒湿培养箱：德国Binder公司；7890B-5977C气相色谱质谱（gaschromatograph-massspectrometer，GC-MS）联用仪：美国Agilent公司；EOFO-945066多管式旋涡混合器：美国Talboys公司；3-30KS高速冷冻离心机：德国Sigma公司；Milli-Q超纯水仪：美国Millipore公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
选取2020年四川德阳什邡德雪1号的茄芯上部烟叶作为研究对象。烟叶加水回潮使初始水分为30%，雪茄烟叶发酵温度梯度设置见表1，恒温发酵分为低温发酵（C1）、中温发酵（C2）和高温发酵（C3），发酵温度分别为35 ℃、40 ℃、45 ℃，发酵时间为30 d。变温组合发酵分为三个阶段，具体设置为V1-V6，每个阶段发酵10 d，共30 d。每个处理组设置三个平行。发酵结束后，以未发酵样品为对照（CK），进行感官评吸、常规化学成分和致香成分含量分析。
表1 雪茄烟叶发酵温度梯度设置
Table 1 Temperature gradient of cigar tobacco fermentation
续表
1.3.2 分析检测
（1）理化指标的测定
雪茄烟叶样品于45 ℃烘干粉碎，过孔径0.25 mm筛后，测定化学成分含量。依据烟草行业标准YC/T 159—2019《烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》测定总糖、还原糖含量；依据YC/T 468—2013《烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动（硫氰酸钾）法》测定总生物碱含量；依据YC/T 161—2002《烟草及烟草制品总氮的测定连续流动法》测定总氮含量。
（2）致香成分的测定
致香成分主要包括类胡萝卜素降解产物、美拉德反应产物、叶绿素降解产物和西柏烷类降解产物，致香成分含量的测定采用气相色谱质谱联用法[12]。
样品前处理：准确称取2 g左右样品于50 mL具盖离心管中，加入10 mL水，振荡直至样品被水充分浸润。静置10 min后，加入10 mL乙腈和50 μL乙酸苯乙酯内标（9.06 mg/mL），于漩涡混合振荡仪上以2 000 r/min振荡120 min。-20 ℃冷冻10 min后，加入4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠，立即于漩涡混合振荡仪上以2 000 r/min速度振荡2 min，防止无水硫酸镁结块。移取1 mL上清液于1.5 mL离心管中，加入150 mg无水硫酸镁，于漩涡混合振荡仪上以2 000 r/min 速度振荡2 min，以6 000 r/min 离心2 min，收集上清液于样品瓶中备用。
气相色谱条件：DB-5MS色谱柱（60m×1.0μm×0.25mm）；升温程序为初始温度60 ℃，然后以2 ℃/min升到250 ℃，然后以5 ℃/min升到290 ℃，进样口温度为290 ℃，分流比为10∶1，载气为氦气（He），流速为1.5 mL/min。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度为230 ℃，电子能量为70 eV，四极杆温度为150 ℃，质谱质量扫描范围为26～400 amu，监测模式为全扫描模式和选择离子扫描模式。
定性定量分析：通过将质谱与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）和Wiley数据库匹配进行化合物定性，采用内标法进行定量。
1.3.3 感官质量评价
将发酵后烟叶样品卷制成长度110 mm、直径14 mm的单料烟，在温度18 ℃、相对湿度65%的Binder恒温恒湿箱中养护1个月供评吸使用。感官质量评价由四川中烟工业有限责任公司长城雪茄厂组成的感官质量评吸专家组完成[13]。
1.3.4 数据处理
采用SPSS 22进行Turkey-LSD显著性差异分析和Z-score标准化。使用Excel 2017软件和GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析和图形处理。
2 结果与分析
2.1 恒温发酵对烟叶品质的影响
2.1.1 恒温发酵对常规理化指标的影响
本研究通过恒温发酵实验探索了发酵温度对雪茄烟叶品质的影响，结果见图1。由图1A可知，随着温度的升高，总糖、还原糖含量逐渐降低，这可能是由于温度升高促进了羰基化合物（还原糖类）和氨基化合物发生美拉德反应，从而导致总糖和还原糖含量降低[12]。总糖和还原糖的含量是烟叶吸食品质的重要指标，糖类化合物经过一系列化学反应能形成多种香气物质[14]。由图1B可知，总氮和生物碱含量也随温度的升高呈下降趋势，如高温发酵组（C3）的生物碱和总氮含量相较未发酵组（CK）分别降低了43.9%和6.9%。这可能是由于高温发酵有利于酶活作用降解蛋白质和生物碱为小分子的氨基酸、有机酸和挥发性的氨气等物质[15-16]。蛋白质在加热吸烟时会产生烧焦羽毛味，会直接影响烟叶的刺激性[17]，而生物碱含量过高不仅会影响人体的身体健康还会直接影响烟叶的苦味、涩味和刺激性[18]。综上，随着温度的升高，总糖、还原糖、总氮和生物碱含量逐渐降低，低温发酵有利于糖类化合物的积累，而高温发酵有利于蛋白质和生物碱的降解。
图1 不同温度恒温发酵对雪茄烟叶理化指标的影响
Fig.1 Effects of constant fermentation at different temperatures on physicochemical indexes of cigar tobacco
不同字母代表显著性差异（P＜0.05）。下同。
2.1.2 恒温发酵对致香成分含量的影响
不同温度恒温发酵对雪茄烟叶的致香成分总含量的影响见图2，致香成分的热图绘制结果见图3。由图2可知，致香成分总含量随温度的升高呈下降趋势，这三个组的致香成分总含量由高到低排序为C1＞C2＞C3。低温发酵组（C1）的致香成分总含量是高温发酵组（C3）的1.8倍。其中低温发酵组（C1）的致香成分总含量相较未发酵组（CK）升高了25.5%，这可能是由于低温发酵有利于微生物（如酵母菌）增长和代谢生成致香成分[19]。雪茄烟叶的致香成分主要包括叶绿素降解产物、类胡萝卜素降解产物、美拉德反应产物和西柏烷类降解产物[20]。据文献报道，这些降解产物能丰富烟叶的香味，并与烟叶的成熟度呈正相关[21-22]。
图2 不同温度发酵条件对雪茄烟叶的致香成分总含量的影响
Fig.2 Effects of different fermentation temperature on flavor component contents of cigar tobacco
图3 不同温度恒温发酵致香成分含量的热图
Fig.3 Heatmap of flavor components contents under different constant temperature fermentation
使用Z-score对每种化合物的含量进行标准化。颜色强度与致香成分含量成正比。
由图3可知，除美拉德反应产物（3-乙基-3,4-二氢-2（1H）-喹喔啉酮、四氢-6-壬基-2H-吡喃-2-酮、脱氢木龙内酯）随温度升高而增长外，绝大多数类胡萝卜素降解产物（如巨豆三烯酮、香叶基丙酮、β-甲基紫罗兰酮）、叶绿素降解产物（如新植二烯）和西柏烷类降解产物（如侧柏醇、西柏烯、异瑟模环烯醇）随温度升高而逐渐降低。结果表明低温发酵有利于致香成分的生成和积累，从而形成雪茄独特风味。比如，巨豆三烯酮具有类似坚果、木头的气味，香叶基丙酮和β-甲基紫罗兰酮可以增加果香、花香以及香气复杂性，而且这些物质已知具有雪茄发酵后的独特风味[23-24]。新植二烯作为烟叶中致香物质含量最高的成分，其含量的高低不仅直接影响烟叶的吃味和香气，而且还影响其他致香成分的形成[25]。综上，致香成分总含量随温度的升高逐渐降低，低温发酵有利于致香成分总含量的积累。
2.1.3 恒温发酵对感官评吸的影响
为了降低烟叶原料的刺激性和蛋白质气味，比较了不同发酵温度对雪茄烟叶吸食品质的影响，结果见表2。
表2 不同温度恒温发酵雪茄烟叶感官评吸结果
Table 2 Sensory evaluation results of cigar tobacco fermented with different constant temperature
由表2可知，德雪1号未发酵组（对照）以焦甜、豆香为主，辅以清甜、干草香，甜感明显，蛋白质气息明显，稍有刺激性，余味欠干净，浓度适中，燃烧性尚可。高温发酵组C3对杂气和刺激性具有显著的改善作用，但同时会导致烟叶的香韵丰富度和香气量降低。中温发酵组C2虽然有利于干净程度的提升和刺激性的降低，但香韵丰富度和主体香韵也会有所减弱。低温发酵组C1在保留主体香韵的同时，可显著提高香韵丰富度和成熟度，但对杂气和刺激性改善不明显。感官评吸结果与理化指标和致香成分含量检测结果基本一致。综上，随着温度的升高，刺激性和干净程度明显改善，但香韵丰富度和主体香韵逐渐减弱，低温发酵有利于提升香韵丰富度，而高温发酵有利于改善刺激性。
2.2 变温发酵对烟叶品质的影响
2.2.1 变温发酵对常规理化指标的影响
为了改善恒温发酵存在的不足，进一步探讨了不同温度梯度组合发酵对雪茄烟叶发酵品质的影响，结果见图4。由图4A可知，以恒温发酵效果最好的35 ℃发酵（C1）为对照，变温发酵（V1、V2、V5、V6）相比恒温35 ℃发酵条件下的总糖和还原糖含量有显著的提升，总糖含量从0.57%显著上升至0.71%～1.00%（P＜0.05），还原糖含量从0.25%上升至0.35%～0.63%。由图4B可知，变温发酵（V1～V6）相比恒温35 ℃发酵，生物碱和总氮含量有明显的下降，生物碱含量从5.00%下降至3.56%～4.05%，总氮含量从5.90%下降至4.62%～5.16%。其中，低-高-中（V2）组合的总氮和生物碱含量相较其他组最低，总糖和还原糖含量仅次于高-中-低（V5）组。这可能是由于前期采用低温发酵有利于微生物（如霉菌、芽孢杆菌等）增殖分泌酶活，中后期采用中高温发酵有利于酶活作用降解蛋白质、生物碱、淀粉等物质，从而导致烟叶发酵后的总氮、生物碱含量较低而糖类化合物较高[17]。综上，相比于恒温发酵，变温发酵可显著提高总糖、还原糖含量，降低总氮和生物碱含量，其中V2组总氮和生物碱含量最低，V5组总糖和还原糖含量最高。
图4 变温组合发酵对雪茄烟叶理化指标的影响
Fig.4 Effects of variable-temperature combined fermentation on physicochemical indexes of cigar tobacco
2.2.2 变温发酵对致香成分含量的影响
变温组合发酵条件下雪茄烟叶原料的致香成分总含量测定结果见图5，变温组合发酵条件下致香成分含量热图绘制结果见图6。由图5可知，变温发酵组的致香成分总含量由高到低排序为：V1＞V2＞V3＞V5＞V4＞V6。变温发酵V1组和V2组相比恒温35 ℃发酵（C1），致香成分总含量有明显的提高，从3.11 g/kg分别上升至3.79 g/kg和3.24 g/kg。采用低-中-高（V1）组合发酵后的致香成分总含量最高。其次，低-高-中（V2）组合发酵条件下，致香成分总含量也较高，仅次于V1组。V3～V6组的致香成分总含量显著低于V1和V2组（P＜0.05）。
图5 变温组合发酵条件对雪茄烟叶的致香成分总含量的影响
Fig.5 Effects of different variable temperature fermentation on flavor component contents of cigar tobacco
图6 不同变温组合发酵条件致香成分含量的热图
Fig.6 Heatmap of flavor components contents under different variable temperature fermentation
由图6可知，采用V1组合发酵后的类胡萝卜素降解产物（如二氢猕猴桃内酯、3-羟基-7,8-二氢-β-紫罗兰醇、氧化柠檬烯、7,8-环氧-α-紫罗兰酮、α-甲基紫罗兰醇、香叶基丙醇等）、西柏烷类降解产物（如异瑟模环烯醇）和叶绿素降解产物（如新植二烯）等致香成分含量相较其他组合发酵均有明显的提升。其次，V2组合发酵条件下的类胡萝卜素降解产物（如巨豆三烯酮、β-大马酮、香叶基香叶醇）等致香成分含量高于其它组。这可能是由于前期采用低温发酵有利于酵母、霉菌、芽孢杆菌等微生物生长，从而为中后期致香成分的生成提供了前提条件[26]。因此，变温发酵组（低-高-中和低-中-高）相比其他发酵组，可显著提高致香成分总含量。
2.2.3 变温发酵对感官评吸结果的影响
变温发酵雪茄烟叶的感官评吸测定结果见表3。由表3可知，变温发酵V1和V2组在保持原有主体香韵（焦甜、豆香）的前提下，香韵丰富度和香气量显著提高，回味感提升，成熟度和醇和度提升，干净程度和刺激性显著改善。变温发酵V3～V6组烟叶的刺激性和干净度虽略有改善，但香韵丰富度均有不同程度的减弱。综上，变温发酵组（低-高-中和低-中-高）可有效结合低温发酵和高温发酵的优点，在降低刺激性的同时显著提高香韵丰富度和香气量。
表3 不同温度组合发酵雪茄烟叶感官评吸结果
Table 3 Sensory evaluation results of cigar tobacco fermented with different combinations of temperature
2.3 讨论
本研究探讨了恒温发酵和变温发酵对雪茄烟叶发酵品质的影响，发现低温发酵可能有助于促进微生物（如酵母、霉菌和芽孢杆菌）生长代谢生成致香成分，从而改善香韵丰富度和成熟度，而高温发酵有助于酶活作用和杂气排除，对生物碱降解和刺激性改善具有明显的作用[27-28]。此外，变温组合发酵（低-高-中和低-中-高）相比恒温发酵可显著提高还原糖、总糖含量，降低生物碱含量，在提高香气丰富度和香气量的前提下，可显著改善刺激性和杂气。这可能是由于低-高-中和低-中-高三段式发酵更符合微生物的生长和代谢规律，发酵前期采用低温发酵（35 ℃）有利于微生物增长和代谢为后续酶活的分泌和致香成分的生成提供前提条件，发酵中后期采用中温（40 ℃）或高温发酵（45 ℃）有利于酶活作用降解蛋白质、淀粉、生物碱等生成小分子的糖类、挥发性含氮化合物，从而降低烟叶的刺激性和杂气，同时高温发酵可促进美拉德反应生成吡嗪、呋喃等致香成分[15，29]。
3 结论
本研究通过恒温发酵探索了不同发酵温度对雪茄烟叶理化指标、致香成分和感官品质的影响，发现低温发酵有利于糖类化合物和致香成分含量的积累，可显著改善香韵丰富度，而高温发酵有利于蛋白质和生物碱的降解，对刺激性具有明显改善作用。并通过分段控温发酵的方式明确了雪茄烟叶适宜采用的组合发酵温度，即低-高-中和低-中-高三段式发酵可有效弥补恒温发酵的不足，在降低生物碱含量和刺激性的同时，可显著提高致香成分含量和香韵丰富度。该研究结果将为国产雪茄烟叶品质的提高和发酵技术规程的形成提供理论和技术支撑。下一步将进一步对变温发酵条件下的酶活、微生物群落变化、生物量等进行深入分析，从而解析雪茄烟叶变温发酵提高品质的机理。
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